CN105641011A

CN105641011A - 雪菊提取物及雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用

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Publication number: CN105641011A
Application number: CN201610080924.6A
Authority: CN
Inventors: 赵辉; 只德贤; 张鹏
Original assignee: Tianjin University of Commerce
Current assignee: Tianjin University of Commerce
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: CN105641011B

Abstract

本发明公开了一种雪菊提取物及雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用。本发明通过细胞实验和动物实验，将雪菊提取物分别给予肝星状细胞系LX-2以及CCl4诱发的肝纤维化大鼠模型后：细胞实验结果显示，雪菊提取物可以显著降低NF-kappa？B的DNA结合能力，下调纤维化标志物α平滑肌肌动蛋白和细胞基质蛋白I型胶原，促进LX-2细胞凋亡；体内结果显示，与模型组比较，雪菊提取物可降低肝纤维化大鼠的AST和ALT含量，降低肝胶原蛋白含量，减少α-SMA和ECM表达，超声破碎肝组织形成匀浆悬液，可见NF-kappa？B的DNA结合能力显著降低；所述的雪菊提取物可作为NF-kappa？B信号通路抑制剂用于治疗肝纤维化的药物或者功能食品。

Description

雪菊提取物及雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用

技术领域

本发明涉及雪菊的新用途，特别是雪菊提取物的新用途，即在制备治疗肝纤维化药物或者功能食品方面的新用途。

背景技术

肝纤维化由多种致病因子引发的慢性肝损伤导致，包括慢性病毒性肝炎、酒精毒性、自身免疫性疾病及遗传性代谢紊乱，其引起肝内纤维结缔组织异常增生，细胞外基质过度沉淀。肝纤维化的主要效应细胞是肝星状细胞hepaticstellatecells,HSCs)。生理情况下，HSCs位于肝窦与肝窦壁之间的Disse间隙内，具有存储维生素A等功能。然而，肝脏受损后HSCs被激活，转化成为具有收缩功能的肌纤维母细胞，分泌平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原，合成大量的细胞外基质，促进肝纤维化的形成。

NF-κB是炎症应答的主要介导者，NF-κB信号通路对于肝星状细胞的存活和肝脏内环境的自我平衡至关重要。NF-κB信号活化可以促进HSCs增殖，产生分泌平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原，合成大量的细胞外基质，促进肝纤维化的形成。抑制NF-κB活化可介导HSCs凋亡，抑制诸如α肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原产生，从而阻断肝纤维化的发展进程。因此，抑制NF-κB信号通路可能会作为一个潜在的肝纤维化治疗手段。

雪菊系菊科金鸡菊属植物，主要产地为新疆昆仑山，是一种珍贵药食两用植物。雪菊含有300多种天然成分，包括黄酮、维生素、氨基酸、多糖、有机酸、萜烯类等。现代药理学研究发现，雪菊是一种很强的抗氧化植物，其生物黄酮、萜类物质等成分可有效地清除体内的氧自由基，防止细胞变性衰老以及恶性转化，对于调节血压，降低血脂、预防糖尿病、肿瘤等疾病有积极的保健作用。

“新疆昆仑雪菊水提液对大鼠血脂的影响”《新疆农业大学学报》(2013,36:366-70)崔康康等人研究报道昆仑雪菊水提液可以显著下降SD大鼠血脂水平。

“ChemicalandnutraceuticalpropertiesofCoreopsistinctoria”《JournalofFunctionalFoods》(2015,13:11-20)LiminGuo等人报道当前雪菊的医学效应主要有抗衰老、降低血糖改善糖耐受、降血脂、降血压、抗氧化、抗凝等。

目前未检索到雪菊、雪菊提取物可用于治疗肝纤维化的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物方面的新用途。

本发明的另一目的是提供雪菊提取物及其雪菊总黄酮作为NF-κB信号通路抑制剂在制备治疗肝纤维化药物方面的新用途。

本发明的目的是通过下列的技术方案实现的：

本发明原料来源：

雪菊coreopsistinctoria：系菊科金鸡菊属植物，又名两色金鸡菊，原产美国中西部地区，主要分布在中国新疆昆仑山北麓海拔3000米雪线的部分地区。一年生草本植物，有降血压、降血脂和降血糖之功效。

本发明通过体外实验，给予人肝星状细胞LX-2雪菊总黄酮后，抑制LX-2增殖，促进LX-2凋亡，α-SMA和I型胶原表达量随着药物剂量增加逐渐减少。同时，雪菊总黄酮降低NF-κB的DNA结合活性，从而抑制NF-κB信号驱动的下游基因表达，导致促凋亡基因mRNA表达增多(如：BCL-X_S，RIP1)，抗凋亡基因mRNA表达减少(如：A20，FLIP)，从而造成肝星状细胞LX-2凋亡。

本发明通过体内试验，分别给予经CCl₄诱导的肝纤维化大鼠雪菊总黄酮以及雪菊提取物处理，发现大鼠血清AST和ALT水平显著降低，α-SMA和ECM表达减少，肝组织细胞匀浆经检测其NF-κB的DNA结合活性显著下降，表明雪菊提取物及其雪菊总黄酮具有抗大鼠肝纤维化，保护肝细胞，改善肝功能的功效。

本发明不仅证实雪菊提取物及其雪菊总黄酮具有对肝纤维化大鼠肝保护作用，而且证明其作用机理与雪菊提取物及其雪菊总黄酮可以抑制炎性转录因子NF-κB生物学活性，从而实现肝纤维化治疗的机理。

雪菊作为一种传统的药食两用植物，临床应用和日常保健的安全性非常高，在治疗肝纤维化药物治疗中不失为一种好的手段，拓宽了治疗肝纤维化的新方法，而且雪菊由于具有多重健康效应，为患者提供了非常有益的治疗选择。

因此，本发明提供雪菊、雪菊提取物、雪菊总黄酮能够用于治疗肝纤维化药物方面的新用途。

本发明还公开了雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物方面的应用，所述雪菊提取物的制备包括以下步骤：

将雪菊花干燥,采用PULVERISETTE14在15000rpm转速条件下粉碎后，沸水浴1小时，离心，取上清，通过直径0.22微米滤膜过滤，收集滤液。然后再向沸水浴锅内添加沸水，重复上述步骤2次，将3次滤液合并后置于旋转蒸发仪浓缩成水浸液，浓缩，干燥，得到雪菊提取物。

雪菊中含有绿原酸、邻苯二酚等具有邻苯二羟基结构，碱性环境下与铝离子形成络合物，可能会对黄酮的测定造成干扰。芦丁是一种结构与功能较清楚的黄酮类化合物槲皮素的糖苷,以芦丁为标准品，采用AlCl₃法测得雪菊总黄酮得率为18.47％

本发明还公开了雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物方面的应用，所述雪菊总黄酮的制备包括以下步骤：

将雪菊花干燥，采用PULVERISETTE14在15000rpm转速条件下后粉碎，沸水浴1小时，离心，取上清，通过直径0.22微米滤膜过滤，收集滤液。然后再向沸水浴锅内添加沸水，重复上述步骤2次，将3次滤液合并后置于旋转蒸发仪浓缩成水浸液，浓缩，干燥，获得雪菊提取物。将该提取物减压浓缩至最小体积后用石油醚脱脂，再用正丁醇萃取，减压回收正丁醇，水层减压浓缩，真空干燥，得到雪菊总黄酮。

同样地以芦丁为对照品,采用AlCl₃法测得雪菊总黄酮得率为17.38％。

雪菊总黄酮给药方式为口服,剂量为20mg/kg。

附图说明

图1是本发明实验中雪菊总黄酮对LX-2细胞的增殖抑制率；

图2A-1是本发明实验中雪菊总黄酮诱导lX-2细胞凋亡的一次流式细胞术检测代表性结果；

图2A-2是本发明实验中雪菊总黄酮诱导lX-2细胞凋亡的三次独立流式细胞术检测实验的统计结果；

图2B是本发明实验中对照组，给予雪菊黄酮5mg/L处理LX-2细胞凋亡蛋白PARP检测；

图3是本发明实验中雪菊总黄酮下调LX-2细胞纤维化蛋白α-SMA和ECM(typeIcollagen)表达；

图4是本发明实验中雪菊总黄酮抑制LX-2细胞NF-κB的DNA结合活性ELISA分析；

图5A-1、5A-2、5A-3分别是促凋亡基因FAS、BCL-X_S和RIP1mRNA表达上调；

图5B-1、5B-2、5B-3分别是抗凋亡A20，BCL-X_L和FLIP基因mRNA表达上调；

图5C-1是雪菊总黄酮逆转TNFα诱发的LX-2细胞BCL-XL表达上调(图5C①)，

图5C-2是雪菊总黄酮逆转TNFα促进LX-2细胞促凋亡FAS基因表达(图5C②)；

图6是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤维化标记物α-SMA检测结果；ECM(typeIcollagen)、NF-κB的DNA结合活性；

图7是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤维化标记物ECM(typeIcollagen)检测结果；NF-κB的DNA结合活性；

图8是本发明实验中雪菊提取物、雪菊总黄酮对大鼠肝纤维化模型肝组织匀浆纤维化标记物NF-κB的DNA结合活性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

本发明试验采用的试剂和原料:

RPMI1640培养基+10％胎牛血清；AnnexinV凋亡检测试剂盒和PI荧光染料(美国BD公司产品)；NF-κB的DNA结合活性检测试剂盒(美国ActiveMotif公司产品)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,购自碧云天生物试剂公司)；RT-PCR引物均由上海生工公司合成；ECM，α-SMA，PARP抗体均为Santa-Cruz公司产品。

实施例1细胞活性试验

取对数生长期细胞(细胞浓度为7×10³/ml)，以每孔100μl接种于96孔板，于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养。细胞贴壁后，换成含雪菊总黄酮终浓度分别为0、2.5、5、7.5、10、15、20、30mg/L的培养基继续培养，每一个浓度设6个复孔，培养24h后，每孔加入MTT20μl(以PBS配成5mg/ml)，继续培养4h后，每孔再加入DMSO150μl，震荡10min。在酶联免疫检测仪上460nm波长测定吸光度值。按公式：细胞生长抑制率＝(空白组-雪菊总黄酮组/D空白组)×100％，计算雪菊总黄酮对LX-2细胞的生长抑制率。

结果显示，雪菊总黄酮能够剂量依赖性抑制LX-2细胞增殖，且其IC50值为10mg/L(如图1所示)。

实施例2细胞凋亡实验

以每孔1×106个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，给予不同浓度的雪菊总黄酮，孵育24h，使用美国BD公司FITC-AnnexinV凋亡检测试剂盒，根据说明书给予LX-2细胞FITC-AnnexinV和PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集细胞，放入适量裂解液，冰上裂解30min，4℃12000g离心15min，使用BCA法测定蛋白浓度。样品于10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，以1:1000比例敷上PARP抗体，4℃过夜，次日洗膜后加入相应二抗，37℃孵育1h，化学发光凝胶成像系统曝光。

结果显示：如图2A-1，为一次流式细胞术检测代表性结果，所示为不同给药浓度条件下LX-2细胞凋亡比率(第Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ象限百分比之和)，图2A-2为经三次独立流式细胞术检测实验的统计结果。雪菊总黄酮5mg/L的凋亡率仅有5％，而10mg/L时凋亡率达到25％。进一步，我们检测了凋亡蛋白PARP(polyADP-ribosepolymerase)，其是一种DNA修复蛋白，切割PARP通常被认为是凋亡指示者。如图2B所示，相较于对照组，给予雪菊黄酮5mg/L处理LX-2细胞时就出现了PARP切割条带，随着剂量增加，切割条带越来越明显。

实施例3雪菊总黄酮下调LX-2细胞纤维化蛋白α-SMA和ECM(typeIcollagen)表达

收集细胞，放入适量裂解液，冰上裂解30min，4℃12000g离心15min，使用BCA法测定蛋白浓度。样品于10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，以1:1000比例敷上一抗，4℃过夜，次日洗膜后加入相应二抗，37℃孵育1h，化学发光凝胶成像系统曝光。以下为一抗使用的抗体：抗α-SMA，抗ECM(typeIcollagen)。

结果显示，雪菊总黄酮剂量依赖性抑制了肝星状细胞LX-2细胞α-SMA和ECM-I型胶原的表达(图3)。

实施例4，NF-κB的DNA结合活性检测

我们将LX-2细胞分为4组，对照组、雪菊总黄酮(10mg/L)单独处理组、TNF-α(20ng/ml)单独处理组及雪菊总黄酮(10mg/L)和TNF-α(20ng/ml)共同作用组，提取核蛋白，进行NF-κBDNA结合活性检测。使用NF-κBp65转录因子试剂盒(ActiveMotif，美国)，根据说明书，检测LX-2细胞NF-κBDNA结合活性。首先，使用NE-PER核质分离试剂提取细胞核成分，BCA法测定蛋白浓度。细胞核提取物置入96孔板，其涂有固定化的低聚核苷酸(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)，内含NF-κB亚基p65结合位点(5’-GGGACTTTCC-3’)。与针对p65活化形式的抗血清孵育，检测结合到靶核苷酸的NF-κB。试剂盒还提供了含有IgG辣根过氧化酶二抗及显影液。最后，使用波长450nm测定OD值。

结果显示,在10mg/L浓度条件下雪菊总黄酮能够显著抑制TNF-α(20ng/ml)诱发的LX-2肝星状细胞NF-κB的DNA结合活性(图4)。

实施例5肝星状细胞NF-κB信号驱动的凋亡相关基因转录变化分析

TRIzol提取LX-2细胞中的总RNA，对于每个RNA样品，使用寡脱氧胸苷酸和MoloneyMurineLeukemia逆转录酶转录成为cDNA，再使用Taq聚合酶(Takara,Japan)进行Real-timePCR。使用的引物见表1(18s作为管家基因)：

引物名称序列

________________________________________

18s5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’

5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’；

FAS5’-ATTCTGCCATAAGCCCTGTC-3’,

5’-TTGGTGTTGCTGGTGAGTGT-3’；

RIP15’-GTCAAATTCAGCCACAGAACAGCC-3’,

5’-CCCTTTAGCCTTCCCTCATCACC-3’；

A205’-GTCCGGAAGCTTGTGGCGCT-3’,

5’-CCAAGTCTGTGTCCTGAACGCCC-3’

BCL-X_L5’-AGTTCCCTTGGCCTCAGAAT-3’,

5’-AGGGTTGCACCAATCAGGTA-3’；

DR45’-CTGAGCAACGCAGACGCGCTGTCCAC-3’,

5’-ACAGCATCAGAGTCTCAGTGGGGTCAGC；

BCL-X_S5’-GCAGTAAAGCAAGCGCTGAG-3’,

5’-GTTCCACAAAAGTATCCTGTTCAAAG-3’；

TRAIL5’-TGGCTAACTGACCTGGAAAGA-3’,

5’-GGTTGTGGCTGCTCTACTCA-3’；

FLIP5’-AATTCAAGGCTCAGAAGCGA-3’,

5’-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3’

结果显示，雪菊总黄酮可以显著改变NF-κB信号相关靶基因表达网络，例如图5A-1、5A-2、5A-3所示,促凋亡基因FAS、BCL-X_S和RIP1mRNA表达上调；图5B-1、5B-2、5B-3所示,抗凋亡A20，BCL-X_L和FLIP基因mRNA表达上调；进一步的，我们检测了雪菊总黄酮对NF-κB激活抑制能力，如图5C-1所示，雪菊总黄酮可以逆转TNFα诱发的LX-2细胞BCL-XL表达上调(图5C-1)，促进LX-2细胞促凋亡FAS基因表达(图5C-2)。

实施例6动物实验

实验分组及造模：雌性SD大鼠体重300～350g，50只，购自中国医学科学院放射医学研究所动物中心。将大鼠按照体重随机分成5组，每组10只，分别为空白组、模型组、雪菊提取物组(简称实验1组)、雪菊总黄酮提取物实验组(简称实验2组)，水飞蓟素(利加隆，Legalon，德国马博士大药厂)对照组(阳性药)。除空白组外，其他组均给予40％四氯化碳橄榄油溶液2ml/kg腹腔内注射，每周2次，持续8周。实验组和阳性药物组与4次造模后经灌胃给药，实验1组和2组剂量均为雪菊总黄酮20mg/kg(以制备所得的干粉计)，阳性药物对照组剂量为水飞蓟素50mg/kg灌胃给药。给药频率均为1次/天，空白组和模型组给予等容积DMSO，灌胃容积为10ml/kg,连续给药4周。

动物处理及指标检测：最后一次给药后，腹腔注射5％异戊巴比妥麻醉大鼠，从腹主动脉采血，离心分离出血清，留取部分血清用于肝功能和纤维化指标测定；采血后肝脏称重；取肝组织左叶下段组织，用4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下作病理学检查。肝组织学评估肝纤维化的程度分级方法如下:0级，无纤维化；1级，汇管区纤维放大；2级，汇管区或门静脉区有纤维化，但还有肝小叶完整的架构；3级，纤维化与桥状的连结；4级，可能或明确的肝硬化。在各组大鼠的组织中，选取3个不同的视野，进行判定。取剩余肝组织少许，称重，冰生理盐水冲洗，按所取肝组织克数加入9倍毫升数的生理盐水，上高速匀浆机于冰浴中匀浆2分钟，所得匀浆悬液用于检测α-SMA、ECM(typeIcollagen)、NF-κB的DNA结合活性。

结果显示：动物大体情况大鼠经造模后初期较平稳，于4周后出现毛发稀疏无光泽，纳差少动，蜷曲状，这些症状以造模组为甚，实验组及阳性药物对照组均较模型组有所减轻，且无明显腹水发生。各组动物体重、肝重、肝脏指数(肝重/体重比值)、ALT、AST、纤维化积分数值见表2。

注:#与空白组比较p＜0.01，##与空白组比较p＜0.001,*与模型组比较p＜0.05，**与模型组比较p＜0.01

从表2中可知，各项指标综合评价，模型组较空白组及治疗组肝损伤及纤维化程度严重，与模型组比较，治疗组均体现疗效。且雪菊总黄酮组效果优于雪菊提取物组，与阳性药物水飞蓟素组比较治疗效果接近。表明雪菊提取物及雪菊总黄酮对改善大鼠肝纤维化方面有一定的治疗效果。

在对肝细胞悬液进行纤维化标记物α-SMA、ECM(typeIcollagen)检测，以及NF-κB的DNA结合活性ELISA检测结果表明，如图6-图8所示，各实验组均可以抑制这些纤维化标记物的表达，且其抑制程度与肝功能检测结果有一致性，具体抑制程度表现为雪菊总黄酮组＞雪菊提取物组＞模型组。进一步证实雪菊提取物及雪菊总黄酮可以通过抑制NF-κB信号通路下调肝星状细胞活化程度，降低肝纤维化关键标记物表达，从而体现抗肝纤维化，保护肝细胞，改善肝功能的治疗效果。

虽然上述内容已经用一般性说明、具体实施方式及试验对本发明进行了细致的描述，但在本发明的基础上，仍存在对之进行修改或者改进的空间，这对本专业领域的技术人员来说是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或者改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用。

2.根据权利要求1所述的雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，其特征在于，所述雪菊提取物按照以下步骤制备：将雪菊花干燥,粉碎后，沸水浴1小时，离心，取上清，通过直径0.22微米滤膜过滤，收集滤液；然后再向沸水浴锅内添加沸水，重复上述步骤2次，将3次滤液合并后置于旋转蒸发仪浓缩成水浸液，再经浓缩、干燥后得到雪菊提取物。

3.根据权利要求1雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，其特征在于所述的雪菊提取物作为NF-kappaB信号通路抑制剂。

4.根据权利要求1雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，其特征在于，所述的雪菊提取物抑制人肝星状细胞LX-2的增殖或促进人肝星状细胞LX-2的凋亡。

5.根据权利要求1雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，其特征在于，所述的雪菊提取物降低LX-2细胞中NF-kappaB的DNA结合能力。

6.根据权利要求1雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，所述的雪菊提取物降低血清AST和ALT含量。

7.根据权利要求1雪菊提取物在制备治疗肝纤维化药物的应用，所述的雪菊提取物降低肝组织胶原蛋白含量，减少α-SMA和ECM表达。

8.一种雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用。

9.根据权利要求8所述的雪菊总黄酮在制备治疗肝纤维化药物的应用，其特征在于，雪菊总黄酮按照下列步骤制备：按权利要求3所述的制备方法获得雪菊提取物，将该提取物减压浓缩至最小体积后用石油醚脱脂，再用正丁醇萃取，然后减压回收正丁醇，最后水层减压浓缩，真空干燥，得到雪菊总黄酮。