CN105671050A - 一种高效快速适配体筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效快速筛选适配体的方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本发明方法设计合理，采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。

Description

一种高效快速适配体筛选方法
技术领域
本发明属生物制药领域，具体涉及一种新型的高效快速适配体筛选方法。
背景技术
目前，恶性肿瘤已成为严重危害人类生命健康的常见疾病,并且发展为三大致死疾病之一，研究并开发治疗恶性肿瘤疾病的药物也成为当前首要任务。细胞毒类抗肿瘤药物是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但此类药物在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，也会对机体的正常细胞(尤其是代谢旺盛的细胞)产生影响，通常在药效剂量下就会导致病人出现不良反应,从而极大的限制了该类药物的进一步应用和发展。
抗体偶联药物作为大分子靶向治疗的代表药物，目前已成功应用于临床治疗不同类型的肿瘤疾病(例如CD30-MMAE和T-DM1)。但由于抗体偶联药物其价格昂贵且不稳定，其替代药物核酸适配体(Aptamer)的研发则成为未来的必然趋势。
核酸适配体(又称化学抗体)，具有精准的靶向性。核酸适配体能够快速而有效地分辨出靶分子结构上的细微差别，仅识别与其互补的空间结构，并与之结合，但其本身对肿瘤细胞不具备较强的杀伤力。另外，我国已发现近几百种具有抗肿瘤活性的海洋毒素，但由于其毒性反应过强而使药物开发中断。核酸适配体与海洋毒素偶联药物，即毒性药物与核酸适配体相连接组成靶向适配体偶联物，可以将药物“精确”地运送到靶细胞，既有效地提高了肿瘤局部的药物浓度，又可极大地降低体内其它组织、器官的毒性，从而达到真正靶向增效减毒的作用。
从随机DNA配基文库中，通过指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)技术筛选Aptamers是目前Aptamers的主要获得途径。但总结发现，目前已知的Cell-SELEX、Protein-SELEX、CE-SELEX等筛选方法，具有筛选周期较长、亲和性较差且失败率较高等缺点，十分不利于Aptamers的发展和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效快速筛选适配体的方法，通过以下步骤实现：将HEK-293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，以防细胞脱落)；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min。然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min。方法同上，直至阴性筛选六轮后，吸出待用。将HEK-293T细胞瞬转质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，防止细胞脱落)；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min。孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中。95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库。将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体。
本发明采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选。
洗涤缓冲液：4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，用DPBS溶解并定容至1L。
本发明采用所述适配体筛选方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，经过两轮的筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本发明的特点是在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。
附图说明
图1是筛选过程中每一轮文库流式细胞术亲和性评价结果。
图2是适配体S30与S28亲和性分析。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：靶向髓系分化抗原CD33核酸适配体的筛选
1、缓冲液的配置
洗涤缓冲液(4℃保存，有效期为30天)：
4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，用DPBS溶解并定容至1L。
结合缓冲液(4℃保存，有效期为30天)：
4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，100mgtRNA，1gBSA，用DPBS溶解并定容至1L。
2、细胞株的准备(购自中科院上海细胞库)
阴性细胞株：HEK-293T细胞
阳性细胞株：HEK-293T细胞瞬转CD3348h
3、ssDNA文库的准备
将4ODssDNA文库稀释至500μl结合缓冲液中，涡旋并于95℃加热5min后冰上骤冷并置于冰上待用。
4、阴性筛选(反筛)
待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，以防细胞脱落)；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min。然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min。方法同上，直至阴性筛选六轮后，吸出待用。
5、阳性筛选(正筛)
HEK-293T细胞瞬转CD33，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次(缓慢加入500μl洗涤培养基，轻轻摇晃并吸出，防止细胞脱落)；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min。孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中。95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库。
6、PCR扩增
PCR反应体系(μl)：两步扩增法500μl-800μl-1500μl
扩增步骤：将500μl模板5个循环扩增至800μl。取其中50μl再次扩增至100μl，每扩增3个循环取样跑核酸胶，选择最优循环数。将剩余DNA作为模板按照最优循环数扩增至1500μl体系。
PCR反应体系(μl)：
PCR反应条件(3stepRxn)
7、DNA纯化
收集汇总PCR反应液，对DNA进行纯化。DNA纯化方法同ssDNA的纯化。
8、测量ssDNA的浓度
9、ssDNA的制备
酶切后，纯化ssDNA，干燥用做下一轮筛选文库。
循环三轮后，将每一轮的文库利用PCR扩增的方法带上荧光标签，收集HL60细胞，用流式细胞术检测细胞筛选时，每轮筛选后所得的DNA配基的亲和性变化。其中，灰色代表ssDNA原始文库，蓝色、红色和绿色曲线分别代表第一、二、三轮筛选后的DNA配基。结果显示，与原始文库相比，第一轮筛选后得到的DNA配基已经有了较好的亲和性，且第二轮筛选后得到的DNA配基的亲和性进一步提高，而第三轮筛选后所得的DNA配基的亲和性不再提高(如图1)。因此，选取第二轮作为筛选结束。通过高通量测序的方法，获得第二轮筛选文库中的适配体序列，并按照稳定性从中挑选出S30与S28，利用流式细胞术对其亲和性进行了分析，流式细胞术结果表明两条适配体均具有较好的亲和性(如图2)。
结果表明，经过两轮的筛选后，ssDNA文库的亲和性较第一轮有了较大的提高，并且将第二轮筛选文库测序所得的序列也具有较好的特异性和亲和性，表明该方法能够快速有效地获得具有较好特异性和亲和性的核酸适配体。所述核酸适配体的序列如SEQNO.1-5所示：
1、TACCAGTGCGATGCTCAGCACGCTTATAGGGGCTGGACAAAATTCTACCCAGCCTTTTCTGACGCATTCGGTTGAC。
2、TACCAGTGCGATGCTCAGGCTCCATCAACCGGTCGAAAGTTCGAGCGCCTTTAAAGTACTGACGCATTCGGTTGAC。
3、TACCAGTGCGATGCTCAGGATGCTCCGCAGGAGTCCGACCTGCCCGCAGCCTTCGAACCTGACGCATTCGGTTGAC。
4、TACCAGTGCGATGCTCAGCCACACTGGCATGGAACGGGACTCAAGAGAAAGGCTCTGCCTGACGCATTCGGTTGAC。
5、TACCAGTGCGATGCTCAGGTCAATGGAGGGATTGCGAACCTCTGTGGCGTTTTCTCTGCTGACGCATTCGGTTGAC。

Claims (3)

1.一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将HEK-293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中HEK-293T细胞生长至90％，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min，然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min，重复以上方法，直至阴性筛选六轮后，吸出待用；将HEK-293T细胞瞬转质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min，孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中，95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库，将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，洗涤缓冲液由4.5gGlucose，1nMMgCl25ml，用DPBS溶解并定容至1L。
3.根据权利要求1所述的一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选。
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