CN105646698A - 一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途 - Google Patents

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CN105646698A CN201511008430.9A CN201511008430A CN105646698A CN 105646698 A CN105646698 A CN 105646698A CN 201511008430 A CN201511008430 A CN 201511008430A CN 105646698 A CN105646698 A CN 105646698A
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途。本发明明确了oxLDL能够上调TF表达，其是在LOX-1介导下启动的信号调控，重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明β2-GPIDV干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。除OxLDL与LOX-1的结合诱导TF表达引发血栓以外，二者的结合还可引发内皮细胞功能障碍、导致炎症介质的产生等，对于动脉粥样硬化血栓形成及其发展起到重要作用，因此本发明显示了重组β2-GPIDV在动脉粥样硬化血栓形成疾病方面的潜在治疗作用。

Description

一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种β2-糖蛋白第五结构域(β2-GPIDV)通过抑制和干预oxLDL与LOX-1的结合进而抑制TF和LOX-1的表达，显示了其在抑制动脉粥样硬化血栓形成疾病方面发挥可能的潜在治疗作用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以内膜粥样斑块或纤维斑块形成为病变特征的动脉疾病，主要累及大、中动脉，其临床表现主要有心绞痛、心律失常、心肌梗塞，甚至猝死。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是AS的独立危险因子，通过多种途径诱发疾病的发生。其中，巨噬细胞表面清道夫受体识别并内吞oxLDL进而导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞，是动脉粥样硬化疾病发生的关键事件。
研究表明，血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-likeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1，LOX-1)是病理条件下内吞oxLDL的一种主要的巨噬细胞表面清道夫受体。LOX-1除吞噬oxLDL导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞诱发AS发生外，还可促发信号转导，引发一系列病理变化，包括内皮细胞功能障碍、泡沫细胞形成及凋亡、炎性介质及基质金属蛋白酶分泌等，参与了AS的发生发展。
组织因子(TissueFactor，TF)是凝血过程的启动子，是决定斑块形成血栓的重要因素之一。研究显示，动脉粥样硬化斑块内含有主要由巨噬细胞贡献表达的组织因子以及巨噬细胞凋亡产生的具有促栓活性的“微粒TF”。当斑块破裂后，这些组织因子以及“微粒TF”便暴露于血浆中，通过其胞外区与活化的凝血因子Ⅶ(FⅦa)结合，启动外源性凝血过程，产生凝血酶和纤维蛋白，活化血小板，最终形成血栓及产生相关并发症。此外，TF还通过增加斑块内炎症反应、促进平滑肌细胞的增生和迁移，导致血管重构形成等方面削弱了动脉斑块的稳定性，从而加快了斑块破裂和血栓形成的进程。
通常情况下，巨噬细胞表达低水平TF，但当受到某些因素刺激，可上调表达TF。研究显示，oxLDL是诱导巨噬细胞TF上调表达的关键致病因素之一。然而LOX-1作为巨噬细胞表面主要清道夫受体，在结合oxLDL介导内吞同时是否介导oxLDL诱导的TF上调表达还未见有报道。
前期的工作基础显示，利用酵母表达的β2-GPIDV通过oxLDL阴性磷脂表位结构与oxLDL相结合，这种结合是否干预了oxLDL与受体LOX-1的结合，进而抑制了oxLDL诱导的TF上调表达，还没有明确。
发明内容
本发明的目的为，明确oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控的，进一步发现重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，进一步利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明这种抑制作用的分子机理在于干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。
(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达。
(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量。
通过设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况。实验数据显示10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达显著上调(差异显著，P<0.05)
引物由大连宝生物公司合成，
β-actin上下游引物如下：上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，
下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；
TF上下游引物如下：上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，
下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；
LOX-1上下游引物如下：上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，
下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′。
(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量。
10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达显著上调(差异显著，P<0.05)。
(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX-1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量显著下调。
与scrambledsiRNA相比，LOX-1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量显著下调，以上说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控。
(二)β2-糖蛋白第五结构域(β2-GPIDV)干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX-1和TF蛋白表达。
22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2-GPIDV分别和10μg/mL的oxLDL共同刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX-1和TF蛋白表达量显著下调，且重组β2-GPIDV浓度越大，抑制率越高。表明重组β2-GPIDV浓度依赖性的抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达。
(三)建立过表达人LOX-1基因的293T细胞模型，并检测过表达情况
通过设计一对引物以LOX-1片段为模板通过PCR扩增获得LOX-1基因片段，并克隆到表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc上，构建表达质粒pIRES2-LOX-1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微镜检测质粒转染效率，RT-PCR和WesternBlot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基因表达定位及其功能。结果表明，LOX-1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜上，具有结合oxLDL的生物学活性。
引物由大连宝生物公司合成，上下游引物如下：
上游引物(引物1)：
5′-CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG-3′
下游引物(引物2)：
5′-TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′
其中，上游引物中5′端含有保护碱基、NheI酶切位点(单划线)以及LOX-1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoRI酶切位点(单划线)、LOX-1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子。
(四)β2-GPIDV抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达的分子机理。
利用上述建立的表达LOX-1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2-GPIDV对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用。结果显示β2-GPIDV浓度依赖性的干预oxLDL与DiI-oxLDL的结合。
据此，本发明中，明确了oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控。进一步发现重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，进一步利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明这种抑制作用的分子机理在于干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。除OxLDL与LOX-1的结合诱导TF表达引发血栓以外，二者的结合还可引发内皮细胞功能障碍、导致炎症介质的产生等，对于动脉粥样硬化血栓形成及其发展起到重要作用。因此本发明显示了重组β2-GPIDV在动脉粥样硬化血栓形成疾病方面的潜在治疗作用。
附图说明
图1为不同浓度oxLDL刺激，基因水平检测LOX-1和TF在小鼠巨噬细胞J774A.1中表达结果图；其中：A.LOX-1mRNA表达结果图；B.TFmRNA表达结果图。
图2为不同浓度oxLDL刺激，蛋白水平检测LOX-1和TF在J774A.1细胞中表达结果图；其中：A.LOX-1蛋白表达结果图；B.TF蛋白表达结果图。
图3为基因沉默J774A.1细胞LOX-1,WesternBlot检测TF表达结果图，scramble：对照组。
图4为WesternBlot检测β2-GPIDV纯化效果图，M：proteinmarker：标准，kDa，蛋白分子量，千道尔顿；15kDa，10kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。
图5为β2-GPIDV纯化样品SDS-PAGE纯度检测图，M：proteinmarker：标准，kDa，蛋白分子量，千道尔顿；25kDa，15kDa，10kDa分别代表不同分子量大小标准蛋白。
图6为WesternBlot检测β2-GPIDV对J774A.1细胞LOX-1和TF表达抑制结果图；其中：A.LOX-1蛋白表达结果图；B.TF蛋白表达结果图。
过表达人LOX-1基因293T细胞模型建立、检测及功能研究：
图7为LOX-1的PCR琼脂糖电泳；其中：泳道1:LOX-1基因PCR结果；M：DL2000marker。
图8为LOX-1-T-载体构建验证结果图；其中：A.LOX-1-T-载体菌体PCR结果图，M：DL2000marker，泳道1-7：1-5号阳性菌落菌液PCR结果；6-7号阴性菌落菌液PCR；B.LOX-1-T-载体双酶切结果图，M：DL2000marker，泳道1:PCR验证为阳性的菌株，经过提质粒后，LOX-1-T-载体双酶切结果。
图9为LOX-1-表达载体构建验证结果图；其中，A.LOX-1-表达载体菌体PCR结果图，M：DL2000marker，泳道1-5：1，4号阳性菌落菌液PCR结果，泳道2，3，5号阳性菌落菌液PCR结果；B.LOX-1-表达载体双酶切结果图，M：DL2000marker，泳道1-5:1为pIRES2-LOX-1质粒，2，3:NheI/EcoRI酶切不成功，Lane4，5:酶切成功。
图10为pIRES2-LOX-1转染293T细胞荧光情况鉴定；其中，空载体组为转染空载体的293T细胞不同时间荧光情况鉴定结果图；重组质粒组为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞不同时间荧光情况鉴定结果图。
图11为基因和蛋白水平检测LOX-1在293T细胞表达结果图；其中，A.RT-PCR检测LOX-1基因在293T细胞中的表达，泳道1为未转染的293T细胞检测LOX-1基因图；泳道2为转染空表达载体的293T细胞检测LOX-1基因图；泳道3为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞检测LOX-1基因图；M：DL2000marker；B.WesternBlot检测LOX-1在293T细胞中的表达，泳道1为未转染的293T细胞检测LOX-1图；泳道2为转染空表达载体的293T细胞检测LOX-1图；泳道3为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞检测LOX-1图；M：DL2000marker。
图12为激光共聚焦检测LOX-1在细胞膜上表达的结果；a，b均为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞，其中a为未加抗LOX-1抗体检测LOX-1在细胞膜上表达的情况；b为加入抗LOX-1抗体检测LOX-1在293T细胞膜上表达的情况。
图13为激光共聚焦检测LOX-1在细胞膜上的生物活性结果；其中，A.4℃条件下293T细胞过表达LOX-1结合DiI-oxLDL的图谱，图a为转染空表达载体的293T细胞结合DiI-oxLDL的图谱；图b为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞结合DiI-oxLDL的图谱；B.37℃条件下293T细胞过表达LOX-1结合DiI-oxLDL的图谱，图a为转染空表达载体的293T细胞结合DiI-oxLDL的图谱；图b为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞结合DiI-oxLDL的图谱。
图14为流式细胞仪定量检测β2-GPIDV对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用结果图；
其中，①为转染空表达载体的293T细胞流式图，②为转染重组质粒pIRES2-LOX-1的293T细胞流式图：③为DiI-oxLDL孵育转染重组质粒的293T细胞流式图；④-⑥为不同浓度的β2-GPIDV与DiI-oxLDL共同孵育转染重组质粒的293T细胞流式图。
具体实施方式
现结合实施例对本发明进一步进行说明。
实施例1oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达。
1.1qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量。
接前一天换液的小鼠巨噬细胞于六孔板,24h后，细胞贴壁，孵育不同浓度oxLDL(0，2.5，5，10,20,50μg/mL)，4h后收集细胞，采用Trizol法常规提取小鼠巨噬细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成cDNA，具体操作参照试剂盒进行。
进一步地，通过设计β-actin、TF、LOX-1三对引物分别以上述cDNA为模板扩增，通过qPCR试剂盒获得基因片段，具体操作参照试剂盒进行。以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况。
上述引物由大连宝生物公司合成，
β-actin上下游引物如下：上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，
下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；
TF上下游引物如下：上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，
下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；
LOX-1上下游引物如下：上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，
下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′。
结果如图1：oxLDL浓度为10μg/mL时小鼠巨噬细胞J774A.1LOX-1和TFmRNA表达量与未加氧化低密度的阴性对照组比较均显著上调，LOX-1mRNA的表达量是阴性对照的20倍，TFmRNA的表达量是阴性对照的1.5倍。
1.2WesternBlot检测J774A.1蛋白水平表达LOX-1和TF量。
如上述孔设置，接前一天换液的J774A.1于六孔板,24h后，细胞贴壁，孵育不同浓度oxLDL，24h后收集细胞并裂解，BCA测定蛋白浓度，WesternBlot检测J774A.1细胞LOX-1和TF蛋白表达量。结果如图2：oxLDL浓度为10μg/mL时小鼠巨噬细胞J774A.1LOX-1和TF蛋白表达量与未加氧化低密度的阴性对照组比较均显著上调，LOX-1蛋白的表达量是阴性对照的2倍，TF蛋白的表达量是阴性对照的2.5倍。
1.3基因沉默J774A.1细胞LOX-1,WesternBlot检测TF表达。
(1)转染前一天，将5*105个J774A.1细胞接种于六孔板中，共接种2孔，使转染时的细胞密度达到50％左右。
(2)取7.5μL/孔SageLipoPlusTMTransfectionReagent(用前轻轻混匀)，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(3)1号孔各取10μL20μM的scrambled-siRNA，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，2号孔各取10μL20μM的LOX-1siRNA，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(4)稀释的SageLipoPlusTMTransfectionReagent(步骤(2))经过5min的孵育后，与稀释的siRNA轻轻混合，20min后，以形成转染试剂混合物。
6h后更换正常培养基。总共培养30h后，弃培养基。加入10μg/mL的oxLDL刺激，24小时后收集细胞做WesternBlot，结果如图3：LOX-1siRNA组TF的表达量与scrambledsiRNA组比较明显下调，证明了LOX-1在一定程度上参与了oxLDL诱导的巨噬细胞TF表达。
实施例2β2-GPIDV对J774A.1细胞LOX-1和TF表达抑制情况
2.1目的蛋白的诱导表达及纯化
(1)菌体发酵
1)将本实验室保存的表达人β2-GPIDV的毕赤酵母X-33工程菌接种至10mlBMGY中，培养24h作为种子培养基。
2)从种子液中取适量菌液接按1:200分别接种至1L的BMGY中，并培养24h。
3)1500rpm离心后弃上清，加100mlBMMY。每天补加1％甲醇。诱导表达96h
(2)蛋白纯化前的预处理
1)将发酵液6000rpm离心20min收取上清。
2)上清液用浓盐酸调节PH至8.0
3)6000rpm离心20min收集上清液。
4)冰上放置备用。
(3)蛋白上清液经镍柱亲和层析纯化
1)20mM咪唑洗柱，5个柱体积。
2)上清液上柱。
3)20mM咪唑洗柱，5个柱体积。
4)50mM咪唑洗柱，5个柱体积。
5)100mM咪唑洗去杂蛋白。
6)350mM咪唑洗柱洗下目的蛋白，5-8个柱体积，收集备用。
7)500mM咪唑洗柱子，5-8个柱体积，70％乙醇洗柱子5-8个柱体积，之后将层析柱放入4℃冰箱保存。
8)将350mM咪唑洗下的纯化蛋白收集液，经过孔径为3000Da的超滤离心管浓缩，浓缩至1-3ml，10％SDS-PAGE鉴定蛋白之后-80℃分装保存。结果如图4所示，蛋白经纯化后大量杂蛋白被去除，350mM咪唑洗柱洗下目的蛋白；另3000Da的超滤离心管浓缩350mM咪唑洗下的纯化蛋白收所得重组蛋白纯度在90％左右(图5)。
(4)BCA测定蛋白浓度
1)配制个浓度标准品
2)将纯化得到的蛋白液体分别按原液、2倍稀释、3倍稀释、5倍稀释液配制
3)按A液：B液为50:1的比例配制工作液。
4)96孔板个孔加入25ul样品或标准品和200ul工作液。
5)562nm下酶标仪度数。
2.2WesternBlot检测β2-GPIDV对J774A.1细胞LOX-1和TF表达的抑制情况
在六孔板中培养J774A.1，当细胞进入对数生长期时，加入不同浓度的β2-GPIDV(22、44、88、176μg/mL)与10μg/mL的oxLDL混合溶液及单独的10μg/mL的oxLDL处理培养J774A.1细胞24h，WesternBlot检测β2-GPIDV对J774A.1细胞LOX-1和TF表达的抑制情况，结果如图6所示，6.A证明β2-GPIDV浓度依赖性的减弱LOX-1的表达水平，当加入88μg/mLβ2-GPIDV和10μg/mL的oxLDL混合溶液与单独加10μg/mL的oxLDL组相比较抑制率即可达到50％；6.B证明β2-GPIDV浓度依赖性的减弱TF的表达水平，同LOX-1的抑制程度一致，加入88μg/mLβ2-GPIDV和10μg/mL的oxLDL混合溶液与单独加10μg/mL的oxLDL组相比较抑制率也可达到50％。
实施例3建立表达LOX-1的293T细胞模型，并检测其表达定位及生物学活性。
3.1PCR扩增LOX-1基因
引物由大连宝生物公司合成，上下游引物如下：
上游引物(引物1)：
5′-CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG-3′
下游引物(引物2)：
5′-TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′
其中，上游引物中5′端含有保护碱基、NheI酶切位点(单划线)以及LOX-1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoRI酶切位点(单划线)、LOX-1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子。
以LOX-1片段为模板，以引物1、2进行PCR，获得LOX-1基因片段。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR反应结束后，将PCR产物1％琼脂糖凝胶全部上样，电泳30min鉴定。结果如图7所示，PCR扩增得到的LOX-1基因经琼脂糖凝胶电泳分析，其条带大小为840bp与GeneBank所发布的大小一致。
3.2LOX-1基因的TA克隆
将上述PCR产物全部上样，1％琼脂糖凝胶，电泳30min后使用上海生工回收胶试剂盒回收得到目的基因，并连接至pMD19-TSimpleVector。将连接产物转化DH5α感受态菌，并涂到含有50μg/mLAmp抗性的LB平板，37℃培养过夜。
(1)菌体PCR鉴定目的基因是否正确连接到T载体。
分别用枪头随机挑取1，2，3，4，5，6，7号单菌落于5μldH2O中，置于PCR管中，标号1，2，3，4，5，6，7号管。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经过1％琼脂糖凝胶全电泳进行鉴定，结果如图8.A所示，可见条带大小为840bp与目的基因LOX-1大小一致。
(2)双酶切法鉴定目的基因与T载体连接情况
挑取PCR鉴定为阳性的菌株，接种于10ml含50μg/mL、Amp抗性的LB培养基，37℃过夜培养，使用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切。酶切体系：20μL，载体1.5μL(1μg)，NheI和EcoRI各1μL，Fastdigest*10buffer2μL，其余用水补齐。37℃酶切过夜，将酶切产物1％琼脂糖凝胶上样，电泳30min进行鉴定，如图8.B所示，所得条带为840bp与目的基因LOX-1片段大小一致，由此证明目的基因成功连入T载体中，获得pMD19-T-LOX-1克隆载体。
(3)T载体测序鉴定
挑去阳性菌落进行培养，将菌液送交上海生工进行测序。使用Sequencher4.7将测序结果与GenBank发表的序列进行比对分析。
3.4将目的基因与表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc连接
(1)提取pMD19-T-LOX-1质粒及pIRES2-AcGFP1-Nuc空质粒，并分别对两者进行NheI、EcoRI双酶切。酶切体系：40μL，载体3μL(2μg)，NheI和EcoRI各2μL，Fastdigest*10buffer4μL，其余用水补齐。37℃酶切过夜，将两者的酶切产物1％琼脂糖凝胶全部上样，电泳30min进行结果鉴定。鉴定酶切结果后使用上海生工回收胶试剂盒，分别回收DNA片段。
(2)目的基因与表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc连接
使用宝生物TaKaRaDNALigationKitVer.2.0连接试剂盒，将目的基因与表达载体连接，并转化入克隆菌株DH5α中。连接体系：10μL，载体1μL(0.089pmol)，T4Ligase1μL，LOX-1片段4μL(0.3pmol)，10*Buffer1μL，其余用水补齐。22℃连接1h，连接后转化DH5α感受态细胞再涂到含有50μg/mLKana抗性的lowsaltLB平板。
(3)PCR法鉴定目的基因与表达载体的连接情况
用菌体PCR方法对转入DH5α菌中连有目的基因的表达载体进行鉴定：随机用枪头挑取单菌落1，2，3号于含有5μldH2O的PCR管中，并在PCR管上标相应序列号。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物1％琼脂糖凝胶全部上样，电泳30min进行鉴定，结果如图9A所示，可见条带大小840bp与目的基因大小一致。
(4)双酶切鉴定
挑取PCR鉴定中亮度最强的菌株，接种于10mL含50μg/mL的Kana抗性的LB培养基，37℃过夜培养，使用上海生工质粒提取试剂盒提取质粒并进行双酶切。酶切体系：20μL，载体1.5μL(1μg)，NheI和EcoRI各1μL，Fastdigest*10buffer2μL，其余用水补齐。37℃酶切1h，将酶切产物1％琼脂糖凝胶上样，电泳30min进行结果鉴定，结果如图9B所示，所得条带为840bp与目的基因片段大小一致，由此证明目的基因LOX-1成功连入pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体。
3.5pIRES2-LOX-1载体转染293T细胞情况鉴定
pIRES2-LOX-1载体转染293T细胞
(1)转染前一天，将5*105个293T细胞接种于六孔板中，共接种两孔，使转染时的细胞密度达到60％左右。
(2)取10μL/孔Lipofectamine2000(用前轻轻混匀)，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(3)1、2号孔中各取4μg空载体质粒和重组质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(4)稀释的Lipofectamine2000(步骤(2))经过5min的孵育后，与稀释的质粒轻轻混合，20min后，以形成转染试剂混合物。
(5)37℃培养6小时，去除转染液，加入DMEM完全培养基，37℃继续培养。
转染后，每12h于倒置导致荧光显微镜下观察空载体组和重组载体组荧光情况。结果如图10所示，293T细胞转染双顺反子空载体pIRES2-AcGFP1-Nuc和双顺反子重组表达载体pIRES2-LOX-124h后，倒置荧光显微镜下可见转重组质粒组细胞发出很强的绿色荧光，且随着时间延长，荧光强度逐渐增强，与之相比较，空载体组细胞荧光强度很弱，结果表明pIRES2-LOX-1双顺反子表达载体成功转染至293T细胞，并初步证明了LOX-1基因在293T细胞中得到表达。
3.6基因和蛋白水平检测LOX-1在293T细胞表达
(1)RT-PCR检测LOX-1基因在293T细胞中的表达
使用RNAiso-Plus裂解293T细胞，提取转染与未转染的细胞的RNA，以此RNA为模板进行逆转录，合成与之相应的cDNA，再加入LOX-1引物与DNA聚合酶完成PCR，由此便可知LOX-1目的基因在293T中的表达情况。如图11A所示，未转染和转染空载体的293T细胞组没有出现条带，而转染重组质粒的LOX-1出现条带，因此我们可知LOX-1基因在293T细胞中表达成功。
(2)WesternBlot检测LOX-1在293T细胞中的表达
使用RIPA蛋白裂解液裂解293T细胞，提取转染与未转染细胞的蛋白质，BCA测定蛋白浓度，然后按照WesternBlot步骤检测LOX-1在293T细胞中的表达情况。结果如图11B所示，未转染和转染空载体的293T细胞组没有出现LOX-1条带，而转染重组质粒的LOX-1出现条带，因此我们可知LOX-1蛋白在293T细胞中得到表达。
3.7激光共聚焦检测LOX-1在293T细胞膜上表达
(1)转染前一天，将5*105个293T细胞分别接种于2个激光共聚焦小皿中使转染时的细胞密度达到60％左右。
(2)取10μL/孔Lipofectamine2000(用前轻轻混匀)，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(3)1、2号小皿中各取4μg重组质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(4)稀释的Lipofectamine2000(步骤(2))经过5min的孵育后，与稀释的质粒轻轻混合，20min后，以形成转染试剂混合物。
6h后更换正常培养基。总共培养48h后，弃培养基，用PBS清洗3次。加入4％多聚甲醛固定15min，1％BSA37℃封闭1h后，PBS清洗3次，0.1％TritonX-100通透15min。2号小皿中加入抗LOX-1的抗体(用PBS以1:100的比例稀释)，同时1号小皿加等量PBS，同时在37℃环境下培养2h。PBS清洗3次。用罗丹明标记抗鼠二抗(1:100)1h。用PBS清洗3次，上机检测。结果如图12，与对照组未加抗LOX-1抗体的293T细胞相比较，加入抗LOX-1抗体组的293T细胞明显能看到细胞膜有一圈红色，说明LOX-1在293T细胞膜上表达成功。
3.8激光共聚焦检测LOX-1在细胞膜上的生物活性
(1)转染前一天，将5*105个293T细胞分别接种于4个激光共聚焦小皿中，使转染时的细胞密度达到50％左右。
(2)取10μL/孔Lipofectamine2000(用前轻轻混匀)，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(3)1，3号小皿取4μg空载体的质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释；2，4号小皿取4μg转LOX-1的质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(4)稀释的Lipofectamine2000(步骤(2))经过5min的孵育后，与稀释的质粒轻轻混合，20min后，以形成转染试剂混合物。
6h后更换正常培养基。总共培养48h后，弃培养基，在小皿中央各加入100μL20μg/mL的DiI-oxLDL，1、2号小皿于4℃继续培养1h，3、4号小皿于37℃继续培养1h。之后，用PBS清洗3次，上机检测。结果如图13，与对照转染空载体的293T细胞相比较，转染LOX-1的293T细胞明显能看到细胞膜有一圈红色，说明在293T细胞膜上表达的LOX-1能够与oxLDL结合，且在37℃条件下LOX-1与DiI-oxLDL结合效果更明显。
实施例4利用表达LOX-1的293T细胞模型检测β2-GPIDV对oxLDL与LOX-1结合的影响
利用上述建立的表达LOX-1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2-GPIDV对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用
(1)转染前一天，将5*105个293T细胞接种于两个六孔板中，共接种6个孔，使转染时的细胞密度达到50％左右。
(2)取10μL/孔Lipofectamine2000(用前轻轻混匀)，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(3)1号孔取4μg空载体的质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释；2-6号孔取4μg转LOX-1的质粒，用250μLOpti-MEMIReducedSerumMedium培养基稀释，轻轻混合均匀。
(4)稀释的Lipofectamine2000(步骤(2))经过5min的孵育后，与稀释的质粒轻轻混合，20min后，以形成转染试剂混合物。
6h后更换正常培养基。总共培养48h后，弃培养基。③号孔加入800μL20μg/mL的DiI-oxLDL，④号孔加入800μL22μg/mL的β2-GPIDV和20μg/mL的DiI-oxLDL混合液，⑤号孔加入800μL44μg/mL的β2-GPIDV和20μg/mL的DiI-oxLDL混合液，⑥号孔加入800μL88μg/mL的β2-GPIDV和20μg/mL的DiI-oxLDL混合液，4℃继续培养1h。用PBS清洗3次，PBS吹下，上机检测。结果如图14，β2-GPIDV能够抑制LOX-1与oxLDL的结合，且加入88μg/mLβ2-GPIDV和20μg/mL的DiI-oxLDL混合溶液与单独加20μg/mL的DiI-oxLDL组相比较抑制率也可达到50％以上。
<110>大连大学
<120>一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
attgccgacaggatgcagaa20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
gctgatccacatctgctggaa21
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<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
cccaaacccgtcaatcaagtc21
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<212>DNA
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ccaagtacgtctgcttcacat21
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<212>DNA
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ggtgctgggcatgcaattat20
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<211>24
<212>DNA
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catttccttgagttcgttttctga24
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ctagctagcatgacttttgatgacctaaag30
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<212>DNA
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<400>8
ttggaattctcactgtgctcttaggtttgc30

Claims (1)

1.一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途，其特征在于，步骤为：
(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达
(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量
设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，三对引物分别为：
β-actin上下游引物如下：
上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，
下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；
TF上下游引物如下：
上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，
下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；
LOX-1上下游引物如下：
上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，
下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′，
以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况，数据显示10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达上调，P<0.05；
(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量
10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达上调，P<0.05；
(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX-1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量下调
与scrambledsiRNA相比，LOX-1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量下调，以上说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控；
(二)beta2-糖蛋白第五结构域β2-GPIDV干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX-1和TF蛋白表达
22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2-GPIDV分别和10μg/mL的oxLDL共同刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX-1和TF蛋白表达量下调，且重组β2-GPIDV浓度越大，抑制率越高，表明重组β2-GPIDV浓度依赖性的抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达；
(三)建立表达人LOX-1基因的293T细胞模型，并检测其表达定位及生物学功能
设计一对上下游引物，如下：
上游引物：5′-CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG-3′
下游引物：5′-TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′
其中，上游引物中5′端含有保护碱基、NheI酶切位点(单划线)以及LOX-1的5′端部分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoRI酶切位点(单划线)、LOX-1的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子；
将引物以LOX-1片段为模板通过PCR扩增获得LOX-1基因片段，并克隆到表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc上，构建表达质粒pIRES2-LOX-1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微镜检测质粒转染效率，RT-PCR和WesternBlot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基因表达定位及其功能，结果表明，LOX-1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜上，具有结合oxLDL的生物学活性；
(四)β2-GPIDV抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达的分子机理
利用上述建立的表达LOX-1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2-GPIDV对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用，结果显示β2-GPIDV浓度依赖性的干预oxLDL与DiI-oxLDL的结合。
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ES2922403A1 (es) * 2021-03-03 2022-09-14 Fundacion Para La Investigacion Biomedica Del Hospital Univ La Paz Fibhulp Biomarcadores para el pronóstico de pacientes que han sufrido una hemorragia subaracnoidea aneurismática (SAH)

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