CN105658798A - 具有降低的木聚糖含量的转基因树 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量的转基因树的方法，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，从而改善所述转基因树的生长特性、机械特性和/或糖化特性。

Description

具有降低的木聚糖含量的转基因树
技术领域
本发明涉及改善树特性的领域。具体地，本发明涉及下调木聚糖生物合成机构中的糖基转移酶43基因，同时增强生长特性、改善糖化特性和机械特性的方法。本发明还涉及所使用的表达载体、转基因树和木材。这样的树和木材可用于植树造林和生物能源用途。
背景技术
作为可再生生物燃料的丰富原材料，木材是优良的能源。高等植物的细胞壁包含多糖，例如纤维素、半纤维素、果胶和多酚化合物如木质素(lignin)。所有这些细胞壁组分构成木素纤维素生物质(lignocellulosic)，其为能量的丰富来源。
木聚糖是硬木(hardwood)中的主要半纤维素，构成木质生物质的约20％。对于一个物种，硬木中木聚糖主链的长度通常在窄长度范围内，但是可以根据分离工艺变化。残基的数目在50和250之间变化。据推测，硬木中木聚糖的长度被严格控制。
木聚糖由大量糖基转移酶(GT)在高尔基体中合成并且在小泡内转运至质膜，在那里它们被整合到细胞壁中并与其他壁组分交联。在杨属(Populus)中，糖基转移酶属于基因家族GT8、GT43和GT47。它们是木聚糖主链的起始、延伸和终止所需的。
自从在拟南芥属(Arabidopsis)中发现参与木聚糖生物合成的第一个基因以来，木聚糖的生物合成便成为深入研究的领域。
毛果杨(Populustrichocarpa)GT43组包括被称作GT43A至GT43G的7种基因。核酸序列示为SEQIDNO：1至7；并且相应的氨基酸序列示为SEQIDNO：8至14。对毛果杨、拟南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)的比较性序列分析表明GT43基因形成三个不同的进化枝，它们在三个相异的属中是保守的，见图1。拟南芥核酸序列在序列表中示为：SEQIDNO：15(AtlRX9，进化枝I)、SEQIDNO：16(AtlRX9-L，进化枝II)、SEQIDNO：17(AtlRX14，进化枝III)和SEQIDNO：18(AtlRX14-L，进化枝III)。相应的氨基酸序列分别示为SEQIDNO：19至22。
低等维管植物和云杉仅有进化枝II和进化枝III两个进化枝。
研究已显示，进化枝I或II的成员以及进化枝III的成员为木聚糖木糖基转移酶活性所需。这被最近的研究(Lee等(2012)PlantSignaling&Behavior7：1-6)所支持，其表明两种杨树糖基转移酶PtrGT43B和PtrGT43C参与木聚糖生物合成。他们的发现表明，在木聚糖主链生物合成期间，杨属GT43成员协同作用以催化木糖基残基的连续转移。这进一步支持以下假说：GT43基因家族成员的生化功能在维管植物中是进化保守的。
已经发现杨属GT43成员参与木聚糖主链的延伸。GT43A和GT43B在木材形成期间被高度表达，特别是在正在进行次生细胞壁增厚的细胞中表达。
已经通过RNAi降低了转基因的杨属中杨属GT43B基因的表达(Lee等(2011)Mol.Plant4：730-747)。这种降低的表达导致这些杨属转录物降低至WT水平的2％-15％。结果，形成在纤维和脉管中具有薄细胞壁和不规则木质部表型(萎缩的脉管)的异常木质部。
此外，这些株系(line)中木糖含量降低至WT木糖含量的50％至80％。S-木质素和G-木质素的含量也降低。
戊糖(如木聚糖)被视为差的发酵底物，因此木聚糖含量的降低在发酵应用中是有益的。然而，具有降低的木聚糖含量的植物矮小，和/或产生具有萎缩的和薄的细胞壁的木质部。这样的植物也是瘦弱的并且具有脆弱的茎。
当通过RNAi降低GT43B基因的表达时，木质素含量降低(Lee等(2011)Mol.Plant4：730-747)。当对相同量的纤维素进行酶消化时，GT43BRNAi、GT47CRNAi株系中纤维素的可消化性与WT相比提高。没有提供关于每干重木素纤维素的之糖化产量的信息。具有木聚糖缺陷的一些杨树株系瘦弱并且具有脆弱的茎(Li等(2011)TreePhysiol.31：226-236)。这些树的生长在GT47C抑制的情况下不受影响，这在其他转基因株系的情况下未见报道。
WOs2012/103555描述了通过反义下调拟南芥属中的IRX9基因导致降低的木聚糖含量以及降低的生长特性和降低的机械特性。
US2012/0185975公开了来自拟南芥属糖基转移酶基因的分离启动子。据论述，其可以用于植物、植物部分或植物细胞以用于胁迫处理。
木聚糖含量的降低将导致木材中纤维素的比例增加。已知与源自纤维素的糖相比，源自木聚糖的糖被视为差的发酵底物，因此木聚糖含量的降低将是有益的。基于以上论述，关于具有降低的木聚糖含量的树的问题是：其是矮小的，和/或产生具有萎缩的和/或薄的细胞壁的木质部。这样的树也是瘦弱的并且具有脆弱的茎。
因此需要产生具有增强的生长以及保持的或改善的机械特性的转基因树的方法和工具。此外，需要更好的糖化特性。这种转基因树构成了用于一般用途的植树造林和用于特别用途的生物能源作物的有价值原料。
发明内容
第一方面，本发明提供了用于产生转基因树的方法，所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，其中所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有增强的生长特性和改善的机械特性和/或糖化特性。
在一个实施方案中，根据此方面的方法包括以下步骤：
(a)将表达载体导入树细胞，所述表达载体包含：
(i)至少一个启动子；
(ii)有效连接在所述启动子下游的第一核苷酸序列，其包含来自GT43家族的一种或更多种基因；和
(iii)有效连接在所述第一核苷酸序列下游的与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列；
其中所述连接的核苷酸序列在细胞中被转录成RNA，从而产生发夹RNA，所述发夹RNA在细胞中被加工成为能够降低来自GT43家族的一种或更多种基因的表达的干扰RNA分子；以及
(b)将步骤(a)的所述树细胞培养成转基因树，并且无性繁殖所述转基因树以获得转基因树株系。
从获得的大量株系、优选地不少于20个株系中选择特别在发育中木材(developingwood)中GT43基因表达降低的转基因树株系。
在一个优选的实施方案中，所述启动子为木材特异性启动子，其在次生壁生物合成期间上调。
在另一个优选的实施方案中，所述木材特异性启动子选自GT43启动子；次生壁CesA启动子；RWA启动子，尤其是与拟南芥属RWA1、RWA3或RWA4启动子同源的启动子；与拟南芥属IRX10启动子同源的启动子；GUX1或GUX2启动子；AtFRA8、AtIRX8/或AtPARVUS启动子；AtXyn1启动子；AtTBL29启动子。本领域内已知这些启动子主要在维管组织中表达并且参与次生壁形成，并且易于使用来自木材发育的数据来追踪其表达模式。
在另一个优选的实施方案中，所述木材特异性启动子为包含SEQIDNO：25所示之核苷酸序列的GT43B启动子，或者包含SEQIDNO：23所示之核苷酸序列的GT43B来源的木材特异性(wood-specific，WP)启动子。GT43B启动子与WP启动子间的差异在于起始密码子上游24个核苷酸的缺失。
根据另一个实施方案，其中在所述转基因树的发育中木材中，由所述来自GT43家族的一种或更多种基因转录的mRNA的水平为相同物种的野生型树中所转录的mRNA的相应水平的25％至85％。
优选地，在所述转基因树的发育中木材中，由所述来自GT43家族的一种或更多种基因(优选地GT43A或GT43B或GT43C)转录的mRNA的水平降低但未消失。所述mRNA水平优选地为相同物种的野生型树中所转录的mRNA的相应水平的25％至85％、35％至75％、30％至60％，或者更优选地为50％至60％。可通过使用木材特异性启动子(即，主要在维管组织中表达的启动子)来实现目标抑制水平以发育中木材组织。所述降低的表达优选地通过本领域内公知的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)过程来实现。
所述来自GT43家族的一种或更多种基因优选地选自：
(a)由以下组成的毛果杨(Populustrichocarpa)基因的组：
GT43A(SEQIDNO：1)，
GT43B(SEQIDNO：2)，
GT43C(SEQIDNO：3)，
GT43D(SEQIDNO：4)，
GT43E(SEQIDNO：5)，
GT43F(SEQIDNO：6)，
GT43G(SEQIDNO：7)；
(b)与(a)中的毛果杨基因直系同源并且与(a)中的基因具有至少80％序列同一性的基因。
(b)中的所述直系同源基因优选地来自选自桉属(Eucalyptus)、金合欢属(Acacia)或柳属(Salix)的物种。
所述桉属基因选自：
GT43A(SEQIDNO：31)，
GT43B(SEQIDNO：32)，
GT43C(SEQIDNO：33)，
GT43D(SEQIDNO：34)，
GT43E(SEQIDNO：35)，
GT43F(SEQIDNO：36)，
GT43G(SEQIDNO：37)。
优选地，所述来自GT43家族的一种或更多种基因选自GT43B(SEQIDNO：2)、GT43C(SEQIDNO：3)和GT43E(SEQIDNO：5)。更优选地，所述基因选自GT43B(SEQIDNO：2)和GT43C(SEQIDNO：3)。甚至更优选地，根据本发明的方法包括降低GT43B和GT43C二者的表达，或者降低GT43B、GT43C和GT43E三种GT43基因的表达。
如上所述，本发明的方法的一个实施方案涉及具有增强的生长的转基因树的产生。在本文中，术语“增强的生长”意指选自增加的高度、增加的茎直径、增加的茎体积、增加的节间长度和增加的叶片数目的一个或更多个特征。
此外，本发明的方法的一个实施方案涉及具有改善的机械特性的转基因树的产生。在本文中，术语“改善的机械性能”意指增加的弹性模量(modulusofelasticity，MOE)和/或增加的抗弯强度(bendingstrength，BS)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了转基因树的产生，与来自相同物种的野生型树的木材相比，由来自所述转基因树的水解木材的单糖产量增加。所述单糖优选地选自阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。
本发明的第二方面涉及可通过如在上述第一方面中公开的方法获得的转基因树。所述转基因树优选地为选自杨属、桉属、金合欢属或柳属的属。此外，本发明涉及包含本发明的第四方面的表达盒(或载体)的转基因树。
第三方面，本发明还涉及可由根据本发明的第二方面的转基因树获得的木材。
在所述转基因树的木材中，当与来自相同物种的野生型树的木材相比时，来自GT43的一种或更多种基因的mRNA的水平降低。特别地，所述mRNA的水平降低但未消失。优选地，当与相同物种的野生型树相比时，mRNA的水平降低至mRNA的25％至85％，更优选地30％至60％。
本发明的第四方面涉及包含以下的表达载体：
(i)在发育中木材中具有活性的木材特异性启动子；
(ii)至少一个基因或具有至少18个核苷酸的基因部分，任选地选自糖基转移酶43(GT43)基因家族。
在此方面的一个实施方案中，本发明涉及表达载体，其包含：
(i)至少一个启动子；
(ii)包含来自GT43家族的一种或更多种基因的第一核苷酸序列；以及
(iii)与第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列。
其中所述核苷酸序列能够在树细胞中被转录成发夹RNA结构，所述发夹RNA结构在所述细胞中被加工成为能够降低GT43基因的表达的干扰RNA分子。
如上所述，所述启动子为主要在发育木质部中表达的启动子，例如GT43B启动子。所述表达载体还可以包含选自转录因子(transcriptorfactor)结合位点、剪接位点和终止位点的一种或更多种调控元件。
所述来自GT43家族的一种或更多种基因优选地选自GT43B(SEQIDNO：2)和GT43C(SEQIDNO：3)。在一个优选的实施方案中，所述第一核苷酸序列包含来自GT43家族的两种或三种基因。优选地所述两种或三种基因包括GT43B(SEQIDNO：2)和GT43C(SEQIDNO：3)二者。
所述来自GT43家族的一种或更多种基因可优选地选自GT43B和GT43C二者，或者GT43B、GT43C和GT43E三种基因。
另一方面，本发明包括根据前述任一方面用于产生转基因树的方法，相对于来自相同物种的野生型树的木材，由来自所述转基因树的水解木材的单糖的产量提高。所述单糖优选地选自阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。
本发明的另一个方面涉及本发明的表达载体用于提高基因的表达或下调基因的用途，所述基因优选地为选自糖基转移酶43(GT43)基因家族的基因。
另一方面，本发明提供了用于由木材产生单糖的方法。所述方法包括：(a)提供来自如上所述的转基因树的木材；(b)降解所述木材；以及(c)获得游离单糖。在酸性条件下，在预处理或未预处理的情况下通过酶来降解所述木材。在预处理的情况下，可以使用多种酸和酸浓度以多种方式创造酸性条件，例如，在一个优选的实施方案中，酸性条件可以通过以1％(重量/重量)的浓度添加硫酸来创造。此外，本文中的酸性条件还旨在涵盖不添加外部酸的预处理方法。可以使用升高温度作为预处理以获得酸性条件。例如，由于预处理期间形成酸，在酸性条件下进行蒸汽爆炸(steamexplosion)而无需添加酸。
在另一方面中，本发明涉及用于使用从根据本发明的木材获得的单糖作为微生物发酵过程底物的方法，和通过这一方法获得的产物。这些过程的产物可以是生物燃料、其他化学物质和生物聚合物。
附图说明
图1：示出在毛果杨(Pt)、拟南芥(At)和水稻(Os)中GT43家族成员分为三个进化枝(I-III)的系统发生树。
图2：由组成型CaMV35S(35S)启动子和木材特异性(WP)启动子驱动的靶向单独的GT43基因和多个GT43基因的RNAi构建体的图。
图3：RNAi构建体对在温室中生长的影响。不同的RNAi构建体(B、C、BE、BC和BCE)由35S启动子或WP启动子驱动，并且各组合由三个独立的线条表示。相对于WT的显著效果用星号＊(P≤5％，TukeyHSD检验)表示。交叉线表示启动子之间的显著差异：图3A野生型的高度(以百分数计)、图3B野生型的叶片数目(以百分数计)、图3C野生型的节间长度(以百分数计)、图3D野生型的直径(以百分数计)、图3E野生型的体积(以百分数计)。
图4：未经酸预处理的实验中的糖产量。该图示出酶水解后单糖的产量。
图5：经酸预处理的白杨(aspen)实验中的糖产量。该图示出酶水解后的单糖产量与预处理液体中单糖产量相组合。
图6：包含GT43B启动子驱动的RNAi构建体GT43BC的转基因杂种(hybrid)白杨的植物生长。A：植物高度、茎直径和茎体积。B：节间数量和节间长度。C：叶片长度和宽度。A至C的数据为平均值±SE，n＝5次生物重复。星号表示与WT有显著差异的值(学生t检验，α＝0.05)。
图7：包含GT43RNAi构建体的转基因杂种白杨木中GT43基因的表达水平。与野生型的相对表达(Y轴)。
图8：转录物谱(Transcriptprofiling)：具有降低的GT43表达水平的转基因杂种白杨木中木聚糖生物合成基因的表达。涉及木聚糖主链、葡糖醛酸装饰物(decoration)和还原末端寡糖的基因的表达及木聚糖乙酰化基因的表达。示出在单个株系(BC1和BC2)中和两个株系中，相对于WT表达，分组的基因表达的倍数变化。在柱旁示出了平均p值(padj)。星号表示p值低于0.1。
定义
在两种核酸的背景下的短语“序列同一性”可指，当进行最大对应的比较和比对时，如使用序列比较算法或者通过目测来测量的，具有至少约60％、65％、70％、75％，优选地80％或85％，更优选地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的两个或更多个序列或者子序列。同一性可单独指一个、两个或一组基因，并且不指代本发明中的其他基因，例如一个基因可以以75％同源于目的基因，而另一个基因可以以60％同源于目的基因，再一个基因可以以93％同源于目的基因。在某些方面，跨至少150个核酸残基的核酸序列区域基本相同，例如跨至少约200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800个，如至少约900核苷酸，或者如至少约1kb、2kb或如至少约3kb的核酸序列区域基本相同。在一些方面中，跨对应编码区的整个长度的核酸序列是相同的。
术语“降低的木聚糖含量”指可以从木材中提取的木聚糖的量，其也可以与木聚糖链的长度相关。
术语“木材特异性启动子”为主要在维管组织中表达的启动子。
基因的表达是mRNA被翻译成蛋白质或酶时的过程，基因表达可以在从转录起始至RNA加工以的不同水平进行调节。通过降低表达预期通过蛋白质或酶的刺激会降低。在本文中，术语“降低表达”指减少从基因转录得到的RNA，其在大多数情况下产生更少量的mRNA。这可以是mRNA的稳态水平。
具体实施方式
在木材形成的研究中，通过RNAi遗传学方法降低GT43家族中所有基因或者的来自相同家族的这些基因的两个或三个进化枝的组合的表达，制备了一系列转基因杂种白杨。然后出乎意料地发现，与先前所见不同，这些转基因树具有增强的生长，并且如在三点弯曲实验中的弹性模量(MOE)和抗弯强度(BS)中所看到的，所述木材具有改善的机械特性。
在来自这些转基因杂种白杨的木材的木素纤维素的进一步检测中，出乎意料地发现这些树的木素纤维素在未经预处理的检测中表现出更好的糖化特性。
组织特异性启动子的鉴定
在大多数情况下，高水平的转基因组织特异性表达是在该组织的发育的新陈代谢中诱导期望改变的最佳策略。
需要在发育中木材中特异性表达并且与经常使用的花椰菜花叶病毒35S启动子的功能一样好或者比之更好的组织特异性启动子。
为了鉴定在发育中木材中驱动高表达的来自GT43基因家族的好的启动子，通过qRT-PCR量化植物地上组织中所有7个GT43基因的转录物水平，并且克隆来自所有这些基因的启动子以驱动GUS基因以易于检测。产生转基因白杨株系并且分析GUS表达模式。
在发育中木材中和发育韧皮部纤维中对于pGT43A、pGT43B和pGT43C三个启动子发现GUS活性，并且表达模式相对于35S启动子更具特异性。
所有GT43启动子的序列在序列表中示出。SEQIDNO：23至30中的最后6个位置对应于蛋白质中的前两个氨基酸。
GT43基因的选择
基因GT43A至G的编码序列在不同的树中具有不同的长度。在杨树中，该长度为666(SEQIDNO：6)至1533(SEQIDNO：3)个碱基对。在桉树中，该长度为1008(SEQIDNO：37)至1509(SEQIDNO：36)个碱基对。可以选择来自这些基因中任何一个的片段，所述片段可以为20至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、800至900、900至1000、1000至1100、1100至1200、1200至1300、1300至1400或1400至1500个碱基长至基因的编码序列之全长，甚至更长。
在所有合成木聚糖的植物中发现了GT43基因。预期由这些基因表达的蛋白将对木聚糖合成具有相同的作用。
然后，通过qRT-PCR量化转基因杂种白杨的植物地上组织中所有7个GT43基因的转录物水平。结果汇总在下表I中。
表I：根据在杂种白杨的不同组织中的qRT-PCR测量的相对mRNA转录水平
GT43A GT43B GT43C GT43D GT43E GT43F GT43G
茎尖 2％ 1％ 3％ 4％ 12％ 11％ 10％
叶片 2％ 3％ 6％ 6％ 17％ 15％ 16％
木质部 61％ 66％ 52％ 50％ 16％ 34％ 40％
应拉木 35％ 29％ 36％ 31％ 22％ 23％ 16％
韧皮部 0％ 1％ 3％ 9％ 12％ 17％ 19％
基于在植物组织木质部中的表达，根据这些数据选择了三个GT43基因，从每个进化枝中选一个。预期在木质部中具有高特异性和/或高表达水平的基因将对该组织中的木聚糖生物合成具有大的影响。对于杂种白杨，选择了GT43B(进化枝I)、GT43E(进化枝II)和GT43C(进化枝III)。下表II示出可以根据本发明使用的来自桉属的GT43基因。
表II：桉属GT43基因
进化枝 核酸序列 氨基酸序列
GT43A Eucgr.A01172.1 I SEQ ID NO：31 SEQ ID NO：38
GT43B Eucgr.C00584.1 II SEQ ID NO：32 SEQ ID NO：39
GT43C Eucgr.F00463.1 II SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：40
GT43D Eucgr.F02177.1 II SEQ ID NO：34 SEQ ID NO：41
GT43E Eucgr.H02219.1 III SEQ ID NO：35 SEQ ID NO：42
GT43F Eucgr.I00880.1 III SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：43
GT43G Eucgr.K03214.1 I SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：44
转基因树的产生
使用遗传学方法(干扰RNA)来产生转基因树，以降低或抑制基因表达并且探究基因功能。通常由启动子驱动RNAi构建体，以增强并且靶向随后将形成活性RNAi发夹的RNA的表达。常用的启动子为组成型花椰菜35S启动子。
本发明中使用的所有GT43RNAi构建体由35S启动子或者由新鉴定的特异性木材启动子驱动。GT43启动子中的任何一个都可以用于本发明，但不排除其他启动子。优选的启动子为GT43B来源的启动子。
用遗传方法制备了一组不同的表达载体，也称作构建体。其中的每一个都包含启动子，来自选自GT43基因家族的基因的一个、两个或三个片段。在相反方向上有效克隆相同的基因片段，形成克隆的基因片段的反向重复(图2)。
选择GT43基因中的三个：GT43B，SEQIDNO：2；GT43C，SEQIDNO：3；和GT43E，SEQIDNO：5及其双重组合(GT43BC、GT43BE、GT43CE)和三重组合(GT43BEC)来通过RNAi进行靶向。将制备的所有构建体有效连接至组成型花椰菜35S(35S)启动子或木材特异性(WP)启动子，并且转化到杂种白杨(欧洲山杨(Populustremula)x美洲山杨(tremuloides))中。
制备这些构建体来每次沉默一个进化枝、两个进化枝或者全部三个进化枝。所有7种类型的反向重复由35S启动子或WP启动子驱动，产生14个被转移至杂种白杨克隆T89的构建体。以下实施例部分进一步描述了这些构建体。
研究了在用这14个构建体转化的转基因杂种白杨株系中表达的RNA，并且通过qRT-PCR在来自每构建体3个株系的木材的样品(每个样品3次生物重复)中测定GT43基因的转录物水平。其结果(表III)示出通过不同构建体的GT43基因的转录降低为野生型水平的35％至75％。
表III：GT43基因在转基因白杨株系的木材中的表达
构建体靶向： GT43B GT43C GT43E GT43BE GT43BC GT43EC GT43BCE
转录物水平 GT43B GT43C GT43E GT43B GT43B GT43E GT43B
WP 36％ 70％ 55％ 41％ 55％ 71％ 64％
35S 55％ 50％ 66％ 43％ 43％ 57％ 75％
图7中示出关于不同表达水平的详情。
为了理解WP：：GT43BCRNAi株系中的遗传调节网络，以及为在这些转基因株系中发现的增加的形成层细胞分裂探求解释，使用RNA测序在发育中木材中进行了转录物组的研究。证实了靶向的GT43转录物相对于野生型在GT43BCRNAi株系中减少(图8)，以及在qRT-PCR实验中观察到的减少(图7)。在包含GT43BCRNAi构建体的树中成功地下调了属于IRX9和IRX14进化枝的所有4个基因成员，即GT43A、GT43B、GT43C和GT43D(图8)。来自进化枝IRX9-L的GT43E和G未受RNA干扰影响，其证实了RNAi构建体的特异性。查看GT43家族以外的更多木聚糖生物合成相关基因，其涉及木聚糖主链、还原末端序列形成和乙酰化，相对于野生型，这些基因总体上在GT43BCRNAi株系中具有降低的转录物水平(图8)。
此外，发现几种与次生细胞壁形成相关的基因是GT43BCRNAi株系中的大多数下调基因之一，其包括：MYB转录因子基因、纤维素基因和木质素生物合成基因，以及涉及糖代谢的基因。相比之下，在大多数上调基因中发现了参与形成层维持和早期木质部分化的因子。因此，GT43表达的降低导致细胞壁生物合成机构的下调，以及参与形成层功能的调节因 子的上调。
转基因树的生长
在温室实验中评估转基因株系的生长。测量植物高度、茎直径、节间数目和节间长度。在WP驱动的构建体GT43BC之一中，生长出人意料地高，相对于非转化杂种白杨，其导致140％的体积增加。预期这一高生长增加也适用于桉属、金合欢属和柳属。
此外，构建体GT43C显示出启动子之间对植物高度、茎直径和体积的作用的显著差异。相对于非转化杂种白杨，相对于由35S启动子驱动时仅85％，由WP启动子驱动的构建体GT43C增加120％。在所有这些情况下，相对于35S驱动的构建体，用WP驱动的构建体刺激生长。
为了确定具有WP启动子的构建体GT43BC株系中增强的生长是否缘于增加的木材产生，在显微镜下检测茎切片，并且测量髓的半径、木质部的径向宽度和树皮。这些转基因株系具有增加量的所有三种组织，但在木质部的厚度中观察到了最高增加，其平均增加22％以上。
转基因株系中的木材的机械特性
具有更高生物质产量的树对于工业应用是有价值的。但是如果这样的树更脆弱，并且因此易于被生物性胁迫和非生物性胁迫损伤，则其不具竞争性。
已知木聚糖受损的杨树，即具有降低的木聚糖的量的杨树，具有降低的木材机械强度(Li等(2011)TreePhysiol.31：226-236)。因此，在三点弯曲试验中分析了转基因株系的木材的弯曲弹性模量(MOE)和抗弯强度(BS)。当在两种不同的树株系中检测时，意外地，发现来自具有WP启动子之构建体GT43BC的木材在两种转基因株系中均显示出更高的MOE，和更高的BS。改善的机械特性也由三点弯曲试验中的抗弯强度支持，相对于野生型，其增加了11％至18％，详见实施例8。
高弹性模量意味着所检测的材料更硬，需要更大的力来弹性地(非永久性)变形。另一方面，抗弯强度表示在断裂瞬间施加在材料上的力。因此，转基因树中的高抗弯强度暗示木材的高回弹性。
转基因株系中的细胞壁分析
为了确定任何细胞壁改变的性质，通过FT-IR分析转基因株系和WT的木材。未检测到显著变化。
通过TMS分析测定转基因株系BC1、BC2和BEC1及WT的木材中的中性和酸性糖组分的单糖组成变化。未检测到重大变化。
从木材细胞壁中进一步提取半纤维素，并且用木聚糖酶对其进行消化以便特异性地分析木聚糖。然后通过聚丙烯酰胺糖凝胶电泳(polyacrylamidecarbohydrategelelectrophoresis，PACE)分离释放的低聚物，并且通过染色量化信号。通过来自还原末端序列的信号与来自低聚木糖(xylo-oligomer)的信号的比来测定相对木聚糖链长度。分析显示，相对于WT，具有WP启动子株系的构建体GT43BC中的木聚糖链长度减少10％。
转基因杂种白杨株系的糖化分析
通过使用两种不同的方法研究含有具有WP启动子之构建体GT43BC的白杨木材的糖化：(i)未经预处理的酶水解，和(ii)预处理后酶水解。使用升高的温度及添加酸催化剂[1％(w/w)硫酸]进行预处理。使用高效阴离子交换色谱法测定单糖产量。相对于野生型，转基因白杨株系显示出提高的葡萄糖产生率和提高的葡萄糖产量。
图4中示出来自未经预处理的糖化实验的结果。图4示出酶水解后单糖的产量(有标准差)。该结果示出转基因白杨(BC1和BC2)的葡萄糖产量显著增加(P≤5％，t检验)。葡萄糖产量的增加对BC1对应于27％而对BC2对应于40％，其出乎意料地高。来自预处理后酶水解的结果在图5中示出。当将转基因白杨(BC1和BC2)与野生型进行比较时，未检测到显著差异(P≤5％，t检验)。
总结
这些数据示出，木聚糖生物合成在木本植物中的小幅降低在植物中导致诸多正面效果，前提条件是：在形成次生壁的细胞中特异性的诱导该变化。这通过使用来自基因GT43B的木材特异性启动子(WP)来实现。转基因RNAi株系的木聚糖合酶基因GT43B和GT43C被下调至WT的约50％至60％，但是特别地，在WP启动子控制下的形成组织的次生壁中，木糖含量仅降低约3％至5％，木聚糖链长度降低约10％。这些株系长得出乎意料地更好，具有高出约30％至40％的茎体积、增加约30％的弹性模量(MOE)，和在未经预处理的糖化中高出约30％至40％的葡萄糖产量。
这些木素纤维素的改进的生物加工特性发酵是可以预期的，并且可用于发酵。
四个GT43成员(GT43A、B、C和D)的下调引起增强的生长
相对于其他RNAi构建体，包含靶向IRX9(GT43A和B)和IRX14(GT43C和D)两个进化枝的GT43BC片段的pGT43B驱动的RNAi构建体，对生长具有最积极的影响(图3)。每个进化枝中的主基因GT43B和GT43C的表达水平，分别为两种最佳株系GT43BC1和BC2中野生型水平的35％和55％左右(图7)。那些株系的植物高度和茎直径增加了野生型水平的10％至20％，导致茎体积增加50％至60％(图6)。节间数目、节间长度和叶片尺寸也增加约10％。用随机化植物定位对两种GT43BC株系1和2重复三次温室生长实验，具有类似结果。
更强的木材和更低的密度
具有更高的生物质产量的树对工业应用是有价值的。但是如果这样的树更脆弱，并且因此易于被生物性胁迫和非生物性胁迫损伤，则其不具竞争性。因此测定了具有降低的GT43B和GT43C表达水平的转基因杂种白杨木材的机械特性。基于在木聚糖生物合成中受损的植物的公开表型，我们预期在三点弯曲法中关于由成熟木材小心地制备的样本之木材的机械强度受损(Lee等，2011；Li等，2011)。意外地，我们发现：相对于野生型，所测试的GT43BCRNAi株系的木材具有更高的弹性模量和更高的抗弯强度(图5)。高弹性模量意味着所检测的材料更硬，并且需要更大的力来弹性地(非永久性)变形。另一方面，抗弯强度表示在断裂瞬间施加在材料上的力。因此，转基因学中的高抗弯强度暗示木材的高回弹性。
植物物种
高度预期当来自其他木本树的GT43直系同源基因的表达降低时，这将导致改善的生长特性、机械特性和糖化。
根据本发明，转基因树优选木本树或木本物种。在一个有用的实施方案中，木本树为硬木树，其可选自：金合欢、桉、鹅耳枥、山毛榉、桃花心木、胡桃、栎、梣、柳树、山核桃、桦、栗、杨树、桤木(alder)、枫、悬铃木、银杏、棕榈树和香枫。来自杨柳科的硬木树例如包括其变种的柳树、杨树和白杨特别值得关注，因为这两组包括生长以特别提供木料(timber)和生物燃料的树或木本灌木的速生物种。
在另一些实施方案中，木本树为可选自以下的针叶树：柏、花旗松(Douglasfir)、冷杉(fir)、红杉、铁杉、雪松、刺柏(juniper)、落叶松、松、水杉(redwood)、云杉和紫杉。
在有用的实施方案中，木本树为可选自以下的产果植物：苹果树、李树、梨树、桔树、猕猴桃树、柠檬树、樱桃树、葡萄树和无花果树(fig)。
实施例
实施例1：来自GT43基因家族的木材特异性启动子的克隆。
为了鉴定在发育中木材中高度表达的来自GT43基因家族的好启动子，通过qRT-PCR量化植物地上组织中所有7种基因的转录物水平。将克隆的所有7个启动子和WP(SEQIDNO：23至30)以及35S启动子克隆到GATEWAY盒式载体中，跟随着GUS基因，以便于容易检测，产生8个不同的构建体。克隆的启动子的序列示为SEQIDNO：23至30。
9个pGT43：：GUS融合构建体在杂种白杨中被稳定地表达，并且组织化学地分析两月龄温室生长的树的茎的GUS活性。
在发育木质部和韧皮部纤维中发现了对GT43A启动子、GT43B启动子和WP启动子的染色。相比之下，GT43C、GT43D和GT43E启动子的活性存在于韧皮薄壁组织中。作为比较，在树皮和发育中木材及射线细胞(raycell)中检测到35S启动子的活性。
构建体WP：：GUS被证明具有最特异性的启动子，并且选择该启动子进行进一步研究。
为了检测WP启动子对遗传学上修饰木材的效力，使用WP启动子或35S启动子在两个不同的基因家族中制备RNAi构建体以下调特异性的家族成员。
实施例2：所有7个GT43基因在非转基因杂种白杨中的转录水平。
通过qRT-PCR在植物地上组织中量化杂种白杨(欧洲山杨(Populustremula)x美洲山杨(tremuloides))的植物组织中所有7个GT43基因的转录物水平。结果汇总在上表I中。
通过qRT-PCR在植物地上组织中量化所有7个基因的mRNA转录物。基于可以比较不同基因的表达水平的非标准化表达，发现基因GT43C和GT43E在发育中木材中被最高度表达，其次是GT43B和GT43A。在该组织中未检测到GT43F和GT43G的表达。
在高度表达的基因中，发现GT43A、GT43B和GT43C3个基因在发育中木材、木质部和应拉木中特异性表达。GT43A和GT43B的的表达比GT43C的表达更具木材特异性。
实施例3：杂种白杨中的转基因株系
转基因株系产生于杂种白杨中，其设计成使用对每个进化枝最重要的基因的进化枝特异性序列使每个GT43进化枝沉默：对进化枝I为GT43B、来自进化枝II的GT43E，和对进化枝III为GT43C。然后组合这些片段以每次使两个进化枝或者全部三个进化枝沉默。所有7种类型的反向重复由CMV35S启动子或WP启动子驱动，产生14个被转移至克隆T89的构建体。
每个构建体在体外预先筛选出约20个独立的株系以选出三个影响最大的株系，其为WT的数倍，并且将其种植在温室中。
实施例4：GT43基因在转基因株系的木材中的表达的分析
通过qRT-PCR测定不同的GT43基因在所选出的转基因株系的木材中的表达水平。该分析示出靶基因表达在转基因株系的木材中平均降低至WT水平的35％至75％，并且根据在构建体中使用的启动子的下调水平没有差异。
实施例5：转基因株系的生长
在温室实验中评估转基因株系的生长。使每种由五棵树表示的所有转基因株系在温室中生长约3个月。将转基因植物和WT植物均匀分布在温室栽培室中，并且转动以消除室内微环境的影响。测量植物高度、茎直径、节间数目和节间长度。考虑到构建体的所有作用，35S启动子驱动的构建体除了增加构建体BC中的叶片数目和节间长度以外不影响生长(表IV)。相比之下，WP驱动的构建体增加了构建体BC和EC中的高度，构建体EC中的叶片数目，构建体B、BC和EC中的茎直径和茎体积。在构建体BC中观察到了对体积的最大影响，其达到WT体积的140％。构建体C在启动子对植物高度、茎直径和体积的影响中表现出显著差异，而构建体EC在启动子对茎直径和体积的影响中表现出显著差异。在所有这些情况下，与35S驱动的构建体相比，WP驱动的构建体刺激生长。
还研究了独立株系中的生长变异性，用WP启动子产生的大多数株系表现胜过WT。
为了确保生长效果随时间保持稳定，用两种选出的株系WP：RNAiGT43BC1和BC2进行两个月分别的温室实验。观察到了类似生长变化。
实施例6：转基因杨树中的木材形成
为了确定WP：RNAiGT43BC株系中增加的茎直径是否缘于增加的木材产生，在显微镜下检测茎切片，并且测量髓的半径、木质部的径向宽度和树皮。这些转基因株系的所有三种组织具有增加量，但在木质部的厚度中观察到了最高增加，平均+22％(表v)。在显微镜下测量茎横截面的径向宽度。P值对应于ANOVA后对比。
表V：WP：RNAiGT43BC株系中的茎直径
实施例7：纤维宽度
为了确定增加的木质部宽度是否缘于更大的木质部纤维，浸软转基因株系和WT的木材，并且在显微镜下测量纤维。在株系之一中纤维厚度有小幅增加，在株系BC2中增加7％，但其不能解释此株系中的木质部径向宽度增加27％(比较表V和VI)。在具有+17％的更大木质部的株系BC1中未观察到纤维宽度的变化。我们推断出转基因株系产生更多木质部细胞，其为茎直径增加的主要原因。通过光学显微镜在转基因株系中未检测到木质部异常。
表VI：纤维宽度
实施例8：来自转基因株系的木材的机械特性
已知木聚糖受损的杨树具有降低的木材机械强度。因此，根据标题为“Structuraltimber-Determinationofcharacteristicvaluesofmechanicalpropertiesanddensity)”的标准CSNEN384(www.en-standard.eu/csn-en-384-structural-timber-determination-of-characteristic-values-of-mechanical-properties-and-density/)，或者三点弯曲试验中的抗弯强度(Esteves，B.M，Domingos，I.J.&Pereira，H.M.2008.Heattreatmentofpinewood.BioResources3(1)，142-154)分析转基因株系木质的弯曲弹性模量(MOE)和破坏强度(failurestrength)。总体来看，其在两种转基因株系中均显示更高的MOE(表VII)，以及在两种株系中更高的抗弯强度(表VIII)。百分数表示通过t检验(P≤5％)与WT以％计的显著差异。概率值对应于ANOVA后对比。
表VII：弹性模量(MOE)
表VIII：抗弯强度(BS)
实施例9：转基因株系中的细胞壁分析
为了确定任何细胞壁改变的性质，通过FT-IR分析转基因株系和WT的木材。在WP：GT43BCRNAi株系和WT之间未检测到显著变化(数据未示出)。
通过TMS分析测定转基因株系BC1、BC2和BEC1以及WT的木材中的中性和酸性糖组分。未检测到大的变化。注意到木糖和Me-GlcA中的小的差异，指示了木聚糖含量最大降低5％，其伴随阿拉伯糖(Ara)降低和葡萄糖(Glc)增加。
实施例10：木聚糖分析
从来自WP：GT43BCRNAi构建体的两种树株系的木质细胞壁中进一步提取半纤维素，并且用木聚糖酶对其进行消化以特异性地分析木聚糖。然后通过聚丙烯酰胺糖凝胶电泳(PACE)分离释放的低聚物，并且通过染色量化信号。通过来自还原端序列的信号与来自低聚木糖的信号的比来测定相对木聚糖链长度(表IX)。分析显示，相对于WT，更受影响的株系WP：GT43BC2RNAi中的木聚糖链长少量减少，减少13％。P值对应于转基因株系与WT之间的对比。
表IX：相对木聚糖链长度。三次独立实验的平均值和标准误(SE)，每次3至6个生物重复
实施例11：转基因株系的糖化分析
使用两种不同的方法研究白杨木材的糖化：(i)未经预处理的酶水解(图4)，和(ii)预处理后酶水解(图5)。使用升高的温度和酸催化剂[1％(w/w)硫酸]进行预处理。预处理后，使液体级分(称为预处理液)与固态残余物分离。然后使用酶制剂降解固态残余物。使用高效阴离子交换色谱法测定单糖产量(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的产量)。
未经酸预处理的结果(图4)表现为转基因白杨(BC1和BC2)的葡萄糖产量显著增加(P≤5％，t检验)。葡萄糖产量的增加对于BC1对应于27％而对于BC2对应于40％。利用酸预处理(图5)，当将转基因白杨(BC1和BC2)与野生型进行比较时未检测到显著差异(P≤5％，t检验)。

Claims (29)

1.一种用于产生转基因树的方法，所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有降低的木聚糖含量，所述方法包括降低所述转基因树中来自糖基转移酶43(GT43)家族的一种或更多种基因的表达，其中所述转基因树与相同物种的野生型树相比具有增强的生长特性和改善的机械特性和/或糖化特性。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：
(a)将表达载体导入树细胞，所述表达载体包含：
(i)至少一个启动子；
(ii)有效连接在所述启动子下游的第一核苷酸序列，其包含来自GT43家族的一种或更多种基因；和
(iii)有效连接在所述第一核苷酸序列下游的与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列；
其中所连接的核苷酸序列在所述细胞中转录成RNA，从而产生发夹RNA，所述发夹RNA在所述细胞中被加工成能够降低来自GT43家族的一种或更多种基因的表达的干扰RNA分子；以及
(b)将步骤(a)中的所述树细胞培养成转基因树。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述启动子为木材特异性启动子，其在次生壁生物合成期间上调。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述木材特异性启动子选自：GT43启动子；次生壁CesA启动子；RWA启动子，尤其是与拟南芥属RWA1、RWA3或RWA4启动子同源的启动子；与拟南芥属IRX10启动子同源的启动子；GUX1或GUX2启动子；AtFRA8、AtIRX8/或AtPARVUS启动子；AtXyn1启动子；AtTBL29启动子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述木材特异性启动子为包含SEQIDNO：25所示之核苷酸序列的GT43B启动子，或者包含SEQIDNO：23所示之核苷酸序列的GT43B来源的WP启动子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述转基因树的发育中木材中，由所述来自GT43家族的一种或更多种基因转录的mRNA的水平为相同物种的野生型树中转录的mRNA之相应水平的25％至85％。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述来自GT43家族的一种或更多种基因选自：
(a)由以下组成的毛果杨基因的组：
GT43A(SEQIDNO：1)，
GT43B(SEQIDNO：2)，
GT43C(SEQIDNO：3)，
GT43D(SEQIDNO：4)，
GT43E(SEQIDNO：5)，
GT43F(SEQIDNO：6)，
GT43G(SEQIDNO：7)；
(b)与(a)中的所述毛果杨基因直系同源并且与(a)中的基因具有至少80％序列同一性的基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其中(b)中的所述直系同源基因选自从桉属(Eucalyptus)、金合欢属(Acacia)或柳属(Salix)中选择的物种。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述来自GT43家族的一种或更多种基因选自：
GT43B(SEQIDNO：2)，
GT43C(SEQIDNO：3)，和
GT43E(SEQIDNO：5)。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述来自GT43家族的一种或更多种基因选自：
GT43B(SEQIDNO：2)和
GT43C(SEQIDNO：3)。
11.根据权利要求10所述的方法，其包括降低GT43B和GT43C二者的表达，或者降低GT43B、GT43C和GT43E三种GT43基因的表达。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其用于产生具有增强的生长的转基因树。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述增强的生长以以下的一个或多个特征为特征：增加的高度、增加的茎直径、增加的茎体积、增加的节间长度和增加的叶片数目。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其用于产生具有改善的机械特性的转基因树。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述改善的机械特性包括增加的弹性模量和/或增加的抗弯强度。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其用于产生转基因树，与来自相同物种的野生型树的木材相比，来自所述转基因树的水解木材的单糖产量增加。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述单糖选自阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。
18.一种转基因树，其可以通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法来获得。
19.根据权利要求18所述的转基因树，其为选自杨属(Populus)、金合欢属、柳属或桉属的属。
20.一种表达载体，其包含：
(i)在发育中木材中具有活性的木材特异性启动子；
(ii)至少一个基因，其任选地选自糖基转移酶43(GT43)基因家族。
21.根据权利要求20所述的表达载体，其包含：
i.至少一个启动子；
ii.第一核苷酸序列，其包含来自GT43家族的一种或更多种基因；和
iii.与所述第一核苷酸序列互补的第二核苷酸序列；
其中所述核苷酸序列能够在树细胞中转录成发夹RNA结构，所述发夹RNA结构在所述细胞中被加工成能够降低GT43基因的表达的干扰RNA分子。
22.根据权利要求21所述的表达载体，其中所述启动子为GT43B启动子。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体还包含选自转录因子结合位点、剪接位点和终止位点的一种或更多种调控元件。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的表达载体，其中所述第一核苷酸序列包含来自GT43家族的两种或三种基因。
25.根据权利要求24所述的表达载体，其中所述两种基因为GT43B和GT43C，或者所述三种基因为GT43B、GT43C和GT43E。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的表达载体用于增强基因表达或者用于下调基因的用途，所述基因优选地为选自糖基转移酶43(GT43)基因家族的基因。
27.一种转基因树，其包含根据权利要求20至25中任一项所述的表达载体。
28.木材，其可以从根据权利要求18、19或27中任一项所述的转基因树获得。
29.一种用于由木材产生单糖的方法，其包括：
(a)提供根据权利要求28所述的木材；
(b)降解所述木材；以及
(c)获得游离单糖。
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