JP2016537970A - 低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木 - Google Patents
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Abstract
本発明は、同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法に関し、ここで該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、それにより、該形質転換樹木において生長特性、機械的特性および/または糖化特性が向上する。
Description
本発明は、樹木における特性向上の分野に関する。特に本発明は、生長の増加、改善された糖化および改善された機械的特性を伴う、キシラン生合成機構においてグリコシルトランスフェラーゼ43遺伝子をダウンレギュレートする方法に関する。また本発明は、使用される発現ベクター、形質転換樹木および木質にも関する。そのような樹木および木質は森林植林において有用であり、またバイオエネルギーの使用にも有用である。
発明の背景
木質は、再生可能なバイオ燃料の豊富な原材料としての優れたエネルギー源の一つである。高等植物の細胞壁は、多糖類、例えばセルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびポリフェノール化合物、例えばリグニンを含む。これらの細胞壁成分の全てがリグノセルロース系バイオマスを構成しており、これはエネルギーの豊富な供給源である。
木質は、再生可能なバイオ燃料の豊富な原材料としての優れたエネルギー源の一つである。高等植物の細胞壁は、多糖類、例えばセルロース、ヘミセルロース、ペクチンおよびポリフェノール化合物、例えばリグニンを含む。これらの細胞壁成分の全てがリグノセルロース系バイオマスを構成しており、これはエネルギーの豊富な供給源である。
キシランは広葉樹における主要なヘミセルロースであり、木質バイオマスの約20%を占める。広葉樹におけるキシラン主鎖の長さは、通常はある種についての長さの狭い範囲内にあるが、単離操作に応じて変わりうる。残基の数は50〜250で変化する。恐らく、キシランの長さは広葉樹内において厳しく制御されているものと考えられる。
キシランは、ゴルジにおいて多数のグリコシルトランスフェラーゼ(GT)で合成され、これが小胞において原形質膜に輸送され、この原形質膜において細胞壁に組み込まれ、かつ他の壁組成物で架橋される。ポプラ属(Populus)では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、遺伝子ファミリーGT8、GT43およびGT47に属する。これらは、キシラン主鎖の開始、伸長および終結に必要とされる。
キシラン生合成は鋭意研究が行われている分野の一つであり、それというのも、キシラン生合成に関与する最初の遺伝子がシロイヌナズナ属(Arabidopsis)において発見されたためである。
コットンウッド(Populus trichocarpa)のGT43群は、GT43AからGT43Gで示される7つの遺伝子を含む。核酸配列は配列番号1〜7として示され;対応するアミノ酸配列は配列番号8〜14として示される。コットンウッド、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)およびイネ(Oryza sativa)における比較配列解析によって、GT43遺伝子が3つの別個のクレードを形成し、これらが3つの異なる属において保存されることが示された(図1参照)。シロイヌナズナ核酸配列は、配列表において配列番号15(AtIRX9;クレードI);配列番号16(AtIRX9−L;クレードII);配列番号17(AtIRX14;クレードIII)および配列番号18(AtIRX14−L;クレードIII)として示される。対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号19〜22として示される。
下等の維管束植物類およびトウヒは、クレードIIおよびクレードIIIの2つのクレードしか有していない。
研究によって、キシランキシロシルトランスフェラーゼ活性には、クレードIまたはIIのメンバーの1つとクレードIIIのメンバーの1つとが必要であることが判明した。このことは、最近の研究(Lee et al. (2012) Plant Signaling & Behavior 7: 1−6)によって裏付けられている。この研究によって、キシラン生合成にはPtrGT43BおよびPtrGT43Cという2つのポプラグリコシルトランスフェラーゼが関与することが実証された。彼らの発見によって、ポプラのGT43メンバーが、キシラン主鎖の生合成時にキシロシル残基の連続的な転移の触媒作用において協調的に作用することが示された。このことはさらに、維管束植物類においてGT43遺伝子ファミリーメンバーの生化学的機能が進化的に保存されているという仮説を裏付けるものである。
ポプラ属のGT43メンバーは、キシラン主鎖の伸長に関与することが判明している。GT43AおよびGT43Bは木質形成の間に高度に発現され、特に二次細胞壁が肥厚している細胞中で発現される。
ポプラ属のGT43B遺伝子の発現は、RNAiにより形質転換ポプラ属において低減された(Lee et al. (2011) Mol. Plant 4: 730−747)。この低減された発現によって、これらのポプラ属の転写産物がWTレベルの2%〜15%に減少する。その結果、繊維および道管における薄い細胞壁内に異常な木部が形成され、かつ不規則な木部表現型(潰れた道管)が形成される。さらに、キシロース含有量は、これらの株におけるWTキシロース含有量の50%〜80%に減少した。SリグニンおよびGリグニンの含有量も減少した。
ペントース、例えばキシランは発酵のための貧基質と考えられ、従ってキシラン含有量の減少は発酵用途においては有益であろう。しかし、キシラン含有量が減少した植物は矮性であり、かつ/または、潰れておりかつ薄い細胞壁を有する木部を生成する。このような植物はまた脆弱であり、かつ脆い幹を有する。
GT43B遺伝子の発現がRNAiにより低減された場合、リグニン含有量が減少した(Lee et al. (2011) Mol. Plant 4: 730−747)。セルロース消化率は、同一のセルロース量を酵素消化に供したWTに比べて、GT43B RNAi株、GT47C RNAi株において増加した。リグノセルロースの乾燥質量あたりの糖化収率についての情報は、何ら提供されていない。キシランの不足を伴ういくつかのポプラ株は脆弱であり、かつ脆い幹を有する(Li et al. (2011) Tree Physiol. 31: 226−236)。GT47Cが抑制された場合には、樹木の生長は影響を受けなかった。また、他の形質転換株の場合については報告されていない。
WO2012/103555には、低減されたキシラン含有量と、それに伴って低減された生長特性と低減された機械的特性とを招く、アンチセンスによるシロイヌナズナ属におけるIRX9遺伝子のダウンレギュレーションが記載されている。
US2012/0185975には、シロイヌナズナ属のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子から単離されたプロモーターが開示されている。このプロモーターを、ストレス処理のために、植物、植物部分または植物細胞において使用できることが説明されている。
キシラン含有量の減少は、木質中のセルロース割合の増加につながる。キシラン由来の糖は、セルロース由来の糖とは対照的に発酵のための貧基質と考えられているという知識から判断すると、キシラン含有量の減少は有益であると考えられる。キシラン含有量が低減された樹木についての問題は、上記の議論に基づくと、こうした樹木が矮性であり、かつ/または、潰れたおよび/または薄い細胞壁を有する木部を生成するという点にある。このような樹木はまた脆弱であり、かつ脆い幹を有する。
従って、生長の増加を示すとともに機械的特性の保持または向上を示す形質転換樹木を製造するための方法および手段が求められている。さらに、より良好な糖化特性が求められている。この種の形質転換樹木は、一般用途での森林植林のための、そして特にバイオエネルギー作物のための、価値の高い材料を構成する。
発明の概要
第1の態様において、本発明は、同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法を提供し、ここで該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、その際、該形質転換樹木は、同一種の野生型樹木に比べて、生長特性の向上および改善された機械的特性および/または糖化特性を示すものとする。
第1の態様において、本発明は、同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法を提供し、ここで該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、その際、該形質転換樹木は、同一種の野生型樹木に比べて、生長特性の向上および改善された機械的特性および/または糖化特性を示すものとする。
一実施形態では、本態様による方法は次のステップを含む:
(a)樹木細胞に発現ベクターを導入するステップであって、ここで、該発現ベクターは次のものを含むものとする:
(i)少なくとも1つのプロモーター;
(ii)該プロモーターの下流に作動可能に連結されたGT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
(iii)該第1のヌクレオチド配列と相補的であってかつ該第1のヌクレオチド配列の下流に作動可能に連結された、第2のヌクレオチド配列;
その際、これらの連結されたヌクレオチド配列は細胞内でRNAへ転写され、それによってヘアピンRNAが生成され、該ヘアピンRNAが該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子が、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減することができるものとする;および
(b)ステップ(a)の樹木細胞を培養して形質転換樹木とし、かつ前述の形質転換樹木を栄養繁殖させることにより形質転換樹木株を取得するステップ。
(a)樹木細胞に発現ベクターを導入するステップであって、ここで、該発現ベクターは次のものを含むものとする:
(i)少なくとも1つのプロモーター;
(ii)該プロモーターの下流に作動可能に連結されたGT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
(iii)該第1のヌクレオチド配列と相補的であってかつ該第1のヌクレオチド配列の下流に作動可能に連結された、第2のヌクレオチド配列;
その際、これらの連結されたヌクレオチド配列は細胞内でRNAへ転写され、それによってヘアピンRNAが生成され、該ヘアピンRNAが該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子が、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減することができるものとする;および
(b)ステップ(a)の樹木細胞を培養して形質転換樹木とし、かつ前述の形質転換樹木を栄養繁殖させることにより形質転換樹木株を取得するステップ。
特に木質の発達において低減されたGT43遺伝子の発現を示す形質転換樹木株は、得られた多数の株から選択され、好ましくは20以上の株から選択される。
好ましい一実施形態において、前述のプロモーターは木質特異的プロモーターであり、この木質特異的プロモーターは二次壁生合成の間にアップレギュレートされる。
他の好ましい実施形態において、前述の木質特異的プロモーターは、GT43プロモーター、二次壁CesAプロモーター、RWAプロモーター、特にシロイヌナズナ属のRWA1プロモーター、RWA3プロモーターまたはRWA4プロモーターに相同のプロモーター、シロイヌナズナ属のIRX10プロモーターに相同のプロモーター、GUX1プロモーターまたはGUX2プロモーター、AtFRA8プロモーター、AtIRX8プロモーター/またはAtPARVUSプロモーター、AtXyn1プロモーター、AtTBL29プロモーターから選択される。当技術分野においては、これらのプロモーターは主に維管束組織において発現されかつ二次壁形成に関与すること、そしてそれらの発現パターンは木質の発達からのデータを用いて追従し易いことが知られている。
その他の好ましい実施形態において、前述の木質特異的プロモーターは、配列番号25として示されるヌクレオチド配列を含むGT43Bプロモーターであるか、または配列番号23として示されるヌクレオチド配列を含むGT43B由来の木質特異的(WP)プロモーターである。GT43BプロモーターとWPプロモーターとの相違点は、開始コドンの上流24ヌクレオチドの欠失である。
他の実施形態によれば、前述の形質転換樹木の木質の発達において、GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子から転写されるmRNAのレベルは、同一種の野生型樹木において転写されるmRNAの対応するレベルの25%〜85%である。
好ましくは、前述の形質転換樹木の木質の発達において、GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子、好ましくはGT43AまたはGT43BまたはGT43Cから転写されるmRNAのレベルは、低減されはするものの無くなるわけではない。前述のmRNAのレベルは、同一種の野生型樹木において転写されるmRNAの対応するレベルの、好ましくは25%〜85%、35%〜75%、30%〜60%であるか、またはさらに好ましくは50%〜60%である。抑制のレベルは、木質特異的プロモーター、すなわち主に維管束組織において発現されるプロモーターの使用による木質組織の発達を目的とすることができる。前述の低減された発現は、好ましくは、当技術分野においてよく知られているRNA干渉(RNAi)法によって達成される。
GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子は、好ましくは次のものから選択される:
(a)次のものからなるコットンウッド遺伝子の群:
GT43A(配列番号1)、
GT43B(配列番号2)、
GT43C(配列番号3)、
GT43D(配列番号4)、
GT43E(配列番号5)、
GT43F(配列番号6)、
GT43G(配列番号7);
(b)(a)におけるコットンウッド遺伝子とオルソロガスであってかつ(a)における遺伝子との配列同一性が少なくとも80%である、遺伝子。
(a)次のものからなるコットンウッド遺伝子の群:
GT43A(配列番号1)、
GT43B(配列番号2)、
GT43C(配列番号3)、
GT43D(配列番号4)、
GT43E(配列番号5)、
GT43F(配列番号6)、
GT43G(配列番号7);
(b)(a)におけるコットンウッド遺伝子とオルソロガスであってかつ(a)における遺伝子との配列同一性が少なくとも80%である、遺伝子。
前述の(b)におけるオルソロガス遺伝子は、好ましくはユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される種に由来する。
前述のユーカリ属遺伝子は、以下のものからなる群から選択される:
GT43A(配列番号31)、
GT43B(配列番号32)、
GT43C(配列番号33)、
GT43D(配列番号34)、
GT43E(配列番号35)、
GT43F(配列番号36)、
GT43G(配列番号37)。
GT43A(配列番号31)、
GT43B(配列番号32)、
GT43C(配列番号33)、
GT43D(配列番号34)、
GT43E(配列番号35)、
GT43F(配列番号36)、
GT43G(配列番号37)。
好ましくは、GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子は、GT43B(配列番号2)、GT43C(配列番号3)およびGT43E(配列番号5)からなる群から選択される。さらに好ましくは、これらの遺伝子は、GT43B(配列番号2)およびGT43C(配列番号3)からなる群から選択される。さらに好ましくは、本発明による方法は、GT43BおよびGT43Cの双方の発現の低減か、または、3つのGT43遺伝子、すなわちGT43B、GT43CおよびGT43Eの発現の低減を含む。
上述の通り、本発明の方法の一実施形態は、生長の増加を示す形質転換樹木の製造に関する。この文脈において、「生長の増加」という用語は、高さの増加、幹直径の増加、幹体積の増加、節間長の増加および葉数の増加から選択される1つ以上の特徴を意味する。
さらに、本発明の方法の一実施形態は、改善された機械的特性を示す形質転換樹木の製造に関する。この文脈において、「改善された機械的特性」という用語は、弾性率(MOE)の増加および/または曲げ強さ(BS)の増加を意味する。
その他の実施形態において、本発明の方法は次のような形質転換樹木の製造を提供し、すなわち、該形質転換樹木の製造方法において、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木の製造を提供する。前述の単糖類は、好ましくはアラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される。
本発明の第2の態様は、第1の態様において上記で開示された方法によって得られる形質転換樹木に関する。前述の形質転換樹木は、好ましくはポプラ属、ユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される属の樹木である。さらに本発明は、本発明の第4態様の発現カセット(またはベクター)を含む形質転換樹木に関する。
第3の態様において、本発明は、本発明の第2の態様による形質転換樹木から得られる木質にも関する。
前述の形質転換樹木の木質においては、同一種の野生型樹木からの木質と比較した場合に、GT43からの1つ以上の遺伝子のmRNAのレベルが低減されている。詳細には、mRNAの前述のレベルは、低減されはするものの無くなるわけではない。好ましくは、mRNAのレベルは、同一種の野生型樹木と比較した場合に、mRNAの25%〜85%、さらに好ましくは30%〜60%に低減されている。
本発明の第4の態様は、次のものを含む発現ベクターに関する:
(i)木質の発達において活性である木質特異的プロモーター;
(ii)少なくとも1つの遺伝子、または少なくとも18のヌクレオチドを有する遺伝子の一部であって、任意にグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)遺伝子ファミリーから選択されたもの。
(i)木質の発達において活性である木質特異的プロモーター;
(ii)少なくとも1つの遺伝子、または少なくとも18のヌクレオチドを有する遺伝子の一部であって、任意にグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)遺伝子ファミリーから選択されたもの。
本態様の一実施形態において、本発明は次のもの:
(i)少なくとも1つのプロモーター;
(ii)GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
(iii)該第1のヌクレオチド配列と相補的な第2のヌクレオチド配列;
を含む発現ベクターに関し、
その際、これらのヌクレオチド配列は樹木細胞内でヘアピンRNA構造へ転写されることが可能であり、該ヘアピンRNA構造が該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子はGT43遺伝子の発現を低減することができるものとする。
(i)少なくとも1つのプロモーター;
(ii)GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
(iii)該第1のヌクレオチド配列と相補的な第2のヌクレオチド配列;
を含む発現ベクターに関し、
その際、これらのヌクレオチド配列は樹木細胞内でヘアピンRNA構造へ転写されることが可能であり、該ヘアピンRNA構造が該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子はGT43遺伝子の発現を低減することができるものとする。
上述のように、プロモーターは、主に木部の発達において発現されるプロモーターであり、例えばGT43Bプロモーターである。前述の発現ベクターはさらに、転写因子結合部位、スプライス部位および終結部位からなる群から選択される1つ以上の調節要素を含むことができる。
GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子は、好ましくはGT43B(配列番号2)およびGT43C(配列番号3)からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、前述の第1のヌクレオチド配列は、GT43ファミリーからの2つまたは3つの遺伝子を含む。好ましくは、前述の2つまたは3つの遺伝子は、GT43B(配列番号2)およびGT43C(配列番号3)の双方を含む。
GT43ファミリーからの前述の1つ以上の遺伝子は、好ましくは、GT43BおよびGT43Cの双方から、または、3つの遺伝子、すなわちGT43B、GT43CおよびGT43Eから、選択されることができる。
その他の態様において、本発明は、次のような形質転換樹木を製造するための前述の態様のいずれか1つに記載の方法を含み、すなわち、該形質転換樹木の製造方法において、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木を製造するための前述の態様のいずれか1つに記載の方法を含む。前述の単糖類は、好ましくはアラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される。
本発明のもう1つの態様は、遺伝子の、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)遺伝子ファミリーから選択される遺伝子の、発現増加のためのまたはダウンレギュレーションのための、本発明の発現ベクターの使用に関する。
その他の態様において、本発明は木質から単糖類を製造するための方法を提供する。前述の方法は、次のことを含む:(a)上記の通りの形質転換樹木からの木質を準備すること;(b)該木質を分解すること;および(c)遊離単糖類を得ること。木質は、酸性条件下での前処理を伴うかまたは伴わずに酵素によって分解される。前処理を行う場合には、様々な酸および酸濃度を用いて多くの方法で酸性条件を作り出すことができる。例えば好ましい一実施形態では、1%(質量/質量)の濃度の硫酸を添加することによって酸性条件を作り出すことができる。さらに、酸性条件には、この文脈においては、外部酸が添加されない前処理方法も包含されるものと意図される。酸性条件を得るために、前処理として温度上昇を用いることができる。例えば酸を添加しない蒸気爆発が酸性条件下で行われる。なぜならば、前処理中に酸が形成されるためである。
さらなる態様において、本発明は、本発明による木質から得られる単糖類を微生物発酵法のための基質として使用するための方法、およびこのような方法により得られる生成物に関する。このような方法の生成物は、バイオ燃料、他の化学物質および生体高分子でありうる。
定義
2つの核酸の文脈における「配列同一性」という語句は、配列比較アルゴリズムを用いて、または視覚的検査によって測定した際に最大一致に関して比較しかつ整列した場合に、少なくとも約60%、65%、70%、75%、好ましくは80%または85%、さらに好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%またはそれを上回る同一性を有する2つ以上の配列または部分配列を指すことができる。同一性とは、本発明においては、1つの遺伝子、2つの遺伝子または遺伝子の一群に個々に適用されることができ、かつその他の遺伝子に適用されることはできず、例えば、問題となる遺伝子に対して、ある遺伝子が75%相同であり、もう1つの遺伝子が60%相同であり、さらにはもう1つの遺伝子が93%相同であることができる。特定の態様において、実質的な同一性とは、少なくとも約150の核酸残基の、例えば少なくとも約200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800の、例えば少なくとも約900のヌクレオチドの、または例えば少なくとも約1kb、2kb、または例えば少なくとも約3kbの核酸配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、核酸配列は対応するコード領域の全長にわたって同一である。
2つの核酸の文脈における「配列同一性」という語句は、配列比較アルゴリズムを用いて、または視覚的検査によって測定した際に最大一致に関して比較しかつ整列した場合に、少なくとも約60%、65%、70%、75%、好ましくは80%または85%、さらに好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%またはそれを上回る同一性を有する2つ以上の配列または部分配列を指すことができる。同一性とは、本発明においては、1つの遺伝子、2つの遺伝子または遺伝子の一群に個々に適用されることができ、かつその他の遺伝子に適用されることはできず、例えば、問題となる遺伝子に対して、ある遺伝子が75%相同であり、もう1つの遺伝子が60%相同であり、さらにはもう1つの遺伝子が93%相同であることができる。特定の態様において、実質的な同一性とは、少なくとも約150の核酸残基の、例えば少なくとも約200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800の、例えば少なくとも約900のヌクレオチドの、または例えば少なくとも約1kb、2kb、または例えば少なくとも約3kbの核酸配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、核酸配列は対応するコード領域の全長にわたって同一である。
「低減されたキシラン含有量」という用語は、木質から抽出されうるキシランの量に関するものであり、これはキシラン鎖の長さにも関連しうる。
「木質特異的プロモーター」という用語は、主に維管束組織において発現されるプロモーターである。
遺伝子の発現とは、mRNAがタンパク質または酵素に翻訳される際のプロセスである。遺伝子発現は、転写開始からRNAプロセシングまで様々なレベルに調節されることができる。発現を低減させることによって、タンパク質または酵素による刺激が低減されることが予想される。この文脈において、「発現の低減」という用語は、遺伝子から転写されるRNAを減少させることを指し、これによって、ほとんどの場合、mRNAの量がより少なくなる。この量は、mRNAの定常状態レベルであることができる。
発明の詳細な説明
木質形成の研究において、RNAiの遺伝的アプローチにより、GT43ファミリーにおける全ての遺伝子の発現、または同ファミリーからのこれらの遺伝子の2つまたは3つのクレードの組み合わせの発現を低減させることによって、一連の形質転換ハイブリッドアスペンを作製した。そして予想外にも、これらの形質転換樹木が生長の増加を示し、かつ木質が、弾性率(MOE)において認められるような改善された機械的特性、および以前に見られたものとは相反する3点曲げ試験における曲げ強さ(BS)を示すことが判明した。
木質形成の研究において、RNAiの遺伝的アプローチにより、GT43ファミリーにおける全ての遺伝子の発現、または同ファミリーからのこれらの遺伝子の2つまたは3つのクレードの組み合わせの発現を低減させることによって、一連の形質転換ハイブリッドアスペンを作製した。そして予想外にも、これらの形質転換樹木が生長の増加を示し、かつ木質が、弾性率(MOE)において認められるような改善された機械的特性、および以前に見られたものとは相反する3点曲げ試験における曲げ強さ(BS)を示すことが判明した。
これらの形質転換ハイブリッドアスペンからの木質からのリグノセルロースのさらなる試験において、驚くべきことに、そのような樹木のリグノセルロースは、前処理を行わない試験においてより良好な糖化特性を示すことが判明した。
組織特異的プロモーターの特定
高いレベルでの導入遺伝子の組織特異的発現は、ほとんどの場合、その組織の発達の代謝において望ましい変化を誘導するための最良の戦略である。
高いレベルでの導入遺伝子の組織特異的発現は、ほとんどの場合、その組織の発達の代謝において望ましい変化を誘導するための最良の戦略である。
具体的には、木質の発達において特異的に発現され、かつしばしば用いられるカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターと同程度かまたはこれよりも良好な機能性を示す組織特異的プロモーターが求められている。
木質の発達において高度の発現を駆動する良好なプロモーターをGT43遺伝子ファミリーから特定するために、7種全てのGT43遺伝子の転写レベルを栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化し、かつ検出を容易にするため、全ての遺伝子からのプロモーターをクローン化することによりGUS遺伝子を駆動した。形質転換アスペン株を生成させ、かつGUS発現パターンについて解析した。
木質の発達および師部繊維の発達において、3つのプロモーター、すなわちpGT43A、pGT43BおよびpGT43CについてのGUS活性が認められ、かつ発現パターンは35Sプロモーターと比較してより特異的であった。
全てのGT43プロモーターの配列を配列表に示す。配列番号23〜30における最後の6つの位置は、タンパク質中の2つの最初のアミノ酸に対応している。
GT43遺伝子の選択
GT43A〜GT43Gの遺伝子のコード配列は、異なる樹木において異なる長さを有する。ポプラ属においては、この長さは666(配列番号6)〜1533(配列番号3)の塩基対である。ユーカリ属においては、この長さは1008(配列番号37)〜1509(配列番号36)の塩基対である。これらの遺伝子のいずれかからの断片を選択することができ、この断片は、20〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、800〜900、900〜1000、1000〜1100、1100〜1200、1200〜1300、1300〜1400または1400〜1500の塩基長からこれらの遺伝子のコード配列の全長までであってよく、さらに長いこともできる。
GT43A〜GT43Gの遺伝子のコード配列は、異なる樹木において異なる長さを有する。ポプラ属においては、この長さは666(配列番号6)〜1533(配列番号3)の塩基対である。ユーカリ属においては、この長さは1008(配列番号37)〜1509(配列番号36)の塩基対である。これらの遺伝子のいずれかからの断片を選択することができ、この断片は、20〜50、50〜100、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、800〜900、900〜1000、1000〜1100、1100〜1200、1200〜1300、1300〜1400または1400〜1500の塩基長からこれらの遺伝子のコード配列の全長までであってよく、さらに長いこともできる。
GT43遺伝子は、キシランを合成する全ての植物において認められる。これらの遺伝子から発現されたタンパク質は、キシラン合成に対して同一の効果を示すことが予想される。
その後、7つ全てのGT43遺伝子の転写レベルを、形質転換ハイブリッドアスペンの栄養気中組織中でqRT−PCRにより定量化した。結果を以下の第I表にまとめる。
これらのデータに基づき、栄養組織、木部における発現に基づいて各クレードから1つ、すなわち3つのGT43遺伝子を選択した。木部において高い特異性および/または高い発現レベルを有する遺伝子は、この組織におけるキシラン生合成に大きな影響を与えることが予想される。ハイブリッドアスペンについて、GT43B(クレードI)、GT43E(クレードII)およびGT43C(クレードIII)を選択した。以下の第II表に、本発明により使用されうるユーカリ属からのGT43遺伝子を示す。
形質転換樹木の世代
遺伝子発現を低減または阻害しかつ遺伝子機能を調べるために、遺伝的アプローチであるRNA干渉を用いて形質転換樹木を作製した。RNAiコンストラクトは、通常はRNAの発現を増強しかつ標的とするためにプロモーターによって駆動され、これはその後、活性RNAiヘアピンを形成する。一般的に使用されるプロモーターは、構成的カリフラワー35Sプロモーターである。
遺伝子発現を低減または阻害しかつ遺伝子機能を調べるために、遺伝的アプローチであるRNA干渉を用いて形質転換樹木を作製した。RNAiコンストラクトは、通常はRNAの発現を増強しかつ標的とするためにプロモーターによって駆動され、これはその後、活性RNAiヘアピンを形成する。一般的に使用されるプロモーターは、構成的カリフラワー35Sプロモーターである。
本発明において使用される全てのGT43 RNAiコンストラクトは、35Sプロモーターによって、または新たに特定された特異的な木質プロモーターによって駆動される。本発明においてはいずれのGT43プロモーターも使用されうるが、他のプロモーターも除外されない。好ましいプロモーターは、GT43B由来のプロモーターである。
コンストラクトとも呼ばれる様々な発現ベクターの1セットを遺伝的に作製した。それらの各々は、GT43遺伝子ファミリーから選択された遺伝子からの1つのプロモーター、1つ、2つまたは3つの断片を含む。同一の遺伝子断片を操作により逆方向にクローン化し、このクローン化された遺伝子断片の逆方向反復配列を形成した(図2)。
GT43遺伝子のうちの3つ;GT43B、配列番号2;GT43C、配列番号3;およびGT43E、配列番号5、並びにそれらの二重(GT43BC、GT43BE、GT43CE)および三重(GT43BEC)の組み合わせを選択し、これらをRNAiの標的とした。作製した全てのコンストラクトを構成的カリフラワー35S(35S)プロモーターまたは木質特異的(WP)プロモーターに作動可能に連結し、かつハイブリッドアスペン(ヤマナラシ(Populus tremula × tremuloides))に形質転換した。
これらのコンストラクトを、一度に1つのクレード、2つのクレードまたは3つ全てのクレードが抑制されるように作製した。逆方向反復配列の7種全てを35SプロモーターまたはWPプロモーターのいずれかによって駆動し、これにより14のコンストラクトが生成され、これらをハイブリッドアスペンクローンT89に移した。これらのコンストラクトについてはさらに、以下の実施例の部において説明する。
これらの14のコンストラクトで形質転換された形質転換ハイブリッドアスペン株において発現されたRNAを調べ、かつGT43遺伝子の転写レベルを、コンストラクト1つ当たり3つの株の木質からのサンプルにおいて、それぞれ3つのバイオロジカルレプリケートを用いてqRT−PCRによって測定した。結果(第III表)は様々なコンストラクトによるGT43遺伝子の転写の低減を示しており、これは野生型レベルの35〜75%である。
様々な発現レベルについての詳細を、図7に示す。
WP::GT43BC RNAi株における遺伝子調節ネットワークの解明と、これらの形質転換株において認められる形成層細胞分裂の増加についての説明とを目的として、RNAの塩基配列決定を用いた木質の発達におけるトランスクリプトーム解析を行った。標的となるGT43転写産物がGT43BC RNAi株において野生型に比べて減少していること(図8)、そして本発明者らのqRT−PCR実験において減少が認められること(図7)が確認された。IRX9クレードおよびIRX14クレードに属する4つ全ての遺伝子のメンバー、すなわちGT43A、GT43B、GT43CおよびGT43Dが、GT43BC RNAiコンストラクトを含む樹木において成功裏にダウンレギュレートされている(図8)。クレードIRX9−LからのGT43EおよびGT43GはRNA干渉に影響を受けなかった。これにより、RNAiコンストラクトの特異性が立証される。キシラン主鎖、還元末端配列形成およびアセチル化に関与するGT43ファミリー以外のさらなるキシラン生合成関連遺伝子に着目すると、このような遺伝子は概して、野生型に比べGT43BC RNAi株において転写レベルが低下した(図8)。
さらに、GT43BC RNAi株における最もダウンレギュレートされた遺伝子の中に、二次細胞壁形成に関連するいくつかの遺伝子、例えばMYB転写因子、セルロースおよびリグニン生合成遺伝子、並びに糖代謝に関与する遺伝子が存在することが判明した。対照的に、最もアップレギュレートされた遺伝子の中に、本発明者らは、形成層の維持および初期の木部分化に関与する因子を発見した。従って、GT43発現の低減によって、細胞壁の生合成機構のダウンレギュレーションと、形成層の機能に関与する調節因子のアップレギュレーションとが生じる。
形質転換樹木の生長
形質転換株の生長を温室実験で評価した。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの1つであるWP駆動型GT43BCにおいて生長が予想外に高く、これにより、非形質転換ハイブリッドアスペンと比較して140%の体積増加が生じた。この高度の生長の増加は、ユーカリ属、アカシア属およびヤナギ属にも該当することが予想される。
形質転換株の生長を温室実験で評価した。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの1つであるWP駆動型GT43BCにおいて生長が予想外に高く、これにより、非形質転換ハイブリッドアスペンと比較して140%の体積増加が生じた。この高度の生長の増加は、ユーカリ属、アカシア属およびヤナギ属にも該当することが予想される。
さらに、コンストラクトGT43Cは、植物の高さ、幹直径および体積への影響に関して、プロモーター間で有意な差を示した。WPプロモーターによって駆動されるコンストラクトGT43Cによって、非形質転換ハイブリッドアスペンと比較して120%の増加が認められたが、これに対して35Sプロモーターにより駆動される場合にはわずか85%であった。これら全てのケースにおいて、35S駆動型コンストラクトよりもWP駆動型コンストラクトによって生長が刺激された。
木質生成の増加によって、WPプロモーター株を有するコンストラクトGT43BCにおいて生長の増加が生じるかどうかを調べるために、幹切片を顕微鏡で調べ、かつ髄の半径、木部および樹皮の半径方向の幅を測定した。これらの形質転換株は3つ全ての組織の増加された量を有していたが、木部の厚さにおいて最も高い増加が認められ、これは平均で22%を上回る増加であった。
形質転換株における木質の機械的特性
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。
キシランが損なわれたポプラ、すなわち減少されたキシラン量を有するポプラは、低減された木質機械的強度を有することが知られている(Li et al. (2011) Tree Physiol. 31: 226−236)。従って、形質転換株の木質を、3点曲げ試験において曲げ弾性率(MOE)および曲げ強さ(BS)について分析した。驚くべきことに、2つの異なる樹木株において試験した場合に、WPプロモーターを有するコンストラクトGT43BCからの木質は、双方の形質転換株においてMOEがより高く、かつBSがより高いことが判明した。これらの改善された機械的特性は3点曲げ試験における曲げ強さによっても裏付けられ、これは野生型と比較して11〜18%増加した(詳細については実施例8を参照)。
高弾性率は、試験された材料がより高剛性であって、かつこれを弾性(非永続的に)変形させるのにより多くの力を必要とすることを意味する。一方で、曲げ強さは、破断の瞬間に材料に加えられた力を表す。従って、形質転換樹木における高い曲げ強さは、木質の高レジリエンスを示唆する。
形質転換株における細胞壁の分析
任意の細胞壁変化の性質を調べるために、形質転換株の木質およびWTをFT−IRにより分析した。有意な変化は検出されなかった。
任意の細胞壁変化の性質を調べるために、形質転換株の木質およびWTをFT−IRにより分析した。有意な変化は検出されなかった。
形質転換株BC1、BC2およびBEC1の木質並びにWTにおける中性および酸性の糖組成を、単糖類組成の変化についてTMS分析により調べた。大きな変化は検出されなかった。
さらに、木質細胞壁からヘミセルロースを抽出し、これを特にキシランを分析するためにキシラナーゼで消化した。次いで、放出されたオリゴマーをポリアクリルアミド炭水化物ゲル電気泳動(PACE)により分離し、かつ染色によりシグナルを定量化した。相対キシラン鎖長を、還元末端配列からのシグナルとキシロオリゴマーからのシグナルとの比により決定した。この分析によって、WPプロモーター株を有するコンストラクトGT43BCにおいて、キシラン鎖長がWTと比較して10%減少していることが明らかになった。
形質転換ハイブリッドアスペン株の糖化分析
WPプロモーターを有するコンストラクトGT43BCを用いたアスペンの木質の糖化を、2つの異なるアプローチ用いて調べた:(i)前処理なしでの酵素による加水分解、並びに(ii)前処理およびそれに続く酵素による加水分解。前処理を、高められた温度を用いかつ酸触媒[1%(w/w)硫酸]を添加して行った。単糖類の収率を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定した。形質転換アスペン株は、野生型と比較して改善されたグルコース生成速度および改善されたグルコース収率を示した。
WPプロモーターを有するコンストラクトGT43BCを用いたアスペンの木質の糖化を、2つの異なるアプローチ用いて調べた:(i)前処理なしでの酵素による加水分解、並びに(ii)前処理およびそれに続く酵素による加水分解。前処理を、高められた温度を用いかつ酸触媒[1%(w/w)硫酸]を添加して行った。単糖類の収率を、高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定した。形質転換アスペン株は、野生型と比較して改善されたグルコース生成速度および改善されたグルコース収率を示した。
図4に、前処理なしの糖化実験からの結果を示す。図4に、酵素による加水分解後の単糖類の収率(および標準偏差)を示す。これらの結果は、形質転換アスペン(BC1およびBC2)のグルコース収率の有意な増加を示す(P≦5%、t検定)。このグルコース収率の増加は、BC1については27%に相当し、かつBC2については40%に相当し、これは予想外に高い。前処理とそれに続く酵素による加水分解からの結果を、図5に示す。野生型と形質転換アスペン(BC1およびBC2)とを比較した場合に、有意な差は検出されなかった(P≦5%、t検定)。
総括
これらのデータは、二次壁を形成する細胞において特異的に変化が誘導されることを前提条件として、木本植物におけるキシランの生合成のわずかな減少が植物に数多くの好影響をもたらすことを示している。このことは、遺伝子GT43Bからの木質特異的プロモーター(WP)を使用することによって達成される。次のような形質転換RNAi株、すなわち、キシラン合成遺伝子GT43BおよびGT43CがWTの約50〜60%にダウンレギュレートされているが、ただしこれはWPプロモーターの制御下に二次壁形成組織において特異的であるものとする形質転換RNAi株は、キシロース含有量のわずか約3〜5%の減少、およびキシラン鎖長の約10%の減少を示した。そのような株は予想外により良好に生長し、30〜40%高い幹体積、約30%増加された弾力率(MOE)、および前処理なしでの糖化における約30〜40%高いグルコース収率を示した。このようなリグノセルロースの改善されたバイオプロセシング特性の発酵が期待されることができ、これは発酵において有用でありうる。
これらのデータは、二次壁を形成する細胞において特異的に変化が誘導されることを前提条件として、木本植物におけるキシランの生合成のわずかな減少が植物に数多くの好影響をもたらすことを示している。このことは、遺伝子GT43Bからの木質特異的プロモーター(WP)を使用することによって達成される。次のような形質転換RNAi株、すなわち、キシラン合成遺伝子GT43BおよびGT43CがWTの約50〜60%にダウンレギュレートされているが、ただしこれはWPプロモーターの制御下に二次壁形成組織において特異的であるものとする形質転換RNAi株は、キシロース含有量のわずか約3〜5%の減少、およびキシラン鎖長の約10%の減少を示した。そのような株は予想外により良好に生長し、30〜40%高い幹体積、約30%増加された弾力率(MOE)、および前処理なしでの糖化における約30〜40%高いグルコース収率を示した。このようなリグノセルロースの改善されたバイオプロセシング特性の発酵が期待されることができ、これは発酵において有用でありうる。
4つのGT43メンバー(GT43A、GT43B、GT43CおよびGT43D)のダウンレギュレーションによって、成長の増加が引き起こされる
IRX9(GT43AおよびGT43B)クレードとIRX14(GT43CおよびGT43D)クレードとの双方を標的とするGT43BC断片を含むpGT43B駆動型RNAiコンストラクトは、他のRNAiコンストラクトと比較して成長に最も好影響を与えた(図3)。各クレードにおける主要な遺伝子であるGT43BおよびGT43Cの発現レベルは、2つの最良の株であるGT43BC1およびGT43BC2における野生型レベルのそれぞれ約35%および55%であった(図7)。これらの株の植物の高さおよび幹直径は野生型レベルの10〜20%増加し、これによって幹体積が50〜60%増加した(図6)。また、節間数、節間長および葉のサイズも約10%増加した。温室内での成長実験を、類似の結果を有する2つのGT43BC株1および2について、ランダム化された植物位置で3回繰り返した。
IRX9(GT43AおよびGT43B)クレードとIRX14(GT43CおよびGT43D)クレードとの双方を標的とするGT43BC断片を含むpGT43B駆動型RNAiコンストラクトは、他のRNAiコンストラクトと比較して成長に最も好影響を与えた(図3)。各クレードにおける主要な遺伝子であるGT43BおよびGT43Cの発現レベルは、2つの最良の株であるGT43BC1およびGT43BC2における野生型レベルのそれぞれ約35%および55%であった(図7)。これらの株の植物の高さおよび幹直径は野生型レベルの10〜20%増加し、これによって幹体積が50〜60%増加した(図6)。また、節間数、節間長および葉のサイズも約10%増加した。温室内での成長実験を、類似の結果を有する2つのGT43BC株1および2について、ランダム化された植物位置で3回繰り返した。
より強力な木質およびより低い密度
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。しかし、そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。GT43BおよびGT43Cの低減された発現レベルを有する形質転換ハイブリッドアスペンの木質の機械的特性を、次のように試験した。キシラン生合成において十分な機能を果たさない植物の公開されている表現型に基づき、本発明者らは、成熟した木質から慎重に作製された試験体における3点曲げアプローチにおいて、木質の機械的強度が低いことを予想していた(Lee et al., 2011; Li et al., 2011)。驚くべきことに、本発明者らは、試験されたGT43BC RNAi株の木質が、野生型と比較してより高い弾性率とより高い曲げ強さのいずれをも有することを見出した(図5)。高弾性率は、試験された材料がより高剛性であって、かつこれを弾性(非永続的に)変形させるのにより多くの力を必要とすることを意味する。一方で、曲げ強さは、破断の瞬間に材料に加えられた力を表す。従って、形質転換樹木における高い曲げ強さは、木質の高レジリエンスを示唆する。
産業用途では、より高いバイオマス収率を有する樹木が有用である。しかし、そのような樹木が比較的脆く、従って生物的および非生物的ストレスによって損傷を受け易い場合には、これらは競争力を有しない。GT43BおよびGT43Cの低減された発現レベルを有する形質転換ハイブリッドアスペンの木質の機械的特性を、次のように試験した。キシラン生合成において十分な機能を果たさない植物の公開されている表現型に基づき、本発明者らは、成熟した木質から慎重に作製された試験体における3点曲げアプローチにおいて、木質の機械的強度が低いことを予想していた(Lee et al., 2011; Li et al., 2011)。驚くべきことに、本発明者らは、試験されたGT43BC RNAi株の木質が、野生型と比較してより高い弾性率とより高い曲げ強さのいずれをも有することを見出した(図5)。高弾性率は、試験された材料がより高剛性であって、かつこれを弾性(非永続的に)変形させるのにより多くの力を必要とすることを意味する。一方で、曲げ強さは、破断の瞬間に材料に加えられた力を表す。従って、形質転換樹木における高い曲げ強さは、木質の高レジリエンスを示唆する。
植物種
他の木質樹木からのGT43オルソロガス遺伝子の発現が低減される場合、これは、改善された生長、機械的特性および糖化をもたらすことが大いに予想される。
他の木質樹木からのGT43オルソロガス遺伝子の発現が低減される場合、これは、改善された生長、機械的特性および糖化をもたらすことが大いに予想される。
本発明によれば、形質転換樹木は、好ましくは木質樹木または木質種である。有用な一実施形態において、木質樹木は、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、ウォールナット、オーク、アッシュ、ヤナギ、ヒッコリー、カバノキ、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシの木およびスイートガムからなる群から選択されうる広葉樹木である。ヤナギ科ファミリーからの広葉樹木、例えばヤナギ、ポプラおよびアスペン(それらの変種を含む)が特に重要であり、それというのも、これら2つのグループは生長の早い樹木または木質低木の種を含んでおり、これらは特に材木またはバイオ燃料を提供するために生長されるためである。
さらなる実施形態において、木質樹木は、ヒノキ、ベイマツ、モミ、セコイア、ツガ、スギ、トショウ、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイからなる群から選択されうる針葉樹である。
有用な実施形態において、木質樹木は、リンゴ、プラム、ナシ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウおよびイチジクからなる群から選択されうる結実植物である。
実施例
実施例1:GT43遺伝子ファミリーからの木質特異的プロモーターのクローン化
木質の発達において高度に発現されるGT43遺伝子ファミリーからの良好なプロモーターを特定するために、7つ全ての遺伝子の転写レベルを栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化した。7つ全てのプロモーターおよびWP(配列番号23〜30)をクローン化し、かつ35SプロモーターをGATEWAYカセットベクターにクローン化し、検出を容易にするためにこれにGUS遺伝子が続き、それにより8つの異なるコンストラクトが生じた。クローン化されたプロモーターの配列は、配列番号23〜30として示されている。
実施例1:GT43遺伝子ファミリーからの木質特異的プロモーターのクローン化
木質の発達において高度に発現されるGT43遺伝子ファミリーからの良好なプロモーターを特定するために、7つ全ての遺伝子の転写レベルを栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化した。7つ全てのプロモーターおよびWP(配列番号23〜30)をクローン化し、かつ35SプロモーターをGATEWAYカセットベクターにクローン化し、検出を容易にするためにこれにGUS遺伝子が続き、それにより8つの異なるコンストラクトが生じた。クローン化されたプロモーターの配列は、配列番号23〜30として示されている。
9つのpGT43::GUS融合コンストラクトをハイブリッドアスペンにおいて安定的に発現させ、かつ樹齢2カ月の温室生長樹木の幹を、GUS活性について組織化学的に分析した。
GT43Aプロモーター、GT43BプロモーターおよびWPプロモーターについての染色が、木部および師部繊維の発達において認められる。対照的に、GT43Cプロモーター、GT43DプロモーターおよびGT43Eプロモーターの活性は、師部柔組織中に存在する。それに対して35Sプロモーターの活性は、樹皮において、並びに木質および放射組織細胞の発達において検出された。
コンストラクトWP::GUSが最も特異的なプロモーターを有することが判明し、かつこのプロモーターをさらなる研究のために選択した。
遺伝的に木質を変更するためのWPプロモーターの有効性を試験するために、WPプロモーターまたは35Sプロモーターのいずれかを使用したRNAiコンストラクトを、2つの異なる遺伝子ファミリーにおいて作製し、これにより特定のファミリーメンバーをダウンレギュレートした。
実施例2:非形質転換ハイブリッドアスペンにおける7つ全てのGT43遺伝子の転写レベル
7つ全てのGT43遺伝子についてのハイブリッドアスペン(ヤマナラシ)の栄養組織における転写レベルを、栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化した。結果を上記の第I表にまとめる。
7つ全てのGT43遺伝子についてのハイブリッドアスペン(ヤマナラシ)の栄養組織における転写レベルを、栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化した。結果を上記の第I表にまとめる。
mRNA転写産物の7つ全ての遺伝子を、栄養気中組織においてqRT−PCRにより定量化した。異なる遺伝子の発現レベルの比較を可能にする正規化されていない発現に基づいて次のことが判明し、すなわち、遺伝子GT43CおよびGT43Eが木質の発達において最も高度に発現され、これに遺伝子GT43BおよびGT43Aが続くことが判明した。この組織においては、GT43FおよびGT43Gの発現は検出されなかった。
高度に発現された遺伝子のうち、次の3つの遺伝子が特に木質、木部およびテンションウッドの発達において発現されることが判明した:GT43A、GT43BおよびGT43C。GT43AおよびGT43Bの発現は、GT43Cの発現よりも、より木質特異的であった。
実施例3:ハイブリッドアスペンにおける形質転換株
各クレードに関して最も重要な遺伝子の、すなわちクレードIについてはGT43B、クレードIIからはGT43E、およびクレードIIIについてはGT43Cの、クレード特異的配列を使用して、GT43クレードの各々を抑制するように設計されたハイブリッドアスペンにおいて形質転換株を作製した。その後、これらの断片を組み合わせることにより、一度に2つのクレードまたは3つ全てのクレードを抑制した。逆方向反復配列の7つ全ての種類をCMV35SプロモーターまたはWPプロモーターのいずれかにより駆動し、これにより14のコンストラクトが生じ、これらをクローンT89に移した。
各クレードに関して最も重要な遺伝子の、すなわちクレードIについてはGT43B、クレードIIからはGT43E、およびクレードIIIについてはGT43Cの、クレード特異的配列を使用して、GT43クレードの各々を抑制するように設計されたハイブリッドアスペンにおいて形質転換株を作製した。その後、これらの断片を組み合わせることにより、一度に2つのクレードまたは3つ全てのクレードを抑制した。逆方向反復配列の7つ全ての種類をCMV35SプロモーターまたはWPプロモーターのいずれかにより駆動し、これにより14のコンストラクトが生じ、これらをクローンT89に移した。
各コンストラクト当たり約20の独立した株をin vitroで事前選別することによって、最も影響を受けた3つの株を選択し、これらをWTと一緒に繁殖させ、かつ温室内に植えた。
実施例4:形質転換株の木質におけるGT43遺伝子の発現の分析
選択された形質転換株の木質における様々なGT43遺伝子の発現レベルを、qRT−PCRによって測定した。この分析によって、形質転換株の木質において標的遺伝子の発現が平均でWTレベルの35%〜75%に減少したこと、そして、コンストラクトにおいて使用されるプロモーターに応じたダウンレギュレーションレベルの差はなかったことが判明した。
選択された形質転換株の木質における様々なGT43遺伝子の発現レベルを、qRT−PCRによって測定した。この分析によって、形質転換株の木質において標的遺伝子の発現が平均でWTレベルの35%〜75%に減少したこと、そして、コンストラクトにおいて使用されるプロモーターに応じたダウンレギュレーションレベルの差はなかったことが判明した。
実施例5:形質転換株の成長
形質転換株の成長を温室実験で評価した。それぞれ5つの樹木により表される全ての形質転換株を、温室内で約3カ月間成長させた。形質転換植物およびWT植物を温室の成長室に均一に分配し、かつこの室内の微小環境の影響を排除するためにローテーションを行った。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの全ての効果を考慮すると、35Sプロモーター駆動型コンストラクトは、コンストラクトBCにおける葉数および節間長の増加を除いて、成長に影響を与えなかった(第IV表)。これとは対照的に、WP駆動型コンストラクトは、コンストラクトBCおよびECにおける高さ、コンストラクトECにおける葉数、コンストラクトB、BCおよびECにおける幹直径および幹体積を高めた。最大の効果はコンストラクトBCにおける体積において観察され、これはWT体積の140%に達した。コンストラクトCは植物の高さ、幹直径および幹体積に対する効果に関してプロモーター間で有意差を示し、かつコンストラクトECは幹直径および幹体積に関してプロモーター間で有意差を示した。これら全てのケースにおいて、成長は35S駆動型コンストラクトよりもWP駆動型コンストラクトにより刺激された。
形質転換株の成長を温室実験で評価した。それぞれ5つの樹木により表される全ての形質転換株を、温室内で約3カ月間成長させた。形質転換植物およびWT植物を温室の成長室に均一に分配し、かつこの室内の微小環境の影響を排除するためにローテーションを行った。植物の高さ、幹直径、節間数および節間長を測定した。コンストラクトの全ての効果を考慮すると、35Sプロモーター駆動型コンストラクトは、コンストラクトBCにおける葉数および節間長の増加を除いて、成長に影響を与えなかった(第IV表)。これとは対照的に、WP駆動型コンストラクトは、コンストラクトBCおよびECにおける高さ、コンストラクトECにおける葉数、コンストラクトB、BCおよびECにおける幹直径および幹体積を高めた。最大の効果はコンストラクトBCにおける体積において観察され、これはWT体積の140%に達した。コンストラクトCは植物の高さ、幹直径および幹体積に対する効果に関してプロモーター間で有意差を示し、かつコンストラクトECは幹直径および幹体積に関してプロモーター間で有意差を示した。これら全てのケースにおいて、成長は35S駆動型コンストラクトよりもWP駆動型コンストラクトにより刺激された。
個々の株における成長のばらつきについても調べたところ、WPプロモーターを用いて作製されたほとんどの株はWTよりも優れていた。
成長効果が経時的に安定していることを保証するため、別個の温室実験を、選択された2つの株であるWP:RNAi GT43 BC1およびWP:RNAi GT43 BC2を用いて2カ月間にわたって行った。成長において類似の変化が観察された。
実施例6:形質転換ポプラにおける木質形成
木質生成の増加によって、WP:RNAi GT43BC株における幹直径の増加が生じるかどうかを調べるために、幹切片を顕微鏡で調べ、かつ髄の半径、木部および樹皮の半径方向の幅を測定した。これらの形質転換株は3つ全ての組織の増加された量を有していたが、木部の厚さにおいて最も高い増加が認められ、これは平均で+22%であった(第V表)。顕微鏡で半径方向の幅を幹横断面において測定した。P値は、ポストANOVAの対比に相当する。
木質生成の増加によって、WP:RNAi GT43BC株における幹直径の増加が生じるかどうかを調べるために、幹切片を顕微鏡で調べ、かつ髄の半径、木部および樹皮の半径方向の幅を測定した。これらの形質転換株は3つ全ての組織の増加された量を有していたが、木部の厚さにおいて最も高い増加が認められ、これは平均で+22%であった(第V表)。顕微鏡で半径方向の幅を幹横断面において測定した。P値は、ポストANOVAの対比に相当する。
実施例7:繊維幅
木部繊維が大きくなることによって木部幅の増加が生じるかどうかを調べるために、形質転換株およびWTの木質を離解させ、かつこの繊維を顕微鏡で測定した。これらの株のうちの一方においては繊維幅がわずかに増加し、すなわち株BC2において7%増加したが、このことは、この株において木部の半径方向の幅が27%増加したことの要因とはなりえなかった(第V表および第VI表を比較)。より大きな木部、すなわち+17%の木部を有していたBC1株においては、繊維幅の変化は認められなかった。本発明者らは、形質転換株がより多くの木部細胞を生成し、このことが幹直径の増加の主要因であると結論付ける。形質転換株において、光学顕微鏡法によって木部異常は検出されなかった。
木部繊維が大きくなることによって木部幅の増加が生じるかどうかを調べるために、形質転換株およびWTの木質を離解させ、かつこの繊維を顕微鏡で測定した。これらの株のうちの一方においては繊維幅がわずかに増加し、すなわち株BC2において7%増加したが、このことは、この株において木部の半径方向の幅が27%増加したことの要因とはなりえなかった(第V表および第VI表を比較)。より大きな木部、すなわち+17%の木部を有していたBC1株においては、繊維幅の変化は認められなかった。本発明者らは、形質転換株がより多くの木部細胞を生成し、このことが幹直径の増加の主要因であると結論付ける。形質転換株において、光学顕微鏡法によって木部異常は検出されなかった。
実施例8:形質転換株からの木質の機械的特性
キシランが損なわれたポプラは、低減された木質機械的強度を有することが知られている。従って、形質転換株の木質を、規格CSN EN 384、標題”Structural timber − Determination of characteristic values of mechanical properties and density”(www.en−standard.eu/csn−en−384−structural−timber−determination−of−characteristic−values−of−mechanical−properties−and−density/)により曲げ弾性率(MOE)および破壊強さについて、または3点曲げ試験(Esteves, B. M, Domingos, I.J. & Pereira, H.M. 2008. Heat treatment of pine wood. BioResources 3(1), 142−154)において曲げ強さについて分析した。これによって、双方の形質転換株においてより高いMOEが明らかとなり(第VII表)、かつ双方の株において総合してより高い曲げ強さが明らかとなった(第VIII表)。パーセンテージは、t検定によるWTとの有意な差を%で示したもの(P≦5%)である。確率値は、ポストANOVAの対比に相応する。
キシランが損なわれたポプラは、低減された木質機械的強度を有することが知られている。従って、形質転換株の木質を、規格CSN EN 384、標題”Structural timber − Determination of characteristic values of mechanical properties and density”(www.en−standard.eu/csn−en−384−structural−timber−determination−of−characteristic−values−of−mechanical−properties−and−density/)により曲げ弾性率(MOE)および破壊強さについて、または3点曲げ試験(Esteves, B. M, Domingos, I.J. & Pereira, H.M. 2008. Heat treatment of pine wood. BioResources 3(1), 142−154)において曲げ強さについて分析した。これによって、双方の形質転換株においてより高いMOEが明らかとなり(第VII表)、かつ双方の株において総合してより高い曲げ強さが明らかとなった(第VIII表)。パーセンテージは、t検定によるWTとの有意な差を%で示したもの(P≦5%)である。確率値は、ポストANOVAの対比に相応する。
実施例9:形質転換株における細胞壁の分析
任意の細胞壁の変化の性質を調べるために、形質転換株およびWTの木質をFT−IRにより分析した。WP:GT43BC RNAi株とWTとの間に有意な変化は検出されなかった(データ示さず)。
任意の細胞壁の変化の性質を調べるために、形質転換株およびWTの木質をFT−IRにより分析した。WP:GT43BC RNAi株とWTとの間に有意な変化は検出されなかった(データ示さず)。
形質転換株BC1、BC2およびBEC1の木質並びにWTにおける中性および酸性の糖組成を、TMS分析により調べた。大きな変化は検出されなかった。キシロースおよびMe−Glc Aにおいてわずかな差が認められ、最大で5%のキシラン含有量の減少が示され、これはAraの減少およびGlcの増加を伴っていた。
実施例10:キシラン分析
さらに、WP:GT43BC RNAiコンストラクトからの2つの樹木株からの木質細胞壁からヘミセルロースを抽出し、かつ特にキシランを分析するためにキシラナーゼで消化した。次いで、放出されたオリゴマーをポリアクリルアミド炭水化物ゲル電気泳動(PACE)により分離し、かつ染色によりシグナルを定量化した。相対キシラン鎖長を、還元末端配列からのシグナルとキシロオリゴマーからのシグナルとの比により決定した(第IX表)。この分析によってキシラン鎖長のわずかな減少が明らかとなり、この減少分は、より多くの影響を受けた株WP:GT43BC2 RNAiにおいて、WTと比較して13%であった。P値は、形質転換株とWTとの対比に相当する。
さらに、WP:GT43BC RNAiコンストラクトからの2つの樹木株からの木質細胞壁からヘミセルロースを抽出し、かつ特にキシランを分析するためにキシラナーゼで消化した。次いで、放出されたオリゴマーをポリアクリルアミド炭水化物ゲル電気泳動(PACE)により分離し、かつ染色によりシグナルを定量化した。相対キシラン鎖長を、還元末端配列からのシグナルとキシロオリゴマーからのシグナルとの比により決定した(第IX表)。この分析によってキシラン鎖長のわずかな減少が明らかとなり、この減少分は、より多くの影響を受けた株WP:GT43BC2 RNAiにおいて、WTと比較して13%であった。P値は、形質転換株とWTとの対比に相当する。
実施例11:形質転換株の糖化分析
アスペンの木質の糖化を、2つの異なるアプローチを用いて調べた:(i)前処理なしでの酵素による加水分解(図4)、並びに(ii)前処理およびそれに続く酵素による加水分解(図5)。前処理を、高められた温度および酸触媒[1%(w/w)硫酸]を用いて行った。前処理後に、前処理液と呼ばれる液体画分を固体残渣から分離した。その後、この固体残渣を酵素調製物を用いて分解した。単糖類の収率(アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースの収率)を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて調べた。
アスペンの木質の糖化を、2つの異なるアプローチを用いて調べた:(i)前処理なしでの酵素による加水分解(図4)、並びに(ii)前処理およびそれに続く酵素による加水分解(図5)。前処理を、高められた温度および酸触媒[1%(w/w)硫酸]を用いて行った。前処理後に、前処理液と呼ばれる液体画分を固体残渣から分離した。その後、この固体残渣を酵素調製物を用いて分解した。単糖類の収率(アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースの収率)を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて調べた。
酸前処理なしでの結果(図4)は、形質転換アスペン(BC1およびBC2)のグルコース収率の有意な増加(P≦5%、t検定)を示す。グルコース収率の増加は、BC1については27%に相当し、かつBC2については40%に相当する。酸前処理を行った場合には(図5)、形質転換アスペン(BC1およびBC2)と野生型とを比較した場合に、有意差は検出されなかった(P≦5%、t検定)。
Claims (29)
- 同一種の野生型樹木に比べて低減されたキシラン含有量を有する形質転換樹木を製造するための方法であって、該方法は、該形質転換樹木においてグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減させることを含み、その際、該形質転換樹木は、同一種の野生型樹木に比べて、生長特性の向上および改善された機械的特性および/または糖化特性を示すものとする前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって、次のステップ:
(a)樹木細胞に発現ベクターを導入するステップであって、ここで、該発現ベクターは次のものを含むものとする:
(i)少なくとも1つのプロモーター;
(ii)該プロモーターの下流に作動可能に連結されたGT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
(iii)該第1のヌクレオチド配列と相補的であってかつ該第1のヌクレオチド配列の下流に作動可能に連結された、第2のヌクレオチド配列;
その際、これらの連結されたヌクレオチド配列は細胞内でRNAへ転写され、それによってヘアピンRNAが生成され、該ヘアピンRNAが該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子が、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子の発現を低減することができるものとする;および
(b)ステップ(a)における樹木細胞を培養して形質転換樹木とするステップ
を含む、前記方法。 - 請求項2に記載の方法であって、プロモーターが木質特異的プロモーターであり、該木質特異的プロモーターが二次壁生合成の間にアップレギュレートされる、前記方法。
- 請求項3に記載の方法であって、木質特異的プロモーターが、GT43プロモーター;二次壁CesAプロモーター;RWAプロモーター、特にシロイヌナズナ属のRWA1プロモーター、RWA3プロモーターまたはRWA4プロモーターに相同のプロモーター;シロイヌナズナ属のIRX10プロモーターに相同のプロモーター;GUX1プロモーターまたはGUX2プロモーター;AtFRA8プロモーター、AtIRX8プロモーター/またはAtPARVUSプロモーター;AtXyn1プロモーター;AtTBL29プロモーターからなる群から選択される、前記方法。
- 請求項4に記載の方法であって、木質特異的プロモーターが、配列番号25として示されるヌクレオチド配列を含むGT43Bプロモーターであるか、または配列番号23として示されるヌクレオチド配列を含むGT43B由来のWPプロモーターである、前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって、形質転換樹木の木質の発達において、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子から転写されるmRNAのレベルが、同一種の野生型樹木において転写されるmRNAの対応するレベルの25%〜85%である、前記方法。
- 請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法であって、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子が、次のもの:
(a)次のものからなるコットンウッド(Populus trichocarpa)遺伝子の群:
GT43A(配列番号1)、
GT43B(配列番号2)、
GT43C(配列番号3)、
GT43D(配列番号4)、
GT43E(配列番号5)、
GT43F(配列番号6)、
GT43G(配列番号7);
(b)(a)におけるコットンウッド遺伝子とオルソロガスであってかつ(a)における遺伝子との配列同一性が少なくとも80%である、遺伝子
から選択される、前記方法。 - 請求項7に記載の方法であって、(b)におけるオルソロガス遺伝子が、ユーカリ属、アカシア属またはヤナギ属から選択される種から選択される、前記方法。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法であって、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子が、次のもの:
GT43B(配列番号2)、
GT43C(配列番号3)、および
GT43E(配列番号5)
からなる群から選択される、前記方法。 - 請求項9に記載の方法であって、GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子が、次のもの:
GT43B(配列番号2)、および
GT43C(配列番号3)
からなる群から選択される、前記方法。 - 請求項10に記載の方法であって、GT43BおよびGT43Cの双方の発現の低減か、または、3つのGT43遺伝子、すなわちGT43B、GT43CおよびGT43Eの発現の低減を含む、前記方法。
- 生長の増加を示す形質転換樹木を製造するための、請求項1から11までのいずれか1項に記載の方法。
- 請求項12に記載の方法であって、生長の増加が、高さの増加、幹直径の増加、幹体積の増加、節間長の増加および葉数の増加から選択される1つ以上の特徴により特徴付けられる、前記方法。
- 改善された機械的特性を示す形質転換樹木を製造するための、請求項1から13までのいずれか1項に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法であって、改善された機械的特性が、弾性率の増加および/または曲げ強さの増加を含む、前記方法。
- 請求項1から15までのいずれか1項に記載の方法であって、加水分解された木質からの単糖類の収率が同一種の野生型樹木からの木質に比べて増加している前記形質転換樹木を製造するための、前記方法。
- 請求項16に記載の方法であって、単糖類が、アラビノース、ガラクトース、グルコース、キシロースおよびマンノースからなる群から選択される、前記方法。
- 請求項1から17までのいずれか1項に記載の方法により得られ得る、形質転換樹木。
- 請求項18に記載の形質転換樹木であって、ポプラ属、アカシア属、ヤナギ属またはユーカリ属から選択される属の樹木である、前記形質転換樹木。
- 次のもの:
(i)木質の発達において活性である木質特異的プロモーター;
(ii)少なくとも1つの遺伝子であって、任意にグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)遺伝子ファミリーから選択された少なくとも1つの遺伝子
を含む発現ベクター。 - 請求項20に記載の発現ベクターであって、
次のもの:
i.少なくとも1つのプロモーター;
ii.GT43ファミリーからの1つ以上の遺伝子を含む第1のヌクレオチド配列;および
iii.該第1のヌクレオチド配列と相補的な第2のヌクレオチド配列;
を含み、
その際、これらのヌクレオチド配列は樹木細胞内でヘアピンRNA構造へ転写されることが可能であり、該ヘアピンRNA構造が該細胞内でプロセシングされて干渉RNA分子となり、該干渉RNA分子はGT43遺伝子の発現を低減することができるものとする、前記発現ベクター。 - 請求項21に記載の発現ベクターであって、プロモーターがGT43Bプロモーターである、前記発現ベクター。
- 請求項20から22までのいずれか1項に記載の発現ベクターであって、該発現ベクターがさらに、転写因子結合部位、スプライス部位および終結部位からなる群から選択される1つ以上の調節要素を含む、前記発現ベクター。
- 請求項20から23までのいずれか1項に記載の発現ベクターであって、第1のヌクレオチド配列が、GT43ファミリーからの2つまたは3つの遺伝子を含む、前記発現ベクター。
- 請求項24に記載の発現ベクターであって、2つの遺伝子がGT43BおよびGT43Cであるか、または3つの遺伝子がGT43B、GT43CおよびGT43Eである、前記発現ベクター。
- 遺伝子の、好ましくはグリコシルトランスフェラーゼ43(GT43)遺伝子ファミリーから選択される遺伝子の、発現増加のためのまたはダウンレギュレーションのための、請求項20から25までのいずれか1項に記載の発現ベクターの使用。
- 請求項20から25までのいずれか1項に記載の発現ベクターを含む、形質転換樹木。
- 請求項18、19または27のいずれか1項に記載の形質転換樹木から得られる、木質。
- 次のこと:
(a)請求項28に記載の木質を準備すること;
(b)該木質を分解すること;および
(c)遊離単糖類を得ること
を含む、木質から単糖類を製造するための方法。
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