CN105646375A - 具有抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂nxgf和nxgh及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR？TKI)NXGF和NXGH及其制备方法和应用，属于生物医药领域。本发明通过对Pelitinib的化学结构进行优化和改进，得到了全新的EGFR？TKI，分别命名为NXGF(式I)和NXGH(式II)，研究表明本发明合成的EGFR？TKI—NXGF和NXGH能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，与Pelitinib相比，对突变EGFR肺癌细胞系HCC827具有更强的抑制增殖作用，因此在临床上可作为抗肿瘤剂应用。此外，本发明还公开了制备所述具抗肿瘤活性的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂NXGF和NXGH的方法。本发明的提出为肿瘤治疗，特别是非小细胞肺癌的治疗提供了一种有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及喹唑啉类化合物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的EGFRTKI—NXGF和NXGH及其制备方法，本发明还涉及该药作为抗肿瘤剂的应用，属于生物医药领域。
背景技术
目前发现的EGFR酪氨酸激酶(EGFRTK)可以催化ATP的高能磷酸键转移到EGFR的数个酪氨酸位点，使其磷酸化，从而激活下游的PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路，促进细胞进生长增殖、代谢，抑制细胞凋亡。细胞中EGFR过度表达和突变时，会阻碍细胞程序死亡，使细胞的生长调节失控，而获得无限增殖和侵袭能力，即发展成为恶性肿瘤细胞。EGFRTKI通过与ATP竞争胞内酪氨酸激酶的结合位点,阻止受体内酪氨酸的自身磷酸化,抑制EGFR酪氨酸激酶激活,从而抑制肿瘤细胞生长、加速肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成和肿瘤细胞浸润、转移。小分子EGFRTKI的基本结构为喹唑啉胺。EGFRTKI可分为：1)可逆性TKI主要有：吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Lapatinib)，2)不可逆性TKI主要有：阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)。目前，可逆性和不可逆性EGFRTKI对突变EGFR非小细胞肺癌短时间内具有显著的疗效，但最终均因产生获得性耐药而导致治疗失败，并没有明显延长患者的生存期。因此，开发和研制具有更强、更持久抗肿瘤活性的新型EGFRTKI将可能为突变EGFR非小细胞肺癌患者带来生机。
发明内容
本发明的目的之一是研发全新的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFRTKI)—NXGF和NXGH，其机制是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化从而促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和侵袭、转移；
本发明的目的之二是发现NXGF和NXGH对突变EGFR肺癌细胞系具有较强的抑制活性。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过对不可逆性分子靶向抗癌药物—Pelitinib(EKB-569)化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFRTKI—NXGF和NXGH，其具有更好的水溶性和更小的毒副作用，同时对突变EGFR非小细胞肺癌具有较强抑制活性，并阐明其机制是通过抑制肿瘤细胞表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化，阻碍下游信号通路活化，从而抑制肿瘤细胞生长、增殖，促进肿瘤细胞凋亡。
本发明的一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐，命名为NXGF或NXGH，其中，所述的NXGF的分子结构式如式I所示，所述的NXGH的分子结构式如式II所示:
当然，可以制备本发明化合物酸加成的盐，这些盐包括在本发明之中。
本发明化合物的酸加成盐优选为药学上可接受的，与适当的酸(例如盐酸、醋酸、硫酸)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。
进一步的，本发明还提出了所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。
其中，所述的促进肿瘤细胞凋亡是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化而实现的。
其中，优选的，所述的肿瘤细胞为EGFR突变的非小细胞肺癌细胞。
更进一步的，本发明还提出了一种制备以上所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐的方法，包括：
(1)氮气保护下将60g2-氨基-4氯苯甲酸和315ml甲酰胺混合于160℃下反应10h，冷却后倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用水和甲醇洗涤，最后用乙醚和正己烷各洗涤一次，抽干得到浅棕色固体，即化合物一；
(2)将38ml浓硫酸加入单颈瓶中，降温至0℃以下，滴加36ml浓硝酸，保持温度在5℃以下，分批加入12.0g化合物一，加毕于95-100℃反应2-2.5h后冷却，倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，旋干，用220ml醋酸重结晶一次，再用醋酸结晶一次，得到黄色固体，即化合物二；
(3)将4.60g化合物二和7.80g甲醇钠的80mL甲醇溶液加入到密闭容器中，于100-105℃下反应18-20h，冷却，加入醋酸调pH至中性，旋去溶剂，加入水，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，抽干，滤饼用乙醇带干水分，抽干旋干得到产物，即化合物三；
(4)将4.00g化合物三，27.0g三氯氧磷，2.6g三乙胺，100ml二氯乙烷的混合物于95℃下回流反应4-5h，冷却抽滤旋干，二氯甲烷溶解，冰水洗涤，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，使用二氯甲烷：乙酸乙酯体积比＝16:1的混合溶液洗脱，得到产物，即化合物四；
(5)氮气保护下将2.5g化合物四，1.6g3-氯-4-氟苯胺，250ml异丙醇的混合物于100-105℃回流反应3h，冷却抽滤，滤饼用少量异丙醇和乙醚洗涤，干燥得到黄色固体产物，即化合物五；
(6)氮气保护下将3.0g化合物五溶于45mlDMF中于150℃分批投入2.0g氯化锂，共反应3h，冷却，倒入冰水中，抽滤，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝30:1、20:1以及10：1的混合溶液进行洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到黄色固体，即化合物六；
(7)20.0g三缩四乙二醇和10.2g三乙胺加入反应瓶中，加入300ml乙腈，冰浴降温至0-5℃，将19.0gTsCl溶入100ml乙腈缓慢滴入该溶液中，1h滴完，滴完后升至20-25℃反应12-14h，旋去溶剂，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1以及1.5:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1的洗脱液中得到油状产品，即化合物十八，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1.5:1的洗脱液中得到油状物，即化合物十九。
(8)氮气保护下将12.0g化合物十八和2.4g咪唑，1.0g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100ml的二氯甲烷中，体系冷却至0-5℃，滴加含有11.4g叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)的20mL的二氯甲烷溶液，加毕继续于0-5℃下反应1-1.5h，倒入水中，分层，水层用二氯甲烷萃取，干燥浓缩后进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝8:1、6:1以及4:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4：1的洗脱液中得到油状产品，即化合物二十一。
(9)氮气保护下将2.9g化合物六，12.2g碳酸钾，100mlDMF的混合物于90℃下滴加含有6.18g化合物二十一的60ml二甲基甲酰胺溶液(DMF)，1h滴完，反应2h，旋干DMF，加入氯化铵溶液，乙酸乙酯萃取旋干，进行柱层析分离，使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:2的混合溶液洗脱2-3遍，得到黄色固体，即化合物八；
NXGF的制备：
(10)氮气保护下将0.85g化合物八，5.3g铁粉，0.28g氯化铵，5ml水，30ml乙醇的混合物于95℃反应1.5-2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到黄色油状物，即化合物十四；
(11)氮气保护下将10g巴豆酸，23gN-溴代丁二酰亚胺(NBS)，160ml苯混合加热回流80℃分批加入570mgAIBN，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体，即化合物十七；
(12)氮气保护下将0.89g化合物十七溶入5ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.76g草酰氯，保温反应10min，然后于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮气保护下将0.74g化合物十四，1.25g三乙胺，10ml二氯甲烷混合冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液中，缓慢滴加控温为0-5℃，滴加完毕反应30min，加入饱和氯化铵溶液中，用二氯甲烷萃取，干燥后旋干后进行柱层析分离，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1以及30:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到油状产品，即化合物十五；
(13)氮气保护下将0.35g化合物十五溶入8ml四氢呋喃中，冷却至0-5℃，加入12ml二甲胺的四氢呋喃溶液于0-5℃下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干后进行柱层析分离，使用含有0.5％三乙胺的二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1的混合溶液进行洗脱，得到产品，即化合物十六，即为EGFRTKI—NXGF化合物；
NXGH的制备：
(14)氮气保护下将1.80g化合物八，9.20g铁粉，1.20g氯化铵，1.4ml水，20ml乙醇混合均匀，95℃回流反应2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干母液，氮气加压下进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到黄色油状物，即化合物九；
(15)氮气保护下将10g巴豆酸，23gNBS，160ml苯的混合物于80℃下回流反应1.5-2h，分批加入570mg偶氮二异丁腈(AIBN)，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体，即化合物十七；
(16)氮气保护下将0.84g化合物十七溶入6ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.72g草酰氯，保温反应10min，于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮气保护下将1.57g化合物九，1.76g三乙胺，10ml二氯甲烷的混合物冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液，缓慢滴加控温0-5℃，滴加完毕于0-5℃反应30min，加入饱和氯化铵溶液，用二氯甲烷萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60：1以及40：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝40：1的洗脱液中得到油状产品，即化合物十；
(17)氮气保护下将1.10g化合物十溶入15ml四氢呋喃中，冷却至0-5℃，加入24ml二甲胺的四氢呋喃溶液于0-5℃下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30：1、20：1以及10：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到黄色油状产品，缓慢变成固体，即化合物十一；
(18)氮气保护下将0.77g化合物十一溶入8ml四氢呋喃中，然后加入含有0.38g四丁基氟化铵的三水合物的4ml四氢呋喃溶液，于25℃搅拌反应2.5h，旋干进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到米白色固体，即化合物十二，即为EGFRTKI—NXGH化合物。
本发明通过对Pelitinib(EKB-569)化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFRTKI—NXGF和NXGH，经生物活性评价，本发明EGFRTKI—NXGH能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，具有优秀的抗肿瘤活性，在临床上可作为肿瘤剂应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由有效量的本发明化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受用量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。将有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明化合物。
附图说明
图1为本发明EGFRTKI-NXGF的分离路线图；
图2为本发明EGFRTKI—NXGH化合物的分离路线图；
图3为NXGF的高效液相色谱(HPLC)结果；
图4为NXGH的高效液相色谱(HPLC)结果；
图5为NXGF的质谱结果；
(1)1H-NMR；(2)19F-NMR；
图6NXGH的质谱结果(1H-NMR)；
图7为通过MTT法测定NXGF处理48小时后的细胞活力结果；
从图7结果可以看出NXGF可较强抑制HCC827细胞活力，IC50＝0.0021±0.0004μM，说明NXGF对突变EGFR肺癌细胞系具有明显的抑制作用(P<0.01)。
图8为通过MTT法测定NXGH处理48小时后的细胞活力结果。
从图8结果可以看NXGH可较强地抑制HCC827细胞活力，IC50＝0.0020±0.0005μM，说明NXGH对突变EGFR肺癌细胞系HCC827具有明显的抑制作用(P<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1EGFRTKI—NXGF以及EGFRTKI—NXGH的制备
所述的NXGF的分子结构式如式I所示，所述的NXGH的分子结构式如式II所示:
制备流程图如图1及图2所示，具体制备方法如下：
(1)氮气保护下将60g2-氨基-4氯苯甲酸和315ml甲酰胺混合于160℃下反应10h，冷却后倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用水和甲醇洗涤，最后用乙醚和正己烷各洗涤一次，抽干得到浅棕色固体43.0g(化合物一)，产率68.％；
(2)将38ml浓硫酸加入单颈瓶中，降温至0℃以下，滴加36ml浓硝酸，保持温度5℃以下，分批加入12.0g化合物一，加毕于95-100℃反应2-2.5h后冷却，倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，旋干，用220ml醋酸重结晶一次，再用醋酸结晶一次，得7.7g黄色固体(化合物二)，产率51.3％；
(3)将4.60g化合物二和7.80g甲醇钠的80mL甲醇溶液加入到密闭容器中，于100-105℃下反应18-20h，冷却，加入醋酸调pH至中性，旋去溶剂，加入水，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，抽干，滤饼用乙醇带干水分，抽干旋干得到4.00g产物(化合物三)，产率88.7％；
(4)将4.00g化合物三，27.0g三氯氧磷，2.6g三乙胺，100ml二氯乙烷的混合物于95℃回流反应4-5h，冷却抽滤旋干，二氯甲烷溶解，冰水洗涤，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，使用二氯甲烷：乙酸乙酯体积比＝16:1的混合溶液洗脱，得到2.6g产物(化合物四)，产率60.1％；
(5)氮气保护下将2.5g化合物四，1.6g3-氯-4-氟苯胺，250ml异丙醇的混合物于100-105℃回流反应3h，冷却抽滤，滤饼用少量异丙醇和乙醚洗涤，干燥得到3.6g黄色固体产物(化合物五)，产率90.0％；
(6)氮气保护下将3.0g化合物五溶于45mlDMF中，于150℃分批投入2.0g氯化锂，共反应3h，冷却，倒入冰水中，抽滤，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝30:1、20:1以及10：1的混合溶液进行洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到1.86g黄色固体(化合物六)，产率64.7％；
(7)20.0g三缩四乙二醇和10.2g三乙胺加入反应瓶中，加入300ml乙腈，冰浴降温至0-5℃，将19.0gTsCl溶入100ml乙腈缓慢滴入上述溶液中，1h滴完，滴完后升至20-25℃下反应12-14h，旋去溶剂，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1以及1.5:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1的洗脱液中得到12.9g油状产品(化合物十八)，产率35.9％，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1.5:1的洗脱液中得到5.4g油状物(化合物十九)，产率10.4％。
(8)氮气保护下将12.0g化合物十八和2.4g咪唑，1.0g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100ml的二氯甲烷中，体系冷却至0-5℃下滴加含有11.4g叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)的20mL的二氯甲烷溶液，加毕继续于0-5℃下反应1-1.5h，倒入水中，分层，水层用二氯甲烷萃取，干燥浓缩后，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝8:1、6:1以及4:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4：1的洗脱液中得到油状产品16.8g(化合物二十一)，产率83.1％；
(9)氮气保护下将2.9g化合物六，12.2g碳酸钾，100mlDMF的混合物于90℃下滴加含有6.18g化合物二十一的60ml二甲基甲酰胺(DMF)，约1h滴完，反应2h，旋干DMF，加入氯化铵溶液，乙酸乙酯萃取旋干，进行柱层析分离，使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:2的混合溶液洗脱2-3遍，得到3.4g黄色固体(化合物八)，产率52.4％；
NXGF的制备：
(10)氮气保护下将0.85g化合物八，5.3g铁粉，0.28g氯化铵，5ml水，30ml乙醇的混合物于95℃反应1.5-2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到黄色油状物0.76g(化合物十四)，产率95.0％。
(11)氮气保护下将10g巴豆酸，23gN-溴代丁二酰亚胺(NBS)，160ml苯混合加热回流，80℃下分批加入570mgAIBN，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体4.2g(化合物十七)，产率22.0％。
(12)氮气保护下将0.89g化合物十七溶入5ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.76g草酰氯，保温反应10min于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮保护下将0.74g化合物十四，1.25g三乙胺，10ml二氯甲烷混合冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液中，缓慢滴加控温为0-5℃，滴加完毕反应30min，加入饱和氯化铵溶液中，用二氯甲烷萃取，干燥后旋干后进行柱层析分离，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1以及30:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到0.35g油状产品(化合物十五)，产率36.3％；
(13)氮气保护下将0.35g化合物十五溶入8ml四氢呋喃中，冷却至0℃，加入12ml二甲胺的四氢呋喃溶液于该温度下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干后进行柱层析分离，使用含有0.5％三乙胺的二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1的混合溶液进行洗脱，得产品0.22g(化合物十六)，即为EGFRTKI—NXGF化合物，产率65.1％；
NXGH的制备：
(14)氮气保护下将1.80g化合物八，9.20g铁粉，1.20g氯化铵，1.4ml水，20ml乙醇，95℃回流反应2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干母液，氮气加压下进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到黄色油状物1.57g(化合物九)，产率90.8％；
(15)氮气保护下将10g巴豆酸，23gNBS，160ml苯的混合物于80℃下回流反应1.5-2h，分批加入570mg偶氮二异丁腈(AIBN)，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体4.2g(化合物十七)，产率22.0％。
(16)氮气保护下将0.84g化合物十七溶入6ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.72g草酰氯，保温反应10min，然后于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮气保护下将1.57g化合物九，1.76g三乙胺，10ml二氯甲烷混合冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液，缓慢滴加控温0-5℃，滴加完毕于该温度反应30min，加入饱和氯化铵溶液，用二氯甲烷萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60：1以及40：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝40：1的洗脱液中得到1.10g油状产品(化合物十)，产率58.2％；
(17)氮气保护下将1.10g化合物十溶入15ml四氢呋喃中，冷却至0-5℃，加入24ml二甲胺的四氢呋喃溶液(2.9M),于0-5℃下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30：1、20：1以及10：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到0.77g黄色油状产品，缓慢变成固体(化合物十一)，产率73.0％；
(18)氮气保护下将0.77g化合物十一溶入8ml四氢呋喃中，然后加入含有0.38g四丁基氟化铵的三水合物的4ml四氢呋喃溶液，于25℃搅拌反应2.5h，旋干进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到0.4g米白色固体(化合物十二)，即为EGFRTKI—NXGH化合物，产率72.7％。
NXGF和NXGH的高效液相色谱(HPLC)结果如图3和图4所示，从HPLC结果可以看出，本发明制备得到的IRSF以及IRSH药物纯度单一，无杂质。
NXGF和NXGH的质谱结果分别如图5和图6所示。
实施例2本发明NXGF和NXGH对突变EGFR非小细胞肺癌细胞系HCC827的抑制作用试验
1、供试化合物：NXGF，NXGH，由实施例1方法制备
2、试验方法：
取对数生长期的EGFR19外显子缺失突变EGFR非小细胞肺癌细胞系HCC827细胞，以10000个/孔接种于96孔板中，于37℃5％CO2条件下培养12小时后，给药组加入供试化合物，使其终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、30、40、60、80μM空白对照组为0.08％二甲基亚砜，于37℃5％CO2条件下培养72小时后，采用MTT比色法，于波长490nm处测定吸光度A值。根据A值计算药物对EGFR19外显子缺失突变EGFR非小细胞肺癌细胞系HCC827生长的半数抑制率(IC50)。
3、试验结果
图7为通过MTT法测定NXGF处理48小时后的细胞活力结果，从图7结果可以看出NXGF可较强抑制HCC827细胞活力，IC50＝0.0021±0.0004μM，说明NXGF对突变EGFR肺癌细胞系具有明显的抑制作用(P<0.01)。
图8为通过MTT法测定NXGH处理48小时后的细胞活力结果，从图8结果可以看NXGH可较强地抑制HCC827细胞活力，IC50＝0.0020±0.0005μM，说明NXGH对突变EGFR肺癌细胞系HCC827具有明显的抑制作用(P<0.01)。
试验结果表明，本发明化合物NXGF和NXGH对EGFR19外显子缺失突变EGFR肺癌细胞系HCC827均具有抑制增殖作用。
Claims (10)
1.表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐，命名为NXGF或NXGH，其特征在于所述的NXGF的分子结构式如式I所示，所述的NXGH的分子结构式如式II所示:
2.权利要求1所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途。其特征在于所述的促进肿瘤细胞凋亡是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化而实现的。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的肿瘤细胞为EGFR突变的非小细胞肺癌细胞。
5.一种制备权利要求1所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐的方法，包括：
(1)氮气保护下将60g2-氨基-4氯苯甲酸和315ml甲酰胺混合于160℃下反应10h，冷却后倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用水和甲醇洗涤，最后用乙醚和正己烷各洗涤一次，抽干得到浅棕色固体，即化合物一；
(2)将38ml浓硫酸加入单颈瓶中，降温至0℃以下，滴加36ml浓硝酸，保持温度在5℃以下，分批加入12.0g化合物一，加毕于95-100℃反应2-2.5h后冷却，倒入冰水中，抽滤，滤饼分别用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，旋干，用220ml醋酸重结晶一次，再用醋酸结晶一次，得到黄色固体，即化合物二；
(3)将4.60g化合物二和7.80g甲醇钠的80mL甲醇溶液加入到密闭容器中，于100-105℃下反应18-20h，冷却，加入醋酸调pH至中性，旋去溶剂，加入水，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，抽干，滤饼用乙醇带干水分，抽干旋干得到产物，即化合物三；
(4)将4.00g化合物三，27.0g三氯氧磷，2.6g三乙胺，100ml二氯乙烷的混合物于95℃下回流反应4-5h，冷却抽滤旋干，二氯甲烷溶解，冰水洗涤，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，使用二氯甲烷：乙酸乙酯体积比＝16:1的混合溶液洗脱，得到产物，即化合物四；
(5)氮气保护下将2.5g化合物四，1.6g3-氯-4-氟苯胺，250ml异丙醇的混合物于100-105℃回流反应3h，冷却抽滤，滤饼用少量异丙醇和乙醚洗涤，干燥得到黄色固体产物，即化合物五；
(6)氮气保护下将3.0g化合物五溶于45mlDMF中于150℃分批投入2.0g氯化锂，共反应3h，冷却，倒入冰水中，抽滤，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝30:1、20:1以及10：1的混合溶液进行洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到黄色固体，即化合物六；
(7)20.0g三缩四乙二醇和10.2g三乙胺加入反应瓶中，加入300ml乙腈，冰浴降温至0-5℃，将19.0gTsCl溶入100ml乙腈缓慢滴入该溶液中，1h滴完，滴完后升至20-25℃反应12-14h，旋去溶剂，进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1以及1.5:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4:1的洗脱液中得到油状产品，即化合物十八，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝1.5:1的洗脱液中得到油状物，即化合物十九；
(8)氮气保护下将12.0g化合物十八和2.4g咪唑，1.0g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100ml的二氯甲烷中，体系冷却至0-5℃，滴加含有11.4g叔丁基二苯基氯硅烷(TBDPSCl)的20mL的二氯甲烷溶液，加毕继续于0-5℃下反应1-1.5h，倒入水中，分层，水层用二氯甲烷萃取，干燥浓缩后进行柱层析分离，依次使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝8:1、6:1以及4:1的混合溶液进行洗脱，于正己烷：乙酸乙酯体积比＝4：1的洗脱液中得到油状产品，即化合物二十一；
(9)氮气保护下将2.9g化合物六，12.2g碳酸钾，100mlDMF的混合物于90℃下滴加含有6.18g化合物二十一的60ml二甲基甲酰胺溶液(DMF)，1h滴完，反应2h，旋干DMF，加入氯化铵溶液，乙酸乙酯萃取旋干，进行柱层析分离，使用正己烷：乙酸乙酯体积比＝1:2的混合溶液洗脱2-3遍，得到黄色固体，即化合物八；
NXGF的制备：
(10)氮气保护下将0.85g化合物八，5.3g铁粉，0.28g氯化铵，5ml水，30ml乙醇的混合物于95℃反应1.5-2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到黄色油状物，即化合物十四；
(11)氮气保护下将10g巴豆酸，23gN-溴代丁二酰亚胺(NBS)，160ml苯混合加热回流80℃分批加入570mgAIBN，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体，即化合物十七；
(12)氮气保护下将0.89g化合物十七溶入5ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.76g草酰氯，保温反应10min，然后于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮气保护下将0.74g化合物十四，1.25g三乙胺，10ml二氯甲烷混合冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液中，缓慢滴加控温为0-5℃，滴加完毕反应30min，加入饱和氯化铵溶液中，用二氯甲烷萃取，干燥后旋干后进行柱层析分离，使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1以及30:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到油状产品，即化合物十五；
(13)氮气保护下将0.35g化合物十五溶入8ml四氢呋喃中，冷却至0-5℃，加入12ml二甲胺的四氢呋喃溶液于0-5℃下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干后进行柱层析分离，使用含有0.5％三乙胺的二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1的混合溶液进行洗脱，得到产品，即化合物十六，即为EGFRTKI—NXGF化合物；
NXGH的制备：
(14)氮气保护下将1.80g化合物八，9.20g铁粉，1.20g氯化铵，1.4ml水，20ml乙醇混合均匀，95℃回流反应2h，冷却，抽滤，滤饼用二氯甲烷和甲醇泡洗，旋干母液，氮气加压下进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60:1、40:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，得到黄色油状物，即化合物九；
(15)氮气保护下将10g巴豆酸，23gNBS，160ml苯的混合物于80℃下回流反应1.5-2h，分批加入570mg偶氮二异丁腈(AIBN)，回流搅拌4h，冷却至0℃搅拌20-30min，抽滤，滤饼用甲苯洗涤，滤液旋干，用正己烷30ml回流提取，结晶三次后得到白色针状晶体，即化合物十七；
(16)氮气保护下将0.84g化合物十七溶入6ml二氯甲烷中冷却至0-5℃加入2滴DMF，滴加0.72g草酰氯，保温反应10min，于20℃下反应2h，另取一三颈瓶，氮气保护下将1.57g化合物九，1.76g三乙胺，10ml二氯甲烷的混合物冷却至0℃，滴加入上述反应好的酰氯溶液，缓慢滴加控温0-5℃，滴加完毕于0-5℃反应30min，加入饱和氯化铵溶液，用二氯甲烷萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝60：1以及40：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝40：1的洗脱液中得到油状产品，即化合物十；
(17)氮气保护下将1.10g化合物十溶入15ml四氢呋喃中，冷却至0-5℃，加入24ml二甲胺的四氢呋喃溶液于0-5℃下反应0.5h，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯萃取，干燥抽滤旋干，进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30：1、20：1以及10：1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝10：1的洗脱液中得到黄色油状产品，缓慢变成固体，即化合物十一；
(18)氮气保护下将0.77g化合物十一溶入8ml四氢呋喃中，然后加入含有0.38g四丁基氟化铵的三水合物的4ml四氢呋喃溶液，于25℃搅拌反应2.5h，旋干进行柱层析分离，依次使用二氯甲烷：甲醇体积比＝40:1、30:1以及20:1的混合溶液进行梯度洗脱，于二氯甲烷：甲醇体积比＝20:1的洗脱液中得到米白色固体，即化合物十二，即为EGFRTKI—NXGH化合物。
6.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于由有效量的权利要求1所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐和药学上可接受的载体或辅料组成。
7.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于所述药物组合物为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂或口服液。
8.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于含有0.1％-99％重量的权利要求1所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐。
9.如权利要求6所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于含有10-60％重量的权利要求1所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐。
10.权利要求6-9任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
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