CN105624231A - 优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法 - Google Patents

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卢红梅
姜晓琳
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Abstract

本发明公开了一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，是通过采用Plackett-Burman试验设计方法，对发酵细菌纤维素的西瓜汁发酵培养基中主要组分进行筛选，将效应显著因子FeSO4和无水乙醇作为关键因素进一步优化，获得优化的西瓜汁发酵培养基配方配比。用优化了的西瓜汁发酵培养基发酵细菌纤维素的产率为6.39g/L，是西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率0.94g/L的6.8倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率4.80g/L提高33.13%，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素，用优化的西瓜汁培养基制备细菌纤维素在持水性、结晶度、热稳定性等性质方面优于用基础培养基制备的细菌纤维素。

Description

优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法
技术领域
本发明涉及细菌纤维素生产领域，具体地说，是一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法。
背景技术
椰子水是最早用于生产细菌纤维素的原料，也是目前普遍使用的原料。近年来,细菌纤维素凭借其优良的特性被广泛运用于医疗、纺织、环保、造纸等诸多领域，导致细菌纤维素需要量巨大，使得有限的椰子水资源早已供不应求，且以椰子水为主要原料具有地域性限制，无法满足市场扩增的需要。寻找替代椰子水的细菌纤维素原料成为研究的一大热点。本发明人所在课题组前期研究表明，西瓜汁可用于培养细菌纤维素，但用纯西瓜汁（西瓜汁培养基基料）发酵细菌纤维素时，产量仅为0.94g/L,产量远低于基础培养基的4.80g/L。本发明针对西瓜汁培养细菌纤维素干膜产率低的问题，以常用的木醋杆菌为试验菌株，优化西瓜汁培养基基料发酵培养基，将所培养的细菌纤维素与基础培养基发酵的细菌纤维素在产量和产品特性方面进行比较，以期找到一种提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对目前椰子水生产细菌纤维素存在生产周期长、产量低、劳动强度大、生产成本高、受原料季节性和地域性限制的问题，研究用其他原料代替椰子水，生产出产量高、质量好的细菌纤维素。具体地说是利用西瓜汁代替椰子水，通过优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率和质量的方法。
本发明一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，是通过采用Plackett-Burman试验设计方法，对发酵细菌纤维素的西瓜汁发酵培养基中主要组分进行筛选，将效应显著因子作为关键因素进一步优化，获得优化的西瓜汁发酵培养基配方配比，其配方配比为：酵母膏12.5g，蛋白胨10.0g，磷酸二氢钾6.5g，硫酸镁3.1g，硫酸亚铁0.2g，柠檬酸0.3g，用西瓜汁培养基基料配制成1000ml，灭菌冷却后无菌地加入无水乙醇36ml，用优化了的西瓜汁发酵培养基发酵细菌纤维素的产率为6.39g/L，是西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率0.94g/L的6.8倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率4.80g/L提高33.13%，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素。
所述的Plackett-Burman试验设计方法是以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，以细菌纤维素干膜产率g/L为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，得到其中显著影响的2个因素为FeSO4和无水乙醇。
将效应显著因子作为关键因素进一步优化，是对显著影响细菌纤维素干膜产率的FeSO4和无水乙醇进行优化，通过考察0.1-0.3g/LFeSO4和2.8%-4.4%v/v无水乙醇添加量对细菌纤维素干膜产率的影响，发现细菌纤维素干膜产率随FeSO4添加量的增加，细菌纤维素的产量呈先上升后下降的趋势，随着无水乙醇添加量的增加，产量也呈现先上升后下降的趋势。细菌纤维素干膜产率最高点出现在FeSO4添加量为0.3g/L、无水乙醇添加量为3.6%v/v，即36ml/L。
上述所指西瓜汁培养基基料的制备方法为：将西瓜榨汁，用8层纱布过滤，西瓜汁经DNS法测总糖含量为70.65g/L，取西瓜汁708ml，用蒸馏水稀释至1000ml，则所得西瓜汁溶液总糖含量为50g/L，即得西瓜汁培养基基料。
上述所指基础培养基配方为：蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v。利用基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率为4.80g/L。
上述所指细菌纤维素主要质量指标为持水性、结晶度、热稳定性。
用优化的西瓜汁培养基制备细菌纤维素的方法为：
（1）配制优化的西瓜汁发酵培养基（简称发酵培养基）1000ml；
（2）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（3）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（4）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（5）将步骤（4）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（6）将步骤（5）在80℃下干燥至恒重即得成品。
有益效果
本发明提供了以西瓜汁为基础原料经过优化，以优化的西瓜汁发酵培养基发酵细菌纤维素的方法，能够达到提高细菌纤维素干膜产率和质量的目的，解决了细菌纤维素生产中地域性限制的难题，增加了细菌纤维素的产量，降低了生产成本，提高了经济效益。
附图说明
图1FeSO4和无水乙醇对细菌纤维素干膜产率的影响
图2基础培养基细菌纤维素的TG-DTA图谱
图3西瓜汁培养基细菌纤维素的TG-DTA图谱。
具体实施方式
实施例1西瓜汁培养基基料的制备：
将西瓜榨汁，用8层纱布过滤，西瓜汁经DNS法测总糖含量为70.65g/L，取西瓜汁708ml，用蒸馏水稀释至1000ml，则所得西瓜汁溶液总糖含量为50g/L，即得西瓜汁培养基基料。
实施例2基础培养基的制备：
取蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v。
实施例3西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素：
（1）制备西瓜汁发酵培养基基料1000ml；
（2）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（3）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（4）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（5）将步骤（4）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（6）将步骤（5）在80℃下干燥至恒重即得成品。
利用西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率为0.94g/L，远远小于基础培养基4.80g/L的产量。由于西瓜汁培养基基料的总糖含量与基础培养基的相同，都为50g/L，说明导致西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率不高的原因是除糖类外其他营养成分。
实施例4Plackett-Burman试验设计：
在单因素试验的基础上，以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，因素水平见表1。以细菌纤维素干膜产率R（g/L干膜重）为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，Plackett-Burman试验设计及响应值见表2。利用DesignExpert7.0对Plackett-Burman试验数据进行分析，经整理后如表3。
经软件分析主效应中，FeSO4(P=0.0319)和无水乙醇(P=0.0004)的效应显著，P值均小于0.10，可以作为进一步优化的关键因素。其他因素对结果影响不大（P>0.10）,在进一步研究中作为条件因素考虑。
注：*表示0.10水平上的差异
实施例5关键因素FeSO4、无水乙醇添加量的确定：
由Plackett-Burman实验可知，FeSO4、无水乙醇为最显著的因素，其他因素对结果影响不大，确定其他因素的添加量为高水平和低水平添加量的平均值，即酵母膏为12.5g/L、蛋白胨为10.0g/L、KH2PO4为6.5g/L、MgSO4为3.1g/L、柠檬酸为0.3g/L，考察0.1-0.3g/LFeSO4和2.8%-4.4%v/v无水乙醇添加量对细菌纤维素干膜产率的影响，实验结果见图1。由图1可知，随着FeSO4添加量的增加，细菌纤维素的产量呈先上升后下降的趋势，随着无水乙醇添加量的增加，产量也呈现先上升后下降的趋势。细菌纤维素干膜产率最高点出现在FeSO4添加量为0.3g/L、无水乙醇添加量为3.6%v/v（36ml/L）时，最大产量为6.39g/L，是未优化前的（0.94g/L）的6.80倍。
实施例6用优化西瓜汁培养基生产细菌纤维素的方法：
（1）配制优化的西瓜汁发酵培养基（简称发酵培养基）1000ml；
（2）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（3）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（4）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（5）将步骤（4）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（6）将步骤（5）在80℃下干燥至恒重即得成品。
实施例7优化西瓜汁发酵培养基生产细菌纤维素性能检测：
（1）细菌纤维素持水性和复水性分析
细菌纤维素持水性和复水性分析结果见表4。由表4可知，与基础培养基相比，西瓜汁培养基培养的细菌纤维素在持水性和复水性方面略高于基础培养基培养的细菌纤维素。
（2）细菌纤维素结晶度分析
根据X-射线衍射实验数据，分别根据公式计算各培养基细菌纤维素的结晶度，结果见表5。与基础培养基相比，西瓜汁培养基发酵的细菌纤维素结晶度81.31%，比基础培养基的76.27%提高了6.61%。
（3）细菌纤维素热稳定性分析
图2、图3为基础培养基和西瓜汁培养基发酵的细菌纤维素的TG-DTA图谱，由图2、图3的细菌纤维素TG曲线可知，所测样品的质量随温度变化可以分为三个阶段：0～170℃内的质量轻度损耗，170～550℃内的质量快速损耗阶段，550～800℃之间的质量轻微损耗阶段。在0～170℃阶段西瓜汁培养基、基础培养基所得的细菌纤维素的最大失重速率温度分别为57.8℃和46.9℃，表明该阶段的质量损失主要是细菌纤维素脱水产生的，故称失水阶段，由于所测样品没有达到恒重干燥的程度或者是因为吸收了空气中的水分，所以造成了最大失重速率处的温度不同；170～550℃阶段，最大失重速率处温度分别为353.6℃、333.5℃，此阶段质量降低速度快，持续时间长，为细菌纤维素的降解阶段,对于材料热稳定性采用最大失重速率法来衡量，最大失重速率处温度越高，细菌纤维素的热稳定性越好，说明热稳定性方面西瓜汁培养基优于基础培养基。

Claims (7)

1.一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是通过采用Plackett-Burman试验设计方法，对发酵细菌纤维素的西瓜汁发酵培养基中主要组分进行筛选，将效应显著因子作为关键因素进一步优化，获得优化的西瓜汁发酵培养基配方配比，其配方配比为：酵母膏12.5g，蛋白胨10.0g，磷酸二氢钾6.5g，硫酸镁3.1g，硫酸亚铁0.2g，柠檬酸0.3g，用西瓜汁培养基基料配制成1000ml，灭菌冷却后无菌地加入无水乙醇36ml，用优化了的西瓜汁发酵培养基发酵细菌纤维素的产率为6.39g/L，是西瓜汁培养基基料发酵细菌纤维素干膜产率0.94g/L的6.8倍，比基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率4.80g/L提高33.13%，主要质量指标优于基础培养基培养的细菌纤维素。
2.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所述的Plackett-Burman试验设计方法是以蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、柠檬酸、无水乙醇7种成分作为Plackett-Burman试验的7个因素，每个因素取高、低2个水平，以细菌纤维素干膜产率g/L为响应值，按照Plackett-Burman试验设计进行12组试验，得到其中显著影响的2个因素为FeSO4和无水乙醇。
3.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所述的将效应显著因子作为关键因素进一步优化，是对显著影响细菌纤维素干膜产率的FeSO4和无水乙醇进行优化，通过考察0.1-0.3g/LFeSO4和2.8%-4.4%v/v无水乙醇添加量对细菌纤维素干膜产率的影响，发现细菌纤维素干膜产率随FeSO4添加量的增加，细菌纤维素的产量呈先上升后下降的趋势，随着无水乙醇添加量的增加，产量也呈现先上升后下降的趋势；
细菌纤维素干膜产率最高点出现在FeSO4添加量为0.3g/L、无水乙醇添加量为3.6%v/v，即36ml/L。
4.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指西瓜汁培养基基料的制备方法为：将西瓜榨汁，用8层纱布过滤，西瓜汁经DNS法测总糖含量为70.65g/L，取西瓜汁708ml，用蒸馏水稀释至1000ml，则所得西瓜汁溶液总糖含量为50g/L，即得西瓜汁培养基基料。
5.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指基础培养基配方为：蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8.0g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，用蒸馏水配成1000mL，灭菌冷却后加入无水乙醇3%v/v；
利用基础培养基发酵细菌纤维素干膜产率为4.80g/L。
6.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是所指细菌纤维素主要质量指标为持水性、结晶度、热稳定性。
7.根据权利要求书1所述的一种优化西瓜汁发酵培养基提高细菌纤维素干膜产率、质量的方法，其特征是用优化的西瓜汁培养基制备细菌纤维素的方法为：
（1）配制优化的西瓜汁发酵培养基（简称发酵培养基）1000ml；
（2）加入80ml经培养24小时的木醋杆菌种子液；
（3）于30℃恒温培养箱静置培养8天；
（4）收集细菌纤维素膜，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L的NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却至室温；
（5）将步骤（4）的细菌纤维素膜用0.1mol/LHCl中和30min，蒸馏水充分洗涤；
（6）将步骤（5）在80℃下干燥至恒重即得成品。
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