CN105651909B - 一种预混合饲料中维生素a的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复合预混合饲料中维生素A的测定方法，包括溶解、测定步骤，通过使用维生素A混合溶剂将试样中的维生素溶解，且在溶解过程中的超声波水浴的温度为10‑35℃，其中，所述维生素A混合溶剂为包括体积比为(98‑99)：(0.8‑1.5)：(0.2‑0.5)的甲醇、正己烷和BHT形成的混合溶剂，因为维生素A是脂溶性的维生素，故而正己烷也是溶解维生素A的良好溶剂，且在向甲醇中加入少量的正己烷，且在超声波的作用下，正己烷完全溶于甲醇，使其成为溶解维生素A的最佳溶剂，且在正己烷的存在下，甲醇的挥发度会存在一定程度的降低，避免了现有技术中单纯使用甲醇溶解维生素A时因超声波水浴温度在65℃导致维生素A降解而造成检测结果偏低的现象。
Description
技术领域
本发明涉及维生素A测定技术领域，具体涉及一种复合预混合饲料中维生素A的测定方法。
背景技术
关于饲料中维生素A的测定，现在最常用的也是最为准确的是GB/T17817-2010公开的皂化提取法，其具体包括皂化、提取、浓缩和测定四个步骤。虽然上述方法可以准确的测出饲料中所含维生素A的具体含量，但是上述方法包含上述四个步骤，且皂化和提取两个步骤操作繁琐，不适用于饲养企业或者饲料生产企业检测室快速、及时检测；为了能够在饲养企业或者饲料生产企业检测室快速、及时的检测出维生素A，GB/T 17817-2010还公开了一种比较简单的检测方法，其被称为直接提取法，具体包括标准溶液的制备、试样溶液的制备以及使用高效液相色谱仪进行检测的步骤，其中，关于试样溶液的制备步骤具体如下：称取试样1g，精确至0.0001g，置于100mL的棕色容量瓶中，加入约80mL的甲醇，瓶塞不要拧紧，于65℃超声波水浴中超声提取30min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀即可。虽然，上述试样溶液的制备步骤比较简单，非常适合饲养企业或者饲料生产企业快速及时检测维生素A的目的，但是，由于维生素A是脂溶性的维生素，本身对热度非常敏感，尤其是超声温度已经超过了60℃，这样在超声提取的步骤中就会发生部分降解，使得最终检测的维生素A的含量发生偏移，使得人们对饲料中关于维生素A的含量的判断不正确，并且，在维生素A含量少时的相对偏差较大，在20％左右；同时，由于在超声提取过程的使用的有机溶剂是甲醇，由于甲醇本身具有毒性且挥发性非常大，使得操作不方便且容易发生事故。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中，由于在超声提取饲料中维生素A的过程温度偏高，导致最终检测饲料结果中维生素A含量偏低的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种复合预混合饲料中维生素A的测定方法，其包括：
(1)称取1-10g复合预混合饲料作为试样，精确至0.0001g；
(2)将上述试样置于棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于10-35℃超声波水浴中超声提取10-20min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素A溶解液；其中，所述维生素A混合溶剂为包括体积比为(98-99)：(0.8-1.5)：(0.2-0.5)的甲醇、正己烷和BHT形成的混合溶剂；其中，BHT为抗氧化剂，其化学名称为2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，它以对甲酚、异丁醇为原料，以浓硫酸作为催化剂，氧化铝为脱水剂，反应生成2.6-二叔丁基对甲酚。
(3)使用高效液相色谱仪对上述维生素A溶解液进行测定。
其中，步骤(2)中超声波水浴的超声波频率为15-40KHZ。
进一步，步骤(2)中超声波水浴的超声波频率设置为梯度设置，所述梯度设置为超声波频率随着超声提取时间均匀增加。
在步骤(3)中，高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱：C18型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；
流动相：混合比例为体积比80-98：2-20的甲醇与水的混合液，其中甲醇与水都需要经过0.45μm的过滤膜，按比例配好后超声波超声15min；
流速：1.0mL/min；
温度：室温；
进样量：20μl；
检测波长：326nm。
进一步，所述测定方法还包括标准溶液的制备，包括：
称取维生素A乙酸酯标准品(精确至0.0001g)于棕色容量瓶中，用所述维生素A混合溶剂溶解并稀释至刻度，混匀，4℃保存。
优选地，在步骤(2)中，关于维生素A混合溶剂的制备方法是通过将一定体积比的甲醇、正己烷和BHT通过超声波超声混合均匀。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明的复合预混合饲料中维生素A的测定方法，通过使用维生素A混合溶剂将试样中的维生素溶解，且在溶解过程中的超声波水浴的温度为10-35℃，避免了现有技术中单纯使用甲醇溶解维生素A时因超声波水浴温度在65℃导致维生素A降解而造成检测结果偏低的的现象；其中，所述维生素A混合溶剂为包括体积比为(98-99)：(0.8-1.5)：(0.2-0.5)的甲醇、正己烷和BHT形成的混合溶剂，因为维生素A是脂溶性的维生素，故而正己烷也是溶解维生素A的良好溶剂，且在向甲醇中加入少量的正己烷，且在超声波的作用下，正己烷完全溶于甲醇，使其成为溶解维生素A的最佳溶剂，且在正己烷的存在下，甲醇的挥发度会存在一定程度的降低，这避免了使用甲醇单独作为维生素A溶剂时因挥发度过大造成操作困难的事情；进一步，由于抗氧化剂BHT的加入，在使维生素A避免在超声作用下氧化分解的同时，其保证了正己烷不会被氧化，因此，抗氧化剂BHT的加入，使甲醇、正己烷和抗氧化剂BHT形成了稳定的维生素A溶解剂，且在低温度的超声波作用下，能够最大限度的溶解维生素A，使得最后的检测结果最为准确。
(2)本发明的复合预混合饲料中维生素A的测定方法，通过超声波水浴的超声波频率为15-40KHZ，使得溶解维生素A的效果好，时间短。
(3)本发明的复合预混合饲料中维生素A的测定方法，通过超声波水浴的超声波频率设置为梯度设置，且所述梯度设置为超声波频率随着超声提取时间均匀增加。即通过在固定时间段内使用超声波频率的超声波，且随着时间的增加，超声波频率亦在增加，也就是在整个的溶解时间段内，使用不同超声波频率进行对卫生素A进行溶解，进一步避免了维生素A在超声波溶解过程中的降解现象，保证了检测结果的准确性。
具体实施方式
下面对本发明的内容进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。居于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)称取1.1024g复合预混合饲料作为试样1；
(2)将上述试样1置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于10℃、40KHZ超声波水浴中超声提取20min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液A；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为98:1.5:0.5的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
实施例2
(1)称取5.0023g复合预混合饲料作为试样2；
(2)将上述试样2置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于25℃、25KHZ超声波水浴中超声提取15min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液B；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为98.5:1.0:0.5的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
实施例3
(1)称取9.9854g复合预混合饲料作为试样3；
(2)将上述试样3置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于35℃、15KHZ超声波水浴中超声提取10min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液C；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为99:0.8:0.2的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
实施例4
(1)称取3.3296g复合预混合饲料作为试样4；
(2)将上述试样4置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于15℃、15KHZ超声波水浴中超声提取10min，接着于20℃、20KHZ超声波水浴中超声提取5min，接着于25℃、25KHZ超声波水浴中超声提取5min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液D；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为98.5:1.2:0.3的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
实施例5
(1)称取8.3046g复合预混合饲料作为试样5；
(2)将上述试样5置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于15℃、15KHZ超声波水浴中超声提取5min，接着于25℃、25KHZ超声波水浴中超声提取5min，接着于35℃、35KHZ超声波水浴中超声提取5min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液E；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为99:0.8:0.2的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
实施例6
(1)称取1.1049g复合预混合饲料作为试样6；
(2)将上述试样6置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于15℃、15KHZ超声波水浴中超声提取8min，接着于25℃、25KHZ超声波水浴中超声提取8min，接着于35℃、35KHZ超声波水浴中超声提取8min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液F；其中，所述维生素A混合溶剂为体积比为99:0.5:0.5的甲醇、正己烷和BHT经超声混合均匀的混合溶剂。
对比例
(1)称取1.0128g复合预混合饲料作为试样7；
(2)将上述试样7置于100mL棕色容量瓶中，加入约80mL甲醇，瓶塞不要塞紧，于65℃、35KHZ超声波水浴中超声提取30min，接着使用甲醇稀释至刻度，充分摇匀得到维生素溶解液G；
测试例
1、标准溶液的制备：
称取维生素A乙酸酯标准品(精确至0.0001g)于棕色容量瓶中，用所述维生素A混合溶剂溶解并稀释至刻度，混匀制得浓度为1.36、3.44、6.88μg/mL的标准溶液，4℃保存待用。需要注意的是，上述维生素A混合溶剂为甲醇、正己烷和BHT混合溶剂，只要三者的体积比为(98-99)：(0.8-1.5)：(0.2-0.5)即可，在本测试例中，三者的体积比为99:0.5:0.5；而测定对比例的标准溶液的制备按照GB/T17817-2010来制备上述浓度的标准溶液。
2、色谱条件
在本实施例中，高效液相色谱仪为WATERS 2489高效液相色谱仪(当然也可以为其他型号的高效液相色谱仪)，其设置条件如下：
色谱柱：C18型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；
流动相：混合比例为体积比80-98：2-20的甲醇与水的混合液，其中甲醇与水都需要经过0.45μm的过滤膜，按比例配好后超声波超声15min；在本测试例中，混合相为体积比98:2的甲醇与水的混合液；
流速：1.0mL/min；
温度：室温；
进样量：20μl；
检测波长：326nm。
3、检测结果
首先，使用标准溶液进行测定，以在高效液相色谱仪内得到线性直线，以方便在检测维生素溶解液A-G时直接得到仪器测出值Xal(μg/mL)，检测结果见表1：
表1
其中，计算公式如下：
Xa＝Xal*V/M
Xa：试样维生素A含量，单位为μg/g；
Xal：仪器测出值，单位为μg/mL；
V：维生素溶解液体积，单位为mL；
M：试样重量，单位为g；
从以上检测结果可以看出，本发明的测定方法测出结果要高于国标中直接提取法测定的维生素A的浓度，且通过上述实施例中的维生素A的含量计算出的相对偏差为11％，远远低于国标在此维生素范围内的20％。
需要说明的是，关于维生素A混合溶剂的超声波混合的温度、时间和频率为室温、15min和20KHZ，其中关于上述温度、时间和频率是可以变化的，只要使维生素A混合溶剂混合均匀即可。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种复合预混合饲料中维生素A的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取1-10g复合预混合饲料作为试样，精确至0.0001g；
(2)将上述试样置于棕色容量瓶中，加入约80mL维生素A混合溶剂，瓶塞不要塞紧，于10-35℃超声波水浴中超声提取10-20min，接着使用维生素A混合溶剂稀释至刻度，充分摇匀得到维生素A溶解液；其中，所述维生素A混合溶剂为包括体积比为(98-99)：(0.8-1.5)：(0.2-0.5)的甲醇、正己烷和BHT形成的混合溶剂；
(3)使用高效液相色谱仪对上述维生素A溶解液进行测定。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中超声波水浴的超声波频率为15-40KHZ。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中超声波水浴的超声波频率设置为梯度设置。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述梯度设置为超声波频率随着超声提取时间均匀增加。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱：C18型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；
流动相：混合比例为体积比80-98：2-20的甲醇与水的混合液，其中甲醇与水都需要经过0.45μm的过滤膜，按比例配好后超声波超声15min；
流速：1.0mL/min；
温度：室温；
进样量：20μl；
检测波长：326nm。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，还包括标准溶液的制备，包括：
称取维生素A乙酸酯标准品，精确至0.0001g，置于棕色容量瓶中，用所述维生素A混合溶剂溶解并稀释至刻度，混匀，4℃保存。
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