CN105651705A - 无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法 - Google Patents

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张雪峰
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Abstract

本发明属于药材鉴别领域，其公开了一种无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，解决传统技术中检测方式存在操作繁琐、检测成本高、需要消耗样品的问题。该方法包括：a.选取冬虫夏草样品制备成冬虫夏草纯粉样品；b.选取与冬虫夏草纯粉易混淆的样品作为伪品粉样品；c.将伪品粉按一定比例混合至冬虫夏草纯粉样品中形成混合样品；d.采集混合样品高光谱信息，并进行成分相关特征提取；e.建立混合样品的成分相关特征与该样品中伪品的种类和含量映射关系的PLSR预测模型；f.在进行冬虫夏草粉中伪品含量检测时，采集该冬虫夏草粉的高光谱信息，并对高光谱信息进行处理后代入PLSR预测模型；g.根据PLSR预测模型预测输出值检测冬虫夏草粉中伪品的种类和含量。

Description

无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法
技术领域
本发明属于药材鉴别领域，具体涉及无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法。
背景技术
冬虫夏草Cordycepssinensis(Berkeley)Saccardo为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属(Hepialus)幼虫上形成的虫生子囊真菌，为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草的子座及其寄主鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合物，性甘平，补肺益肾，止血化痰，用于久咳虚喘，劳咳咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛，是我国传统的名贵中药材。
冬虫夏草生长环境特殊，主要分布于我国青藏高原海拔3000～5000米的高山草甸和高山灌丛。青海、西藏、四川、甘肃和云南是冬虫夏草的主要产区，青海的产量和质量居各省区之首，玉树、果洛等是青海冬虫夏草主产地。冬虫夏草目前尚不能进行人工培育，而野生冬虫夏草的分布区域狭小，自然寄生率低，对环境条件要求苛刻，加之近年来的生态破坏和掠夺式采挖，使冬虫夏草的产量逐年下降，价格不断攀升。因此，市场上存在严重的掺伪、增重等造假现象。除了冬虫夏草之外，其他虫草属真菌寄生在昆纯粉上形成的复合体也被称为“虫草”，其中一些常被用作冬虫夏草的伪品，性状相似而难以区分。
传统的鉴定方法主要是依据中药的来源、品种形态、性状、显微特征、理化鉴别、检查、含量测定等依靠经验或者精密仪器进行检验，尤其是显微特征、理化鉴别、检查、含量测定等方法均需要消耗原材料，通过药材表面的特征很难进行鉴定。
近年来，使用DNA分子标记的检测方式进行冬虫夏草的检测与鉴别也常见报道。但是，这种检测方式操作繁琐，试剂和检测费用较高，样品准备程序复杂，难以推广。
最重要的是，目前的各种检测方法都需要消耗样品，故只能抽样检测，不可能做到全部产品的检测，因此难以满足冬虫夏草产业的需要。
近年来，冬虫夏草的纯粉加工技术获得了巨大成功。由于冬虫夏草形状的改变，也对纯粉检测技术提出了更高的要求。因此建立快速准确识别和定量冬虫夏草中伪品含量的方法，对规范市场、保证药材质量具有非常重要的意义。
因此，本领域目前需要建立一种无损的检测冬虫夏草粉中伪品含量的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种无损检测冬虫夏草粉中伪品含量的方法，解决传统技术中检测方式存在操作繁琐、检测成本高、需要消耗样品的问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，包括以下步骤：
建立冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型，在进行冬虫夏草粉/粉片中伪品含量检测时，将待检测样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集所述待检测样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后输入已建立的冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型进行预测，根据预测输出值检测伪品含量。
进一步，还包括，根据预测输出值检测出伪品种类。
所述建立冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型具体包括：
A1.选取I种冬虫夏草样品分别经预处理后制备成冬虫夏草纯粉；
A2.选取J种市售类似冬虫夏草纯粉样品分别经过预处理后作为伪品粉；
A3.将J种伪品粉中的每一种添加至I种冬虫夏草纯粉中的每一种进行混合均匀，使得添加的伪品粉占混合物的比例为Z；
A4.重复步骤A3，直至完成J种伪品粉与I种冬虫夏草粉按照预定各种比例的混合,形成混合样品校正集；
A5.将混合样品校正集中的其中一种混合样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集该样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后提取成份相关特征，将提取的成分相关特征录入数据库中；
A6.重复步骤A5，直至完成混合样品校正集中的所有样品的成分相关特征的提取和录入，获得校正集中各样品的成分相关特征信息；
A7.对步骤A6所得校正集中的各样品成分相关特征信息与相应伪品的种类和含量映射关联，建立冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型；
B.在进行冬虫夏草粉中伪品含量检测时，将待检测样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集所述待检测样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后输入至步骤A中建立的冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型进行预测，根据预测输出值检测冬虫夏草粉/粉片中伪品的种类和含量。
具体的，步骤A3中，所述比例为质量百分比或摩尔百分比。
具体的，步骤A3中，所述Z＝0％～100％。
具体的，步骤A1中，所述选取I种冬虫夏草样品具体包括：
依据冬虫夏草的产地不同划分冬虫夏草的种类，选取全国主产区青海玉树、青海果洛、青海海南、青海黄南、青海海东、四川、西藏、甘肃、云南9个地区的冬虫夏草原草样品。
具体的，步骤A1中，所述预处理包括：依次经过干刷、清洗、40℃低温干燥。
具体的，所述制备成纯粉是指将经过预处理后的冬虫夏草样品超微粉碎为粒度D90≤25μm的颗粒。
具体的，步骤A2中，所述预处理是指对选取的市售类似冬虫夏草纯粉样品经过40℃低温干燥。
具体的，所述高光谱反射图像采集系统采用碲镉汞二维阵列检测器，光源为石英卤素灯；光谱采集范围为短波红外波段940–2537nm，像素为320×256，像素大小150μm×150μm，采用视场为50mm镜头；扫描方式为高速推扫式高光谱成像，推扫速度3mm/s，采集速度100fps。
具体的，步骤A5中所述利用所述高光谱反射图像采集系统采集该样品的高光谱信息，具体步骤如下：
①采集获得该样品(m×n)个像元在k个波段下的连续光谱曲线，每一波段对应的光谱信号响应值为Ik，k＝1，2…K；
②利用标准白板标定图像的光强值，计算每幅图像在第k个波段下高光谱反射图像的相对光强值其中为第k个波段下每个冬虫夏草粉高光谱反射图像的相对强光值；Ik为第k个波段下每个冬虫夏草粉高光谱反射图像的光强值；为第k个波段下标准白板高光谱反射图像的光强值；Dk为第k个波段下采集的全黑标定图像光强值；
③将计算出来的相对光强值经过A/D转换，转换为光谱吸收曲线。
具体的，步骤A5中所述对采集的高光谱信息进行图像处理后提取成份相关特征，具体包括：
对采集各像元数据按光谱维分别进行均值中心化变换后，进行PCA变换，扣除无用的背景单元；同时计算各像元PCA得分与样本中心的欧式距离dm,n，扣除dm,n≥1.6的异常像元，保留下总数不低于95％的真实有效像元光谱信息；
然后对有效像元光谱信息依次进行Savitsky–Golay平滑、标准正太变量校正、均值中心化处理和PCA变换，在保证累积方差≥90％的情况下，取前N个主成分的特征信息。
具体的，所述N＝12。
具体的，所述扣除无用的背景单元的方法是：
人机交互式选择样品在PCA得分空间中的ROI像元，计算背景像元与样本像元之间的欧式距离并显示为直方图形式，寻找能将背景和样本像元显著分离的阈值，删除无用的背景单元。
本发明的有益效果是：通过建立冬虫夏草粉光谱与伪品主成分特征和含量的映射关系，从而可以准确定量出冬虫夏草粉中市售伪品含量；实现了冬虫夏草粉中复杂伪品添加物的定量分析。本方法简便、快速、无损地实现了对冬虫夏草粉中伪品含量分析全草进行鉴别，具有客观量化、结果准确、成本低廉等诸多优点。
附图说明
图1为无损检测冬虫夏草粉中伪品含量的方法流程图。
具体实施方式
本发明提出一种无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，解决传统技术中检测方式存在操作繁琐、检测成本高、需要消耗样品的问题。
以检测冬虫夏草粉中伪品含量为例(检测粉片的方式与其一致，只是检测对象上的区别)，本发明中的无损检测冬虫夏草粉中伪品含量的方法如图1所示，其包括：
a.选取冬虫夏草样品制备成冬虫夏草纯粉样品；
b.选取与冬虫夏草纯粉易混淆的样品作为伪品粉样品；
c.将伪品粉按一定比例混合至冬虫夏草纯粉样品中形成混合样品；
d.采集混合样品高光谱信息，并进行成分相关特征提取；
e.建立混合样品的成分相关特征与该样品中伪品的种类和含量映射关系的PLSR预测模型；
f.在进行冬虫夏草粉中伪品含量检测时，采集该冬虫夏草粉的高光谱信息，并对高光谱信息进行处理后代入PLSR预测模型；
g.根据PLSR预测模型预测输出值检测冬虫夏草粉中伪品的种类和含量。
在具体实现上，本发明方案包括以下几个部分：
一、建立冬虫夏草粉中伪品含量的PLSR预测模型的步骤：
1.样品准备：
1.1以产地不同划分冬虫夏草的种类，选取主产区青海玉树、青海果洛、青海海南、青海黄蓝、青海海东、四川、西藏、甘肃、云南九个地区的9种冬虫夏草样品(即I＝9)，分别依次经干刷、清洗、40℃低温干燥，再超微粉碎为粒度D90≤25μm的颗粒，形成冬虫夏草纯粉。
1.2选取市售类似冬虫夏草纯粉(易与冬虫夏草纯粉混淆的样品，如：人工发酵菌丝粉)的样品3种(即J＝3)，分别经40℃低温干燥后作为伪品粉。
1.3将3种伪品粉中的每一种与9种冬虫夏草纯粉中的每一种按照各种预定比例进行均匀混合，这里所述的“各种预定比例”可以根据需求进行预设，为了让建立的模型更精细，可以将比例值也设置的尽量多，例如：1％，2％，3％，4％.....99％等，且该比例值是指进行均匀混合后，伪品含量占混合物的质量比或者摩尔比；
具体混合步骤如下：
将第1种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照1％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为1％)；
将第1种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照2％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为2％)；
将第1种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照3％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为3％)；
·
·
·
将第1种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照99％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为99％)；
将第2种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照1％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为1％)；
将第2种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照2％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为2％)；
将第2种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照3％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为3％)；
·
·
·
将第2种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照99％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为99％)；
将第3种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照1％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为1％)；
将第3种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照2％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为2％)；
·
·
·
将第3种伪品粉与第1种冬虫夏草纯粉按照99％的比例进行混合(混合后伪品粉的含量占混合物的质量比为99％)；
如此类推，将3种伪品粉中的每一种与9种冬虫夏草纯粉中的每一种按照99个(从1％至99％并且以1％为间隔值)预定比例进行均匀混合后，一共有3*9*99＝2673种混合样品；
2.图像采集：
本发明所采用的高光谱反射图像采集系统为芬兰SPECIM生产的SisuCHEMA实验室高光谱扫描仪，其采用碲镉汞二维阵列检测器，光源为石英卤素灯。光谱采集范围为短波红外波段(SWIR，940–2537nm)，像素为320(空间)×256(光谱)，像素大小30μm×30μm，采用视场为10mm镜头。扫描方式为高速推扫式高光谱成像，推扫速度3mm/s，采集速度100fps。
依次分别将步骤1中准备的样品放置样品台上，高光谱反射图像采集系统自样品进入视场开始采集样品各像元的高光谱图像信息：
①采集获得该样品(m×n)个像元在k个波段下的连续光谱曲线，每一波段对应的光谱信号响应值为Ik，k＝1，2…K；
②利用标准白板标定图像的光强值，计算每幅图像在第k个波段下高光谱反射图像的相对光强值其中为第k个波段下每个冬虫夏草粉高光谱反射图像的相对强光值；Ik为第k个波段下每个冬虫夏草粉高光谱反射图像的光强值；为第k个波段下标准白板高光谱反射图像的光强值；Dk为第k个波段下采集的全黑标定图像光强值；
③将计算出来的相对光强值经过A/D转换，转换为光谱吸收曲线。
3.图像处理：
为减小噪声干扰，可以删除含有较多噪声的940–1000nm和2469–2537nm波段下数据；对采集各像元数据按光谱维分别进行均值中心化变换后，进行PCA变换，扣除无用的背景单元；同时计算各像元PCA得分与样本中心的欧式距离dm,n，扣除dm,n≥1.6的异常像元，保留下总数不低于95％的真实有效像元光谱信息；
为了消除基线漂移、光散射、噪音、样品表面形貌差异等干扰，需要对有效像元光谱信息依次进行Savitsky–Golay平滑(窗口取值11，多项式阶数为3)、标准正态变量校正(SNV)、均值中心化处理和PCA(主成分分析)变换。
4.模型建立：
在保证累积方差≥90％的情况下，取前N个主成分(为了使得建立的模型更加细化N的值可以取12)的特征信息，将特征信息与混合样品中伪品种类和相应含量进行映射关联，建立PLSR(偏最小二乘回归)预测模型。
二、在进行冬虫夏草粉中伪品含量鉴别时，将待检测样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集所述待检测样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后输入至步骤A中建立的冬虫夏草粉PLSR预测模型进行预测，根据预测输出值检测出样品中伪品种类和含量。
具体鉴别方法为：
下面以一个具体实施例对本发明中建立的PLSR预测模型进行验证：
1)样品准备：
准备青海果洛冬虫夏草纯粉8份，采用亚香棒粉作为伪品粉；
依次分别其中7份青海果洛冬虫夏草纯粉中添加1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％含量的伪品粉混合均匀(添加进来的伪品粉含量占混合后的混合物的质量比分别为1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％)，另外1份青海果洛冬虫夏草纯粉不添加任何物质；由此获得8份待测样品；
2)图像采集和处理后代入PLSR预测模型进行预测：
依次分别将此8份待测样品放置样品台上，高光谱反射图像采集系统自样品进入视场开始采集样品各像元的高光谱图像信息：
在对高光谱图像信息进行处理后提取成分特征信息并输入至PLSR预测模型进行预测，其预测结果参见下表1：
表1：冬虫夏草粉样品预测结果表
编号 伪品添加量(％) 预测结果(％) 误差(％)
1 0 -0.821 -
2 1 0.963 3.70
3 2 1.652 17.40
4 5 5.431 8.62
5 8 7.368 7.90
6 10 11.246 12.46
7 12 13.739 14.49
8 15 14.583 2.78
从上表可以看出，PLSR预测值与实际添加含量基本相符，相对误差小于20％，可以应用于实际预测。

Claims (10)

1.无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，包括：
建立冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型，在进行冬虫夏草粉/粉片中伪品含量检测时，将待检测样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集所述待检测样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后输入已建立的冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型进行预测，根据预测输出值检测出伪品种类和伪品含量。
2.如权利要求1所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，
所述建立冬虫夏草虫体粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型的步骤为：
A1.选取I种冬虫夏草样品分别经预处理后制备成冬虫夏草纯粉；
A2.选取J种市售类似冬虫夏草纯粉样品分别经过预处理后作为伪品粉；
A3.将J种伪品粉中的每一种添加至I种冬虫夏草纯粉中的每一种进行混合均匀，使得添加的伪品粉占混合物的比例为Z；所述比例为质量百分比，Z＝0％～100％；
A4.重复步骤A3，直至完成J种伪品粉与I种冬虫夏草粉按照预定各种比例的混合,形成混合样品校正集；
A5.将混合样品校正集中的其中一种混合样品放置入高光谱反射图像采集系统中，利用所述高光谱反射图像采集系统采集该样品的高光谱信息，并对采集的高光谱信息进行图像处理后提取光谱特征，将提取的光谱特征录入数据库中；
A6.重复步骤A5，直至完成混合样品校正集中的所有样品的光谱特征的提取和录入，获得校正集中各样品的光谱特征信息；
A7.对步骤A6所得校正集中的各样品光谱特征信息与相应伪品的种类和含量映射关联，建立冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的PLSR预测模型。
3.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，步骤A1中，所述选取I种冬虫夏草样品具体包括：
依据冬虫夏草的产地不同划分冬虫夏草的种类，选取全国主产区青海玉树、青海果洛、青海海南、青海黄南、青海海东、四川、西藏、甘肃、云南9个地区的冬虫夏草原草样品。
4.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，步骤A1中，所述预处理包括：依次经过干刷、清洗、40℃低温干燥；
所述制备成纯粉是指将经过预处理后的冬虫夏草样品超微粉碎为粒度D90≤25μm的颗粒。
5.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，步骤A2中，所述预处理是指对选取的市售类似冬虫夏草纯粉样品经过40℃低温干燥。
6.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，所述高光谱反射图像采集系统采用碲镉汞二维阵列检测器，光源为石英卤素灯；
所述高光谱反射图像采集系统的光谱采集范围为短波红外波段940–2537nm；
所述高光谱反射图像采集系统的像素为320×256，像素大小150μm×150μm，采用视场为50mm镜头；
所述高光谱反射图像采集系统的扫描方式为高速推扫式高光谱成像，推扫速度3mm/s，采集速度100fps。
7.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，步骤A5中所述利用所述高光谱反射图像采集系统采集该样品的高光谱信息，具体包括：
①采集获得该样品(m×n)个像元在k个波段下的连续光谱曲线，每一波段对应的光谱信号响应值为Ik，k＝1，2…K；
②利用标准白板标定图像的光强值，计算每幅图像在第k个波段下高光谱反射图像的相对光强值其中为第k个波段下每个冬虫夏草粉/粉片高光谱反射图像的相对强光值；Ik为第k个波段下每个冬虫夏草粉/粉片高光谱反射图像的光强值；为第k个波段下标准白板高光谱反射图像的光强值；Dk为第k个波段下采集的全黑标定图像光强值；
③将计算出来的相对光强值经过A/D转换，转换为光谱吸收曲线。
8.如权利要求2所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，步骤A5中所述对采集的高光谱信息进行图像处理后提取成份相关特征，具体包括：
对采集各像元数据按光谱维分别进行均值中心化变换后，进行PCA变换，扣除无用的背景单元；
然后对有效像元光谱信息依次进行Savitsky–Golay平滑、标准正太变量校正、均值中心化处理和PCA变换，在保证累积方差≥90％的情况下，取前N个主成分的特征信息。
9.如权利要求8所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，所述N＝12。
10.如权利要求8所述的无损检测冬虫夏草粉/粉片中伪品含量的方法，其特征在于，所述扣除无用的背景单元的方法是：
选择样品在PCA得分空间中的ROI像元，计算背景像元与样本像元之间的欧式距离并显示为直方图形式，寻找能将背景和样本像元显著分离的阈值，删除无用的背景单元。
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