CN105664180A - 一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医疗制剂领域，更具体的涉及一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液及其制备方法和用途；一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，其特征在于，包括由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中。与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：本发明制备出的纳米杂化物分散液有望应用于胃肠癌转移淋巴结评估，并可通过葡聚糖的功能衍生，偶联抗肿瘤药物，达到诊疗一体化的目的。
Description
技术领域
本发明涉及医疗制剂领域，更具体的涉及一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液及其制备方法和用途。
背景技术
胃肠癌是当前世界范围内致死率最高的肿瘤之一，而淋巴结转移是胃肠癌主要的转移方式，其转移情况的评估是决定手术方式，精确病理分期，制定辅助治疗方案的最主要依据。特别是术前及术中对区域淋巴结转移情况的评估判断是为患者制定个体化手术方式，达到肿瘤精准手术切除的必要条件。目前临床术前评估胃肠癌区域淋巴结转移情况主要是依靠B超、CT、磁共振以及氟-18-氟化去氧葡萄糖正电子断层摄影（FDG-PET）等影像学检查手段，但其诊断结果并不能准确判定淋巴结是否转移，只能对区域淋巴结的清扫范围提供一定的指导依据，可能导致转移淋巴结的清扫不彻底或者对无转移淋巴结的过度清扫。
为解决此问题，外科医生一直在尝试在术中运用染料、核素、光敏剂、纳米颗粒等淋巴结示踪剂寻找前哨淋巴结并对其进行病理检测，依靠前哨淋巴结的转移情况预测区域淋巴结的转移情况。纳米颗粒如纳米炭等，是目前临床上使用最为广泛的淋巴结示踪剂之一。其原理是通过物理方式将纳米炭颗粒聚集为直径均为150nm左右的纳米簇，经过局部注射后，因其颗粒大小限制注射到肿瘤局部组织后不进入血管，而迅速进入淋巴管，滞留聚集到淋巴结，使淋巴结染成黑色，实现了肿瘤区域引流淋巴结的活体染色，达到示踪淋巴结的目的，并提示肿瘤转移的可能途径，指导术中淋巴清扫范围。但纳米炭淋巴示踪剂虽然具有高度的淋巴靶向性，但却不具备肿瘤特异性，但和其他临床使用的淋巴结示踪及一样，无法特异性的识别有肿瘤转移的淋巴结，更多的时候只能用于提高淋巴结检出率及缩短检出时间，临床作用有限。此外，由于对活性炭的认识及条件所限,纳米炭在临床的应用并不广泛。与此同时纳米炭独特的吸附作用以及生物惰性使其在注射到体内后很长时间内均无法代谢，目前尚不知是否对人体有害。
发明内容
本发明为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷（不足），提供一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，并进一步提供一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液制备方法和用途。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，其特征在于，包括由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中。
进一步的，作为优选技术方案，所述纳米氧化铁杂化物的直径为100-180nm之间。
进一步的，作为优选技术方案，所述纳米氧化铁杂化物由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与铁盐通过共沉淀法制得。
进一步的，本发明还提供一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的用途，所述用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行淋巴结染色示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤组织周围局部注射使用。
进一步的，本发明还提供一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A.取葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与三价铁盐溶于水中，将溶液冷却至0℃左右，低温下混合均匀待用；
B.取二价铁盐溶于水中，转移至惰性气体氛围保护的容器中与步骤A的溶液在低温下混合均匀，用酸调节pH至3-5，然后加入氨水溶液至溶液变为墨绿色，在0-4摄氏度惰性气体氛围下充分反应0.5-4h；
C.调节步骤B中溶液pH至8-12，升高温度至60-100摄氏度，惰性气体氛围下搅拌并继续反应1-6h，搅拌速率为500-20000rpm；
D.反应结束后，待溶液冷至室温，透析除去未反应的葡聚糖与氨水，超声分散，然后水系过滤膜过滤；
E.最后，超滤浓缩得到纳米杂化物分散液，或者冻干后重新溶解得到纳米杂化物分散液。
进一步的，作为优选技术方案，所述葡聚糖分子量为5-500KDa。
进一步的，作为优选技术方案，所述葡聚糖分子量为10~100KDa。
进一步的，作为优选技术方案，所述葡聚糖分子量为30~50KDa。
进一步的，作为优选技术方案，二价铁盐与三价铁盐的化学计量摩尔比为1:1-2.5。
进一步的，作为优选技术方案，所述氨水溶液为一水合氨溶液，一水合氨溶液中氨的质量百分比浓度为15-28%。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
（1）本发明采用葡聚糖及其衍生物修饰，多糖上具有丰富的官能团，可与其他药物，核素，染料等分子反应，进行功能化衍生。
（2）本发明直接用葡聚糖及其衍生物修饰纳米氧化铁制备纳米杂化物分散液，实验简单，省去了一系列繁琐操作，同时利用多糖上的羟基，分散稳定纳米杂化物分散液，提高其水溶性。
（3）本发明制备出的纳米杂化物分散液可用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行淋巴结染色示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤组织周围局部注射即可。
（4）本发明制备出的纳米杂化物分散液有望应用于胃肠癌转移淋巴结评估，并可通过葡聚糖的功能衍生，偶联抗肿瘤药物，达到诊疗一体化的目的。
附图说明
图1为纳米杂化物分散液的电镜图片及分散液照片。
图2为纳米杂化物分散液的粒径分布（动态光散射法测定）。
图3-图7分别为局部注射纳米杂化物分散液12h、24h、48h、4天、1周后区域淋巴结示踪情况。
图8-图11分别为纳米杂化物分散液局部注射4天、1周、2周、1月后在脑、心脏、肾脏、肝脏代谢情况。
图12-图15分别为纳米炭混悬液（左）和纳米杂化物分散液（右）局部注射4天、1周、2周、1月后胃壁的药物残留量情况。
附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的；相同或相似的标号对应相同或相似的部件；附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，包括由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中；所述纳米氧化铁杂化物的直径为100-180nm之间；所述纳米氧化铁杂化物由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与铁盐通过共沉淀法制得。
实施例2
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的用途，本实施例采用实施例1所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，所述用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行淋巴结染色示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤组织周围局部注射使用。
实施例3
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，包含以下步骤：
A.称取5.0g的葡聚糖（分子量10KDa）与0.64gFeCl3溶于纯水中，将溶液冷却至0℃左右，低温下搅拌均匀待用;
B.称取一定0.26g的FeSO4溶于水中，转移至氮气氛围保护的三口瓶中与步骤A的溶液在低温下搅拌混合均匀，用盐酸调节pH至4左右，而后逐滴加入一水合氨溶液0.8mL至溶液变为墨绿色，在零摄氏度氮气氛围下充分反应1h；
C.加入质量分数为25%氨水溶液调节步骤B中溶液pH至11，升高温度至80摄氏度，氮气氛围下继续搅拌反应2h，控制搅拌速率10000rpm；
D.反应结束后，待溶液冷至室温，用截流分子量为50000的透析袋透析除去未反应的葡聚糖与氨水，超声分散10min（频率为30kHz），220nm水系过滤膜过滤；
E.超滤浓缩得到纳米杂化物分散液10mL，如图1右所示；
将步骤E的分散液稀释制备1mg/mL的纳米杂化物分散液，取10μL滴于200目表面涂有碳膜的铜网上，1min后，用滤纸吸干多余液体，晾干后利用JEM100CX透射式电子显微镜（日本电子公司，日本）进行观察，分别放大倍数为25K和100K，电镜照片如图1左和图1中所示。
实施例4
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，包含以下步骤：
A.称取4.5g的葡聚糖（平均分子量25KDa）与0.30gFeCl3·6H2O溶于纯水中，用220nm水系过滤膜过滤，将溶液冷却至0℃左右，低温下磁力搅拌均匀待用;
B.称取0.12g的FeCl2溶于水中，用220nm水系过滤膜过滤，转移至氩气氛围保护的双颈瓶中并与步骤A的溶液在4℃下机械搅拌（2000rpm）混合均匀，而后逐滴加入一水合氨溶液0.45mL，在4℃氩气氛围下充分反应0.5h;
C.加入质量分数为28%氨水溶液调节步骤B中溶液pH至10，升高温度至85摄氏度，氩气氛围下继续反应1.5h，机械搅拌（12000rpm）使之混匀;
D.反应结束后，待溶液冷至室温，用截流分子量为50000的透析袋透析除去未反应的葡聚糖与氨水，超色分散20min（频率为25kHz），220nm水系过滤膜过滤;
E.冻干后重新溶解，配置浓度为1mg/mL的纳米杂化物分散液。
取上述分散液3mL,利用BI-200SM型光散射仪（BrookhavenInstruments，USA）对其粒径及粒径分布进行表征，激发光源波长为532nm，散射角为90度。所有测试均在25°C下进行，并重复五次。得到粒径分布图，如图2所示，平均粒径为150nm左右。
实施例5
一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，包含以下步骤：
A.称取3.5g的葡聚糖（分子量10KDa）与0.45gFeCl3溶于纯水中，用220nm水系过滤膜过滤，将溶液冷却至0℃左右，低温下搅拌均匀待用;
B.称取0.20g的FeCl2·4H2O溶于水中，转移至氮气氛围保护的三口瓶中与步骤A的溶液在低温下机械搅拌（5000rpm）混合均匀，逐滴加入一水合氨溶液0.65mL至溶液变为墨绿色，在此过程中不断机械搅拌（15000rpm）使其充分混合，在零摄氏度氮气氛围下充分反应1.5h;
C.加入质量分数为25%氨水溶液调节步骤B中溶液pH至11，升高温度至90摄氏度，氮气氛围下继续反应2h，控制搅拌速率不变（15000rpm）;
D.反应结束后，待溶液冷至室温，用截流分子量为50000的透析袋透析除去未反应的葡聚糖与氨水，超声分散20min（频率为50kHz），220nm水系过滤膜过滤；
E.超滤浓缩得到纳米杂化物分散液30mL。
最后，可将步骤E的分散液，纳米碳混悬注射液和1％~5%戊巴比妥钠溶液，通过220nm过滤器过滤除菌，消毒玻璃瓶避光、密封4℃冰箱保存备用。
实验结果：
对上述纳米杂化物分散液进行药效学研究（大鼠淋巴结的示踪），具体如下：
动物：成年雌性SD（Sprague-DaWley）大鼠（6～7周龄、体重150-200g），购自南方医科大学实验动物中心。
药品：
1、纳米杂化物分散液（50-80mg/mL）
2、纳米炭混悬注射液（50mg/mL）
【商品名/商标】卡纳琳
【生产厂家】重庆莱美药业股份有限公司
【批准文号】国药准字H20041829
方法：
将雌性SD（Sprague-DaWley）大鼠（6～7周龄、体重150-200g）常规鼠类全价饲料喂养。自由饮水，饲养房温度为21±20℃，湿度30%~50%，光照时间平均每天12~24小时。将大鼠饲养1周后，分为纳米杂化物分散液组、纳米碳混悬注射液组，每组5~10只。大鼠术前禁食禁水12~24h，抽取1%戊巴比妥钠注射液注射于大鼠腹腔进行麻醉，固定大鼠前后肢于无菌操作台上，常规消毒，取正中切口约3~10cm切开入腹，暴露胃壁；抽取纳米杂化物分散液组、纳米碳混悬注射液注入大鼠胃壁浆膜下，每只注射5个点，每点约0.05mL；4-0丝线间断缝合大鼠腹壁全层，术后恢复正常饮食，放入笼中观察。
在术后不同时间点抽取1%戊巴比妥钠注射液注射药物诱导后的大鼠，麻醉后固定大鼠前后肢于无菌操作台上，剪开腹壁缝合线；观察大鼠腹腔内有无胃内容物，有无炎性渗出等腹膜炎表现，有无大鼠网膜与腹壁切口粘连等病理表现，肠系膜根部腹膜后淋巴结黑染情况；抽取下腔静脉血5mL，于4℃冰箱静止2h后用3000r/min离心10min，取上层血清2mL入离心管，生化检验测其肝肾功能（TBIL、IBIL、DBIL、AST、ALT、BUN、Cr）；提取大鼠肝、肾、胃、淋巴结、心、脑等组织标本，10%中性缓冲福尔马林液固定，病理分析检验离体脏器中是否含有纳米杂化物和纳米碳。
结果：
术后12h区域淋巴结示踪逐渐出现（图3），48h内保持良好的区域淋巴结示踪效果（图5），4天后染色淋巴结逐渐褪色（图6）,1周后仍可观察到示踪效果（图7），且纳米杂化物分散液具有高度的淋巴靶向性；
术后1月内纳米杂化物分散液组在脑、心脏、肾脏、肝脏未见代谢痕迹（图8-图11），说明纳米杂化物分散液不会通过血脑屏障，不进入血液循环经肝肾代谢；
观察术后1月内的大鼠腹腔内无胃内容物，无炎性渗出等腹膜炎表现，无网膜与腹壁切口粘连等病理表现，说明两组局部注射安全性好（图12-图15）；但局部注射点的纳米炭仍大量残留，而纳米杂化物分散液的局部注射点残留量减少，说明纳米杂化物分散液组的代谢速度较快，不会长时间滞留于体内。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，其特征在于，包括由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中。
2.根据权利要求1所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，其特征在于，所述纳米氧化铁杂化物的直径为100-180nm之间。
3.根据权利要求1或2所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液，其特征在于，所述纳米氧化铁杂化物由葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与铁盐通过共沉淀法制得。
4.权利要求1-3任一项所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的用途，其特征在于，所述用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行淋巴结染色示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌实体恶性肿瘤组织周围局部注射使用。
5.一种用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
A.取葡聚糖和/或葡聚糖衍生物与三价铁盐溶于水中，将溶液冷却至0℃左右，低温下混合均匀待用；
B.取二价铁盐溶于水中，转移至惰性气体氛围保护的容器中与步骤A的溶液在低温下混合均匀，用酸调节pH至3-5，然后加入氨水溶液至溶液变为墨绿色，在0-4摄氏度惰性气体氛围下充分反应0.5-4h；
C.调节步骤B中溶液pH至8-12，升高温度至60-100摄氏度，惰性气体氛围下搅拌并继续反应1-6h，搅拌速率为500-20000rpm；
D.反应结束后，待溶液冷至室温，透析除去未反应的葡聚糖与氨水，超声分散，然后水系过滤膜过滤；
E.最后，超滤浓缩得到纳米杂化物分散液，或者冻干后重新溶解得到纳米杂化物分散液。
6.根据权利要求5所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖分子量为5-500Kda。
7.根据权利要求5所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖分子量为10~100KDa。
8.根据权利要求5所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，所述葡聚糖分子量为30~50KDa。
9.根据权利要求5所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，二价铁盐与三价铁盐的化学计量摩尔比为1:1-2.5。
10.根据权利要求5所述的用于淋巴示踪的纳米杂化物分散液的制备方法，其特征在于，所述氨水溶液为一水合氨溶液，一水合氨溶液中氨的质量百分比浓度为15-28%。
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