CN107961288A

CN107961288A - 鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用

Info

Publication number: CN107961288A
Application number: CN201711340614.4A
Authority: CN
Inventors: 刘健康; 柳絮云; 刘建书
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-04-27

Abstract

本发明公开了鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用。鱼腥草提取物可明显抑制饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮细胞炎症反应及增加血管内皮细胞线粒体和复合物生成，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。

Description

鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药学技术领域，涉及鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用。

背景技术

据2011年世界卫生组织发布的关于心血管疾病的预防与控制的全球数据显示，心血管疾病导致的死亡占全球死亡人数的31％，仅次于其它非传染性疾病的总数。且预计2008年到2030年心血管疾病导致的死亡率明显高于其它疾病，处于领先地位。心血管疾病主要包括心脑血管疾病，如心肌梗死和脑梗死等。而动脉粥样硬化是心血管疾病的病理基础。

动脉粥样硬化的发病机制非常复杂，发生于血管壁中，是一种慢性炎症反应、形成斑块、且伴随有血管内皮细胞损伤。导致动脉粥样硬化的因素主要有高盐、高脂、高能量、吸烟等不健康饮食以及代谢型危险因素，包括三高及肥胖等疾病。

目前动脉粥样硬化有药物和手术等治疗方式，但该类型疾病隐匿性高、致死和致残率都较高，因此提早预防显得尤为重要，有研究报道，天然活性成分如绿原酸、芎芍及木酚素等具有抗动脉粥样硬化的功能，且以此为原料的功能性食品相继问世。挖掘更多效能更好的抗动脉粥样硬化等心血管疾病的天然物质具有重要的意义和前景。

中药鱼腥草，原植物为三白草科(Saururaceae)蕺菜属(Houttuynia)多年生草本植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb.)的全草，我国主要分布于西南、华南、中南及华东等地，四川为其主产区之一。据《中药辞海》，鱼腥草主要含有挥发油、黄酮、生物碱、有机酸、木质素、多糖等活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛、调节免疫、抗氧化、抗过敏、抗辐射、抗肿瘤、平喘等功效。主要药用成分为挥发油、黄酮类和生物碱类成分。

现代研究证明鱼腥草具有较好的抗炎活性，临床上用于治疗呼吸道感染，如结膜炎、角膜炎、急慢性鼻炎、鼻窦炎等炎症性疾病。作为传统的清热解毒中药，鱼腥草因其显著的抗炎、解热作用。

发明内容

本发明解决的问题在于提供鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用，鱼腥草水提取物可明显抑制饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮细胞炎症反应及增加血管内皮细胞线粒体和复合物生成，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。

本发明是通过以下技术方案来实现：

鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用。

所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用的药物。

所述的药物是降低主动脉内皮细胞内的IL-6和基质金属蛋白酶-1MMP-1的mRNA水平含量。

所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用的药物。

所述的药物是增加线粒体生成相关蛋白PGC1α、线粒体复合物I、线粒体复合物II及线粒膜融合相关蛋白Mfn2的表达的药物。

鱼腥草水提取物在制备防治心血管疾病的药物中的应用。

所述的药物是治疗动脉粥样硬化的药物。

鱼腥草水提取物在制备预防动脉粥样硬化发生的药物或保健品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

鱼腥草水提取物对人主动脉内皮细胞无毒副作用，本发明首次公开指出鱼腥草提取物在血管内皮损伤和炎症反应的动脉粥样硬化等血管疾病发生的过程中，鱼腥草提取物可明显抑制饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮细胞炎症反应及增加血管内皮细胞线粒体和复合物生成，通过抗炎和保护线粒体功能来预防动脉粥样硬化的发生和发展。

鱼腥草提取物能够有效降低饱和脂肪酸造成的人主动脉内皮炎性反应，如白介素-6(IL-6)和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的mRNA水平含量；鱼腥草提取物能够有效保护饱和脂肪酸对人主动脉内皮线粒体功能的损伤，如可增加线粒体生成相关蛋白PGC1α、线粒体复合物I和II及线粒膜融合相关蛋白Mfn2的表达等；其对于预防血管疾病发生和进展中具有很好的应用前景。

附图说明

图1是鱼腥草提取物对人主动脉内皮细胞无毒副作用。其中：横坐标为鱼腥草提取物的作用浓度，纵坐标为细胞活性。

图2是鱼腥草提取物对棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞炎症反应的抑制作用。其中：横坐标为鱼腥草提取物的作用浓度，纵坐标为IL-6和MMP-1的mRNA水平含量。

图3A～图3B是鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体复合物I和II表达的降低。其中：图3A为Western blot结果图；图3B为Western blot统计图，横坐标为蛋白名称，纵坐标为相对蛋白表达水平含量。

图4A～图4B是鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体膜融合相关蛋白Mfn2表达的降低。其中：图4A为Western blot结果图；图4B为Western blot统计图，横坐标为蛋白名称，纵坐标为相对蛋白表达水平含量。

图5A～图5B是鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体生成相关蛋白PGC1α表达的降低。其中：图5A为Western blot结果图；图5B为Western blot统计图，横坐标为蛋白名称，纵坐标为相对蛋白表达水平含量。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1.实验材料

鱼腥草提取物(Herba Houttuyniae Extract,HHE)为水提法提取的鱼腥草提取物，具体从西安博联特化工有限公司购买，批次号为BLT20170412，提取方法为：用60℃到90℃水浴法浸提2-5小时而得到，萃取比为20:1，干燥失重为0.75％；TRIzol试剂从Invitrogen公司购买；RNA逆转录试剂盒，SYBR荧光染料从大连宝生物公司购买。RNA引物序列从西安擎科泽西生物有限公司订购合成。

2.实验细胞培养及模型建立

人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cells,HAEC)从上海拜力生物科技有限公司购买，棕榈酸购买于sigma公司。细胞培养于含有95％空气和5％CO₂的37℃恒温、湿润、无菌培养箱中。实验分为三组，分别为：(1)control组；(2)500μM棕榈酸处理组；(3)鱼腥草提取物保护组。

3.实验方法

(1)MTT检测

用不同浓度的鱼腥草提取物作用于HAEC，细胞培养箱培养24h，后用500μM的棕榈酸作用24h后，用PBS清洗细胞一遍，加入0.5mg/ml的MTT，在含有95％空气和CO₂的37℃培养箱中孵育4h后，用PBS清洗三遍，再加入DMSO溶解，并在490nm的波长下检测其吸光值。

(2)白介素-6和基质金属蛋白酶-1的mRNA含量检测

采用逆转录RNA-实时荧光定量PCR的方法进行检测。具体方法如下：

1)RNA提取

12孔细胞培养板，每孔加入500μL的TRIzol试剂，室温，摇床5min，加入200μl氯仿(1/5总体积)抽提蛋白，剧烈混匀15s，室温放置15min后，12,000g,4℃,离心10分钟。将上层水相转移至另一EP管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置1h后，12,000g,4℃,离心10min，弃上清。加入1mL预冷的75％乙醇，颠倒混匀，12,000g,4℃，离心10min。弃上清，超净工作台放置30min，使乙醇挥发完全挥发掉，溶于10μl DEPC水中。用紫外分光光度计检测测定其浓度，用于反转录。

2)RNA反转录

转录体积为20μl，取出2μg RNA，加入随机引物0.5μg。加入4μl的5X Master Mix，用DEPC水补充至20μl体积，37℃孵育60min，80℃作用15s。置于-20℃备用。

3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

用SYBR Green法进行，反应体系包括1μl cDNA，Premix ExTaq^TMII，0.5μl上下游引物混合液(10μM)，加灭菌水至10μl。反应条件依照说明书，95℃解链10min，进行40个循环PCR(每个循环包括95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 20s)，最后观测融解曲线(95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s)。β-actin作为内参，实验所用的引物序列为：

IL-6:

forward：5’-TTTTGTACTCATCTGCACAGC-3’

reverse：5’-GGATTCAATGAGGAGACTTGC-3’

MMP-1:

forward：5’-ACGCCAGATTTGCCAAGAG-3’

reverse：5’-TTGACCCTCAGAGACCTTGGT-3’

β-actin:

forward:5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3'

reverse:5'-AGATGGGCACAGTGTGGGT-3’

(3)蛋白检测

1)蛋白提取

6孔细胞培养板，每孔加入150μL的IP裂解液，用细胞刮刮取细胞，振荡15s，冰浴10min，如此反复三次，保证冰浴时间至少在30min以上，4℃，12000rcf离心10min，取上清，用BCA方法进行蛋白定量，调平，加入5X loading buffer和巯基乙醇，煮沸10min，使蛋白变性，-80℃保存，待用。

2)Western blot

利用10％的丙烯酰胺凝胶进行跑胶，蛋白上样量为10μg，利用PVDF膜转印，后封闭，孵育一抗，4℃过夜，清洗一抗，孵育二抗，室温1h，清洗二抗，进行化学发光。

4.统计分析

结果以Mean±S.E.M形式表示，数据分析使用One Way-ANOVA分析方法，显著统计学意义为*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

4、鱼腥草提取物对人主动脉内皮细胞无毒副作用

MTT检测鱼腥草提取物作用于人内皮细胞(HAEC)24h，图1显示鱼腥草提取物对人血管内皮细胞有促增殖的作用，且当鱼腥草提取物浓度高达5μg/μl时仍无毒副作用。

5、鱼腥草提取物对棕榈酸诱导人血主动脉内皮细胞炎症反应的抑制作用

鱼腥草提取物先作用于人内皮细胞24h后再加500μM棕榈酸作用24h，图2显示鱼腥草提取物对可以显著抑制棕榈酸损伤人血管内皮细胞产生的炎症反应，500μM的棕榈酸使人主动脉内皮细胞产生炎症反应，如细胞炎症因子白介素IL-6和人基质金属蛋白酶MMP-1均较无棕榈酸处理组有明显升高，在mRNA水平上，IL-6升高了约20倍，MMP-1升高了约15倍，模型组炎症水平增高明显，当鱼腥草提取物的作用浓度为1μg/μl时即产生了明显的抑制炎症反应的效果，当浓度达到5μg/μl抑制效果更为明显，提示鱼腥草提取物的抗炎作用及抗动脉粥样硬化效果。

6、鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体复合物I和II表达的降低

线粒体呼吸链酶称线粒体呼吸链复合物、线粒体呼吸链复合酶，线粒体呼吸链位于线粒体内膜由5个复合物组别：NADH(称复合物I)、琥珀酸氧化原酶(称复合物II)、细胞色素C氧化原酶(复合物III)、细胞色素C氧化酶(称复合物IV)ATP合酶(称复合物V)线粒体复合物，线粒体复合物与电子传递和能量产生紧密相关，复合物表达量的下降说明细胞线粒体功能下降。图3A～图3B显示棕榈酸可降低人主动脉内皮细胞线粒体复合物I,II,III蛋白的表达，而鱼腥草提取物可明显增加线粒体复合物I和II的表达，从而增加线粒体功能。

7、鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体膜融合相关蛋白Mfn2表达的降低

线粒体融合与分裂不仅可以改变线粒体的形态、影响线粒体的功能，而且还影响细胞的生存，线粒体的分裂和融合是由多种蛋白质精确调控完成的。参与线粒体融合的蛋白质主要包括Mfn1,Mfn2及OPA1。图4A～图4B显示棕榈酸可降低人主动脉内皮细胞线粒体膜融合相关蛋白Mfn1,Mfn2及Long-OPA1蛋白的表达，而鱼腥草提取物可明显增加Mfn2的表达量，促进细胞的融合，维持线粒体动态平衡。

8、鱼腥草提取物可上调棕榈酸诱导人主动脉内皮细胞线粒体生成相关蛋白PGC1α表达的降低

线粒体数目对线粒体功能产生一定的影响，通常情况下，线粒体数目减少会降低线粒体功能，PGC-1α分子作为转录因子可调控线粒体的生成，主要是通过与核呼吸因子1和因子2(NRF1和NRF2)共同转录线粒体组成蛋白及mtTFA，线粒体转录因子A又控制着线粒体DNA的复制和转录，从而将核DNA的转录与线粒体DNA的转录结合起来。图5A～图5B显示，棕榈酸可降低人主动脉内皮细胞线粒体生成相关蛋白PGC1α的表达，而鱼腥草提取物可增加PGC1α的表达，提示鱼腥草提取物可促进人主动脉内皮细胞的生成，提高线粒体功能。

通过以上实验结果证明鱼腥草提取物能够有效抑制高脂诱导的人主动脉内皮细胞的炎症反应和线粒体损伤，从而改善人主动脉内皮细胞功能。可进行以下应用：

进一步的，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用的药物。

进一步的，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用的药物。

由于内皮细胞功能受损是动脉粥样硬化的初期表征及发生、发展的基础和原因，动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应，炎症反应的发生是该病发生的重要原因之一，且线粒体损伤会造成内皮细胞能量不足和功能下降，被报道将可能也是动脉粥样硬化发生的重要原因之一，鱼腥草提取物在以上内皮细胞损伤实验中表现出很好的保护内皮细胞炎症、线粒体损伤的特性。由此，鱼腥草提取物在预防高脂引起内皮损伤的动脉粥样硬化等心血管疾病有很好的应用前景，为防治膳食结构失衡所致内皮损伤导致的动脉粥样硬化等心血管疾病系列问题开辟新的医药途径。

可进行以下应用：

鱼腥草水提取物在制备防治心血管疾病的药物中的应用。

所述的药物是治疗动脉粥样硬化的药物。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.鱼腥草水提取物在制备改善主动脉内皮细胞功能的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应有抑制作用的药物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物是降低主动脉内皮细胞内的IL-6和基质金属蛋白酶-1的mRNA水平含量。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物是对饱和脂肪酸造成的主动脉内皮细胞炎症反应所损伤的线粒体有保护作用的药物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物是增加线粒体生成相关蛋白PGC1α、线粒体复合物I、线粒体复合物II及线粒膜融合相关蛋白Mfn2的表达的药物。

6.鱼腥草水提取物在制备防治心血管疾病的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述的药物是治疗动脉粥样硬化的药物。

8.鱼腥草水提取物在制备预防动脉粥样硬化发生的药物或保健品中的应用。