CN105647513A - 一种具有pH响应的双模式成像探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有pH响应的双模式成像探针，化学结构式如式(Ⅰ)所示：式中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。该探针在pH3.5～10.0时，其在激发光760nm、670nm下的荧光强度比随着pH的降低而逐渐增强；在760nm、680nm处的吸收强度比随着pH的降低而逐渐增强，760nm/680nm光声信号随着pH降低而逐渐增强，表现出明显的pH依赖的光声信号变化性；且pKa＝6.2，很适合在荧光-光声的双模式下进行肿瘤pH的检测。本发明还提供了该探针的制备方法及应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物荧光分析技术领域，具体涉及一种具有pH响应的双模式成像探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内的pH在酶活性、细胞增殖和调亡、抗药性、离子传输、细胞内吞作用以及肌肉收缩等一系列组织活动中起着至关重要的作用。例如，肿瘤发生时细胞内pH会发生变化。细胞功能和pH值的这种微妙关系意味着只要能掌握细胞内pH值的变化就可以为相关的生理和病理过程研究提供重要的信息。因此，如何精确地检测细胞内pH值的变化显得非常重要。
相比于其他pH的测定方法，使用荧光探针法进行pH检测具有灵敏度高、选择性好等优点，但目前大部分pH探针波长较短，不能避开组织自吸收和自荧光，背景干扰较强，部分stocks位移小，紫外吸收波谱和荧光光谱重叠较大，信噪比低，毒性较大，不能用于细胞和活体pH检测。同时单一的pH荧光探针通过对组织中的特征分子所发荧光进行成像，仅仅局限于对靠近皮肤表面的组织进行成像，不适合捕捉体内组织器官的信息。
光声成像是近年来迅速发展的一种新的无损医学成像方法，它结合了纯光学成像的高对比度特性和纯超声成像的高穿透深度特性的优点，可实现50mm的深层活体内组织成像，具有更高的对比度和穿透性，能够显著地改善了肿瘤的探测方法。因此，基于光吸收的光声成像可以为肿瘤检测提供高对比度的光吸收分布差异，实现肿瘤早期检测。
因此，设计合成背景干扰少、具有pH响应的荧光-光声双模成像探针对于检测肿瘤的早期pH变化具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有pH响应的双模式成像探针及其制备方法和应用。该成像探针的激发、发射光谱均在近红外区域，其stocks位移较大、背景干扰少，对H+有较高的灵敏度、高选择性，对细胞和活体伤害较小，且pKa＝6.2，很适合在荧光-光声双模式下进行肿瘤pH的检测，克服了现有技术中荧光探针的缺陷。
本发明第一方面提供了一种具有pH响应的双模式成像探针，其化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
优选地，所述X为-C(CH3)2-。
优选地，所述Y为I。
优选地，所述R1和所述R2均为H原子。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
进一步优选地，所述X为-C(CH3)2-，所述Y为I，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基。
所述具有pH响应的双模式成像探针，以近红外花菁类荧光染料为母体，在中位上分别修饰上对H+敏感的供体分子形成所述探针的pKa＝6.2，所述探针在碱性条件下，花菁类荧光染料母体中位上的N原子未被质子化，相应氮原子上的孤对电子可以发生光致电子转移(PET)而部分淬灭母体的荧光，当pH降低时，H+与供体上的N原子结合，促进了分子内电荷转移，增加了体系的共轭程度，电子流动性增加，吸收光谱红移；同时探针中花菁类荧光染料母体中位上的N原子会被质子化，破坏PET，探针的荧光增强。
所述具有pH响应的双模式成像探针的最大吸收波长随着pH的降低逐渐红移至近红外区域，其最大吸收波长由670nm红移至760nm,能有效避开组织自吸收和自荧光，背景干扰少、信噪比高；在pH3.5～10.0时，其在激发光760nm、670nm的荧光强度之比(简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强；在pH3.5～10.0时，在760nm、680nm处的吸收强度比(简写为吸收光谱760nm/680nm比例)随着pH的降低而逐渐增强，在吸收波长760nm、680nm处的光声信号比随着pH降低而逐渐增强，表现出明显的pH依赖的光声信号变化性；且pKa＝6.2，很适合在荧光-光声的双模式下进行肿瘤pH的检测，同时毒性较小，对细胞和活体伤害较小，另外，所述探针带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测细胞内pH。
本发明第一方面提供的所述具有pH响应的双模式成像探针，其stocks位移较大、信噪比高、背景干扰少，对H+有较高的灵敏度、高选择性，在不同的酸碱环境下，能迅速质子化和去质子，多次改变pH环境，仍然有很好的荧光效果；对细胞和活体伤害较小，且pKa＝6.2，很适合在荧光-光声双模式下进行肿瘤pH的检测，克服了现有技术中荧光探针的缺陷。
本发明第二方面提供了一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的化合物：
式中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基；
(2)将化学结构式如式(Ⅱ)分别和(Ⅲ)所示的化合物按照摩尔比为1:4-1:5的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在50℃-70℃反应下1-5h，提纯后得到具有pH响应的双模式成像探针，所述具有pH响应的双模式成像探针的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
步骤(2)的反应方程式为：
优选地，所述X为-C(CH3)2-。
优选地，所述Y为I。
优选地，所述R1和所述R2均为H原子。
优选地，所述R3和所述R4均为乙基。
进一步优选地，所述X为-C(CH3)2-，所述Y为I，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基。
优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
优选地，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)或吡啶。
优选地，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅱ)的化合物的摩尔比为(2-6)：1。
优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
优选地，所述提纯的方法为：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得所述具有pH响应的双模式成像探针。
更优选地，所述梯度洗脱中，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比从30:1到10:1进行变化。
优选地，所述化学结构如式(Ⅱ)所示的化合物采用以下方法制得：
提供化学结构式如式(Ⅳ)所示的化合物：
式中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基；
将化学式如(Ⅳ)所示的化合物和按摩尔比为1：(3-6)的比例溶解在第二溶剂中，保护气体氛围下，在60℃-80℃进行反应1-2h，提纯后制得化学式如式(Ⅱ)所示的化合物。
更优选地，所述第二溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或乙腈。
更优选地，所述保护气体为氮气、氩气或氦气。
更优选地，所述提纯的方法为：反应结束后，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得化学结构式如式(Ⅱ)所示的化合物。
进一步优选地，所述梯度洗脱中，所述二氯甲烷和所述甲醇的体积比从40:1到20:1进行变化。
本发明第二方面提供的一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，该制备方法简单易操作。
本发明第三方面提供了第一方面所述的具有pH响应的双模式成像探针在制备肿瘤的早期检测、诊断、治疗或诊疗的药物中的应用。所述药物中，除包括所述具有pH响应的双模式成像探针外，还可以包括其他能用于肿瘤检测、治疗或诊疗的药物。
所述具有pH响应的双模式成像探针可以以肿瘤荧光成像和光声成像的形式进行应用。
所述具有pH响应的双模式成像探针在偏碱性条件下的stocks位移高达120nm左右，信噪比高、背景干扰少，其最大吸收波长随着pH的降低逐渐红移至近红外区域，其最大吸收波长随着pH降低由670nm红移到760nm；pKa＝6.2，在pH3.5～10.0时，其在激发光760nm、670nm下的荧光强度之比(简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强；在pH3.5～10.0时，吸收光谱760nm/680nm比例随着pH的降低而逐渐增强，760nm/680nm光声信号随着pH降低而逐渐增强，表现出明显的pH依赖的光声信号变化性；该探针对H+有较高的灵敏度、高选择性，同时毒性较小，对细胞和活体伤害较小，在荧光-光声双模式下，可以实现对肿瘤pH的更精确地检测，便于实现对肿瘤的检测、诊断、治疗。
综上，本发明提供的具有pH响应的双模式成像探针及其制备方法和应用的有益效果包括以下几个方面：
(1)所述具有pH响应的双模式成像探针的最大吸收波长随着pH降低由670nm红移到760nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，在pH3.5～10.0时，其在激发光760nm、670nm下的荧光强度之比(简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强，很适合用来进行肿瘤pH的检测。
(2)在pH3.5～10.0时，所述具有pH响应的双模式成像探针在760nm、680nm处的吸收强度比随着pH的降低而逐渐增强，760nm/680nm光声信号随着pH降低而逐渐增强，表现出明显的pH依赖的光声信号变化性；
(3)所述具有pH响应的双模式成像探针的制备方法简单易操作；
(4)所述具有pH响应的双模式成像探针的pKa＝6.2，带正电，在细胞膜负电的作用下能很快进入细胞内检测酸性细胞内的pH。
附图说明
图1为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的高分辨质谱图；
图2为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的吸收光谱随pH的变化曲线；
图3为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的荧光强度随pH的变化曲线；
图4为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的光声信号随pH的变化曲线；
图5为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的选择性荧光光谱图；
图6为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的可逆性测试结果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1：
一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备
将34.4mg(0.4mmol)的和63.8mg(0.1mmol)的化合物溶解在2ml的无水DMF溶剂中，在氩气气体氛围下，在80℃进行反应1h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，洗脱剂二氯甲烷和甲醇的体积比从40:1变至20:1而进行梯度洗脱，除去溶剂，得蓝色固体产品55mg，产率80％，该蓝色固体产品的结构式为
(2)制备具有pH响应的双模式成像探针：
将化学式为的34.4mg(0.05mmol，分子量为688.3)与48.76mg(0.25mmol)的加入到三口烧瓶中，加入2mL无水DMF作溶剂，再加入40μL(0.2886mmol)的三乙胺做缚酸剂，氩气保护下，于温度60℃下反应4h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，洗脱剂二氯甲烷和甲醇的体积比从30:1变至10:1而进行梯度洗脱，除去溶剂，得靛蓝色固体产品24mg，即具有pH响应的双模式成像探针，收率为60％。
反应方程式为：
对实施例1得到的具有pH响应的双模式成像探针进行ABIQ-starElite质谱(四级杆飞行时间质谱)测试，测试结果如图1所示，图1为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的高分辨质谱图；从图1中可以看出，通过质谱测出的的分子离子峰M+为675.4633，符合C44H59N4O2 +的理论分子量，图1的质谱图结果表明，本实施例成功地制备得到具有pH响应的双模式成像探针。
实施例2：
一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，包括以下步骤：
将25.8mg(0.3mmol)的和34.4mg(0.05mmol)的化合物溶解在2ml的无水DMF溶剂中，在氩气气体氛围下，在70℃进行反应1.5h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，洗脱剂二氯甲烷和甲醇的体积比从40:1变至20:1而进行梯度洗脱，除去溶剂，得蓝色固体产品28mg，产率81％，该蓝色固体产品的结构式为
(2)制备具有pH响应的双模式成像探针：
将化学式为的34.4mg(0.05mmol)与39mg(0.2mmol)的加入到三口烧瓶中，加入2mL无水DMF作溶剂，再加入40μL的三乙胺做缚酸剂，氩气保护下，于温度60℃下反应4h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂二氯甲烷：甲醇的体积比从30:1变至10:1，除去溶剂，得靛蓝色固体产品24mg，即具有pH响应的双模式成像探针，收率为60％。
实施例3：
一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将31.6mg(0.37mmol)的和70.47mg(0.11mmol)的化合物溶解在2.5ml的无水DMF溶剂中，在氩气气体氛围下，在60℃进行反应2h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂二氯甲烷和甲醇的体积比从40:1变至20:1，除去溶剂，得蓝色固体产品60mg，产率81％，该蓝色固体产品的结构式为
(2)制备具有pH响应的双模式成像探针：
将化学式为的68.8mg(0.1mmol)与78mg(0.4mmol)的加入到三口烧瓶中，加入3mL无水DMF作溶剂，再加入70μL(0.5mmol)的三乙胺做缚酸剂，氩气保护下，于温度60℃下反应4h，旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱剂二氯甲烷：甲醇的体积比从30:1变至10:1，除去溶剂，得靛蓝色固体产品48mg，即具有pH响应的双模式成像探针，收率为60％。
效果实施例
将实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针配置于pH为3.5～10.0的磷酸缓冲液(含10％的DMSO)中，保持该探针的最终浓度为8μmol/L，测试其在紫外-可见-近红外区的吸收光谱变化，结果如图2所示。随着pH的降低，该探针的吸收光谱红移，最大吸收波长由680nm红移至770nm，同时随着pH的降低，最大吸收波长760nm处的吸收强度也逐渐增强。
将实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针保持在8μmol/L，置于pH为4.0～10.0磷酸缓冲液(含10％的DMSO)中测试其在770nm-850nm处的荧光强度，并计算该探针在激发光760nm、670nm下790nm处的荧光发射强度之比(简写为F760/F670)，结果如图3所示。该探针在激发光760nm、670nm下790nm处的荧光发射强度之比(简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强。
将实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针保持在8μmol/L，置于pH为4.0～9.0的磷酸缓冲液(含10％的DMSO)中使用仪器Nexus128测试其在吸收波长为760nm、680nm下的光声信号，结果如图4所示。在pH4.0.～9.0时，其在吸收波长为760nm、680nm下的光声信号比例(760nm/680nm光声信号比)随着pH的降低而逐渐增强。
将实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针保持在8μmol/L，置于pH7.4的磷酸缓冲液(含10％的DMSO)中，分别在激发波长为670nm、760nm下考察该探针对常见的金属离子的响应情况，结果如图5所示，图5中，(A)为在激发波长为670nm下测试在790nm处的荧光，(B)为在激发波长为760nm下测试在790nm处的荧光。从图5可以看出，该探针对金属离子几乎没有响应，证明本探针对金属离子几乎无响应，在用于测试pH时，体系的金属离子几乎对其测试不造成影响。图5中各物质的顺序和浓度依次为：1.探针；2.K+(100mM)；3.Na+(100mM)；4.Ca2+(0.5mM)；5.Fe2+(0.5mM)；6.Fe3+(0.5mM)；7.Cu2+(0.5mM)；8.Zn2+(0.5mM)；9.Mg2+(0.5mM):10.Ag+(0.5mM)；11.Cd2+(0.5mM)；12.Co2+(0.5mM)；13.Mn2+(0.5mM)；14.Ni2+(0.5mM)；15.Pb2+(0.5mM)；16.Sn2+(0.5mM)。其中，序号1为只加入探针，序号2-16为加入了各金属离子的探针，括号内代表金属离子的浓度。
由于细胞内pH值往往发生振荡变化，并且非均匀分布，因此pH探针具有可逆响应能力十分重要。因此我们还对本发明制得的具有pH响应的双模式成像探针对pH响应的可逆性进行了测试。实验中循环调节测试溶液的pH，使其pH在5和9之间振荡，并反复测试在激发光分别为670nm和760nm时在发射波长为790nm处的荧光强度。结果如图6所示，图6为实施例1制得的具有pH响应的双模式成像探针的可逆性测试结果图。图6中，(A)为在激发波长为670nm下测试在790nm处的荧光，(B)为在激发波长为760nm下测试在790nm处的荧光。从图6可以看出，本发明制得的具有pH响应的双模式成像探针的荧光至少在6个循环内在相同的pH下保持稳定，表明该探针具有较好的可逆响应pH的能力，在不同的酸碱环境下，能迅速质子化和去质子，多次改变pH环境，仍然有很好的荧光效果，可以实现对细胞内pH振荡变化的有效响应。
综上所述，本发明提供的具有pH响应的双模式成像探针，其最大吸收波长随着pH降低由670nm红移到760nm，能有效避开组织自吸收和自荧光，在pH3.5～10.0时，其在激发光760nm、670nm下发射波长790nm处的荧光强度之比(简写为F760/F670)随着pH的降低而逐渐增强，该探针对H+有较高的灵敏度、高选择性；另外，该探针在吸收波长760nm、680nm下的光声信号比随着pH降低而逐渐增强，表现出明显的pH依赖的光声信号变化性，该探针很适合在荧光-光声双模式下进行肿瘤pH的检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种具有pH响应的双模式成像探针，其特征在于，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
2.如权利要求1所述的双模式成像探针，其特征在于，所述X为-C(CH3)2-，所述Y为I，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基。
3.一种具有pH响应的双模式成像探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别提供化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物：
式中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基；
(2)将所述化学结构式如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的化合物按照摩尔比为1:4-1:5的比例溶解在溶剂中，再加入缚酸剂，保护气体氛围下，在50℃-70℃反应下1-5h，提纯后得到具有pH响应的双模式成像探针，所述具有pH响应的双模式成像探针的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述X为-C(CH3)2-，所述Y为I，所述R1和所述R2均为H原子，所述R3和所述R4均为乙基。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或乙腈。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为三乙胺、N，N-二异丙基乙胺或吡啶。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂与所述化学结构式如式(Ⅱ)的化合物的摩尔比为(2-6)：1。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提纯的方法为：反应结束后旋蒸除去溶剂，真空干燥12h，过硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，除去溶剂，即得所述具有pH响应的双模式成像探针。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化学结构如式(Ⅱ)所示的化合物采用以下方法制得：
提供化学结构式如式(Ⅳ)
式中，X为-C(CH3)2-、-O-、-S-或-Se-，Y为F、Cl、Br或I，R1和R2分别独立地选自H原子、C1-18烷基或-SO3R5，R5为C1-18烷基或苄基，R3和R4分别独立地选自C1-18烷基或苄基；
将化学式如(Ⅳ)所示的化合物和按摩尔比为1：(3-6)的比例溶解在第二溶剂中，保护气体氛围下，在60℃-80℃进行反应1-2h，提纯后制得化学式如式(Ⅱ)所示的化合物。
10.如权利要求1或如权利要求3所述的方法制得到的具有pH响应的双模式成像探针在制备肿瘤的早期检测、诊断、治疗或诊疗的药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |