CN105624122A - 鸡传染性支气管炎病毒自然突变株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒学领域，旨在提供一种鸡传染性支气管炎病毒自然突变株。该病毒自然突变株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为传染性支气管炎病毒，保藏号为CGMCC？NO.11491。其基因组长为27,541bp，其全基因组序列如SEQ？ID？NO:1所示，具有典型的IBV基因组编码结构特征。本发明提供的有特殊基因插入的突变株，能够突破疫苗的免疫保护，而在机体繁殖下来，这个突变株可以在易感鸡群中增殖，但不致敏感鸡产生明显致病性，因此该毒株可以作为进一步研究弱毒疫苗或IBV毒株变异机制的基础材料。

Description

鸡传染性支气管炎病毒自然突变株

技术领域

本发明属于病毒学领域，涉及到一种传染性支气管炎病毒的自然突变株。

背景技术

鸡的传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(InfectiousbronchitisVirus,IBV)引起的鸡急性、高度接触性传染病。以呼吸困难、肾炎和蛋品质下降为主要特征，该病在全世界广泛流行。鸡传染性支气管炎在鸡群中具有高度传染性，是在没有高致病性禽流感和速发型新城疫的鸡场重要的呼吸道疾病，对家禽的养殖业危害很大。

IBV隶属于套式病毒目(Nidovirilaes)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)γ冠状病毒亚属，是该亚群的代表病毒，也是最早分离获得的冠状病毒。IBV为单股正链RNA病毒，基因组长约为27.4kb。在基因组RNA转录过程中形成6种mRNA，即mRNA1～6，它们具有3’末端结构和5’末端长短不一的游离mRNA。其中基因1又称多聚酶基因(PloymeraseGene)，编码两个大的融合蛋白，即多聚蛋白1a和1b，多聚蛋白被蛋白酶水解形成15个非结构蛋白(nonstructuralprotein，nsp)，参与病毒的复制和转录。基因2编码纤突蛋白(Spike,S)，基因4编码膜蛋白(Membrane,M)，基因6编码核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)。另还有基因3编码3a、3b和小膜蛋白(Envelope,E)，基因5编码5a和5b蛋白。S、M、N和E是结构蛋白，参与病毒粒子的组成；3a、3b、5a和5b分子量小，功能未知。M蛋白是IBV粒子中含量最高的糖蛋白，是一种跨膜蛋白，其大部分埋在膜中，N端小部分位于膜外，可能形成抗原决定簇，C端膜内表面部分与N蛋白和核酸相互作用。在病毒出芽过程中，M蛋白介导病毒粒子从粗面内质网和高尔基体出芽而将其结合到囊膜上。一般情况下，M蛋白在病毒粒子中高度保守，不同毒株的M蛋白同源性在90％以上。

目前，鸡传染性支气管炎病毒在世界范围内广泛流行。由于IBVRNA特有的转录机制，加上RNA酶缺乏校正系统导致IBV很容易发生变异，出现了多种组织嗜性、血清型和基因型。由于IBV变异株的出现，使得现有疫苗不能很好保护鸡群抵抗野毒的攻击，养鸡场IB的暴发时有发生，给IB的防控带来了很大的困难。

本发明从免疫过IBV常用疫苗的鸡群中分离鉴定到一株自然变异的IBV病毒株。完成了该毒株致病性鉴定及全基因组测序分析。该毒株的分离获得及其特性鉴定为深入开展IBV疫苗免疫压力下的变异机制及致病机理研究提供了材料和基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡传染性支气管炎病毒自然突变株。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种鸡传染性支气管炎病毒自然突变株，其特征在于，该病毒自然突变株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为传染性支气管炎病毒，保藏号为CGMCCNO.11491。

本发明中，该病毒自然突变株的基因组长为27,541bp，其全基因组序列如SEQIDNO:1所示，具有典型的IBV基因组编码结构特征，具体为5’-UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。

本发明中，该病毒自然突变株的IBV基因组编码结构中，各片段的序列分别如SEQIDNO:2～13所示。其中，各片段编码的氨基酸大小分别为：1a基因3951(aa)；1b基因2652(aa)；S基因1153(aa)；3a基因57(aa)；3b基因72(aa)；E基因119(aa)；M236基因(aa)；5a基因65(aa)；5b基因82(aa)；N基因409(aa)。

本发明中，该病毒自然突变株与GenBank中登录的其它IBV毒株M基因相比，在M基因N端有10个氨基酸正向重复序列插入，其M基因的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示。

本发明提供了一株IBV自然变异株及其全基因组序列，并分析了该毒株的致病性和基因特征，为深入开展IBV疫苗免疫压力下的变异机制及致病机理研究提供材料和研究基础。

本发明采用鸡胚接种的方法分离病毒。样品来自浙江金华地区免疫过IBV常用疫苗的鸡肾组织样品。样品处理后接种9-10日龄SPF鸡胚分离病毒。分离物在鸡胚中盲传三代后，感染鸡胚出现出血、卷曲、侏儒胚等IBV感染鸡胚的典型病变。分离物接种1日龄SPF雏鸡，感染鸡仅出现轻微的呼吸症状，剖检观察肾无明显肿大。经RT-PCR检测感染鸡排毒情况，雏鸡感染后第二天即从咽和肛拭子检测到病毒核酸，持续到感染后的7-9天。用免疫组织化学染色法检测到感染鸡肾组织中有病毒存在。14日龄SPF鸡接种JH06111后，第9天可以检测到IBV阳性抗体，一直到接毒后的27天，接种鸡还保持较高的抗体水平，这个时候以强毒攻击，接种过JH06111的没有出现死亡、没有明显临床和病理剖检变化，而对照鸡则出现10％死亡，剖检出现肾肿大等病变。

本发明对分离株JH06111进行全基因组测序。JH06111基因组全长为27,541bp，基因序列如SEQIDNO.1，具有典型的IBV病毒基因编码特征，即5’-UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。

基于全基因组序列对IBVJH06111毒株进行遗传进化分析，本发明构建了JH06111毒株与常用参考株遗传进化树。JH06111与肾型常用参考毒株SAIBK、SC021202和BJ等毒株位于同一大的分支，进而独立形成一个亚分支，而与疫苗株H120、M41等的遗传距离均较远。

序列的同源性比较分析发现，JH06111毒株全基因组与参考毒株全基因组核苷酸同源性在85.5％～89.9％之间。点突变、插入和缺失出现在整个基因组中，尤以S1、基因3以及通常最为保守的M基因变异最大。5a、5b、nsp9、nsp10基因相对保守。

S蛋白是冠状病毒的主要蛋白，而S蛋白的亚基S1则是决定毒株组织嗜性、致病性和抗原性的关键蛋白，也是变异程度比较大的蛋白。JH06111S蛋白与其他IBV参考株S蛋白的同源性在80.0％-97.4％之间，M蛋白的同源性在88.6％-92.8％之间。

进一步的序列比较分析并经NCBI网上的Blast分析发现，与其他IBV毒株相比，JH06111在M基因N端有10个氨基酸正向重复序列插入。这是目前在GenBank上公开的IBVM基因序列中所没有的，这个插入为IBVJH06111所特有。由于JH06111毒株M基因含有重复序列的插入，使得JH06111M蛋白与其他IBV毒株的同源性相对较低。其他毒株间M蛋白较保守，同源性在90％以上。

总之，该发明提供了一株IBV的自然突变株，该毒株从免疫过疫苗的鸡群分离到，可在雏鸡体内繁殖和排毒，但不致明显病症和死亡。遗传进化分析与疫苗株遗传距离较远，其M基因N端插入了10个氨基酸的重复序列。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的有特殊基因插入的突变株，能够突破疫苗的免疫保护，而在机体繁殖下来，这个突变株可以在易感鸡群中增殖，但不致敏感鸡产生明显致病性，因此该毒株可以作为进一步研究弱毒疫苗或IBV毒株变异机制的基础材料。

附图说明

图1：RT-PCR检测咽肛拭子病毒核酸的结果。

图2：免疫组化试验检测感染鸡肾组织的病毒，所用血清为IBV感染鸡的多抗血清。

图3：14日龄SPF鸡感染JH06111后IBV抗体动态变化。

图4：JH06111全基因组遗传进化分析。

具体实施方式

毒株说明：

本发明通过分离鉴定获得了传染性支气管炎病毒(IBV)毒株。该毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。提供保藏的生物材料(株)为JH06111，其保藏名称为：传染性支气管炎病毒。毒株保藏号：CGMCCNO.11491，保藏日期为2015年11月03日。

[实施例1]JH06111分离鉴定

1病毒的分离和鉴定

2006年从浙江金华地区采集的疑似IBV感染的鸡肾组织中分离病毒。具体方法：解剖送检病死鸡，采集肾脏组织。将肾组织剪碎后，以1:3～1:10的比例加入无菌PBS，充分研磨，-70℃和37℃反复冻融三次。5000rpm离心5分钟后取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌。按0.2mL/胚的剂量通过鸡胚尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集尿囊液，盲传3代。盲传到第三代的鸡胚观察到鸡胚蜷曲，类似典型侏儒胚。取其盲传到第三代的鸡胚尿囊液，提取RNA，反转录成cDNA后，用PCR方法扩增IBV的S1基因。S1基因测序及Blast分析确认扩增到的序列与IBVS1基因序列有最高的相似性。把鉴定到的毒株命名为JH06111。

2病毒含量的测定

由于JH06111感染的鸡胚尿囊液10倍系列稀释后，稀释倍数高的病毒液对鸡胚的病变不是非常明显，难以用常规的鸡胚半数感染量(EID50)来测定病毒的含毒量。因此采用病毒基因拷贝数来描述感染尿囊液中病毒的含量。具体做法将IBVM基因扩增后构建到质粒载体PMD-18T上，作为标准对照。然后将IBVJH06011和JH06111传至第9代的鸡胚尿囊液抽提RNA，反转录成cDNA，用Real-time定量PCR检测尿囊液中病毒M基因的拷贝数，并与构建到载体上的M基因的拷贝数相比较，获得JH06111感染的第9代尿囊液的基因拷贝数为3.7*10⁴/ul。

[实施例2]JH06111致病性及感染鸡病毒的检测

将上述测定好基因拷贝数的JH06111感染的鸡胚尿囊液，以IBVM基因4*10⁶copies/200ul/只的量以滴鼻的方式接种1日龄SPF雏鸡10只，设灭菌PBS接种鸡为阴性对照。接种后的雏鸡在负压高效高分子空气过滤不锈钢隔离器内饲养30天。每天观察鸡的临床症状，包括精神状态、采食情况，呼吸是否顺畅，粪便是否正常等。接种后的5-7天，剖检2只鸡，观察剖检病变。试验鸡在JH06111接种后第3天出现轻微的精神沉郁和呼吸困难，试验期间没有出现死亡。剖检发现，肾脏无明显肿大，无尿酸盐沉积现象。

采用RT-PCR扩增S1基因的方法，从接种后2天的鸡咽肛拭子中检测到IBV的核酸，一直持续到感染后的7天(咽拭子)和9天(肛拭子)(图2)，表明JH06111接种雏鸡后2-9天可以向外界排毒。采取感染鸡肾组织，制备肾组织切片，用IBV毒株的感染血清进行免疫组织化学染色，观察到明显的阳性反应(图3)，表明JH06111可以在肾组织中复制增殖。

[实施例3]JH06111感染鸡抗体水平检测及攻毒试验

以IBVM基因4*10⁶copies/200ul/只的量以滴鼻的方式接种14日龄SPF雏鸡10只，设灭菌PBS接种鸡为阴性对照。接种后隔天采血，采用实验室建立的IBVnsp5-ELISA方法检测接种鸡血清中的抗体水平。结果在接种后第9天便检测到接种鸡血清抗体阳转，一直持续到接种后的27天，抗体还保持较高的水平(图3)。为了了解存在的血清抗体是否具有保护性，在接种后的30天，用IBV强毒株JH06011进行攻毒，结果所有接种过JH06111的鸡均存活，没有出现明显临床症状和剖检变化，而对照鸡攻毒强毒JH06011后，有1只鸡(1/10,10％)于攻毒后8天死亡，攻毒鸡出现呼吸症状，剖检可见肾肿大、出血等IBV典型的剖检病变。数据说明，JH06111在机体可产生保护性的抗体，可考虑作为弱毒疫苗的候选毒株。

[实施例4]JH06111基因组测序及分析

1.JH06111基因组的测序

1)病毒RNA抽提及cDNA合成

取JH06111感染的SPF鸡胚尿囊液200μl，加入800μlTrizol，按照Trizol试剂提取RNA的操作说明从尿囊液中提取总RNA。进而用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。具体方法：尿囊液与Trizol震荡混合后，静置15～20min；加氯仿200μl，混合，静置5～10min，12000rpm离心15～20min；取上清，加入等体积异丙醇，轻轻摇匀，静置10min，12000rpm离心10～15min；小心弃去上清，加75％的酒精轻洗沉淀，7500rpm离心10～15min；去上清，风干RNA沉淀，加20μlDEPC水，充分溶解RNA。

抽提到的RNA用于反转录，25μl体系：取溶解的病毒RNA10μl，加入5μl5×Reactionbuffer、2.5μldNTP、1.25μlRiboLockRNase(20u/ul)、1.25μlRandomHexamerPrimer和1.25μlRevertAcidM-MulVReverseTranscriptase(20u/ul)，体系混匀后，25℃5min，42℃1h，70℃5min，完成cDNA第一链的合成。-20℃保存备用。

2)引物设计和基因片段的扩增

通过比较Genbank上IBV的基因组序列，在序列保守区域设计了覆盖整个基因组的引物，以上述合成的cDNA为模板，对JH06111两毒株的基因组分片段扩增，然后将扩增片段回收纯化后送测序公司测序，对于不能顺利扩增的片段，在第一次成功扩增片段测序的基础上设计引物，进行未知片段的扩增。基因组5'端序列用Clontech的SMARTerRACEcDNAAmplificationKit试剂盒扩增获得。

3)基因组序列拼接分析

将获得的覆盖整个基因组序列的片段测序，采用DNAMAN6.0软件拼接毒株的基因组。结果获得JH06111基因组长为27,541bp(SEQIDNO:1)。序列分析发现JH06111毒株全基因组序列具有典型的IBV基因组编码结构特征，即5’-UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’，各片段的序列分别如SEQIDNO:2，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQIDNO:13。各片段编码的氨基酸大小在表1中标出(表1)。

表1JH06111基因组全长及各片段编码氨基酸的大小

2.JH06111基因组遗传进化分析

利用MEGA5.0软件对JH06111毒株全基因组进行遗传进化分析。从Genbank中选取以下毒株的序列作为参考序列：M41(GQ504725,美国，疫苗株，呼吸型)，M41(DQ834384，美国，呼吸型)，Massachusetts(GQ504724，美国，呼吸型)、California99(AY514485，疫苗株，美国)、ck/CH/LSD/05I(EU637854，LSD，山东，呼吸型)、SAIBK(DQ288927.四川，肾型)、BJ(AY319651，北京，肾型)、TW2575/98(DQ646405，台湾，肾型)、ZJ971(EU714028，浙江，腺胃型)、SC021202(EU714029，四川，肾型)、Georgia1998vaccine(GQ504723，美国)、ArkansasDPI(GQ504720，美国)、H52(EU817497，疫苗株，呼吸型)、H120(FJ807652，疫苗株，呼吸型)、H120(FJ888351，荷兰，呼吸型)、ArkDPI11(EU418976，美国)、Partridge/GD/S14/2003(AY646283，中国广东)、A2(EU526388，中国，4/91型)、CQ04-1(HM245924，中国，肾型)、DY07(HM245923，中国，肾型)。在基因的遗传进化树中(图4)，JH06111与常用的肾型参考株SAIBK和SC021202毒株位于同一大的分支，在进一步细分时，JH06111毒力形成一个亚分支，但与疫苗株H120、M41等的遗传距离均较远。

3.JH06111基因组同源性分析

1)JH06111基因组同源性分析

利用DNAMAN6.0软件比较JH06111全基因组与上述参考株全基因组的同源性。JH06111毒株全基因组与参考毒株全基因组核苷酸同源性在85.5％～89.9％之间。点突变、插入和缺失出现在整个基因组中，尤以S1、基因3以及通常最为保守的M基因变异最大。5a、5b、nsp9、nsp10基因相对保守。JH06111S蛋白与其他IBV参考株S蛋白的同源性在80.0％-97.4％之间，M蛋白的同源性在88.6％-92.8％之间。

2)JH06111M蛋白序列特征分析

将JH06111M基因氨基酸序列递交NCBI网上Blast发现，与其他IBV毒株相比，JH06111在M基因N端有10个氨基酸重复序列插入(SEQIDNO:9)。这是目前在GenBank上公开的IBVM基因序列中所没有的，这个插入为IBVJH06111所特有。由于JH06111毒株M基因含有特有的重复序列插入，重新分析其他IBV毒株M蛋白的同源性，发现M蛋白在其它IBV毒株间较保守，同源性在95％以上。因此，JH06111毒株N端的插入序列，使得其M蛋白与其它IBV毒株的M蛋白的同源性偏低。

Claims (4)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒自然突变株，其特征在于，该病毒自然突变株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为传染性支气管炎病毒，保藏号为CGMCCNO.11491。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒自然突变株，其特征在于，该病毒自然突变株的基因组长为27,541bp，其全基因组序列如SEQIDNO:1所示，具有典型的IBV基因组编码结构特征，具体为5’-UTR-1a-1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。

3.根据权利要求2所述的鸡传染性支气管炎病毒自然突变株，其特征在于，该病毒自然突变株的IBV基因组编码结构中，各片段的序列分别如SEQIDNO:2～13所示。

4.根据权利要求2所述的鸡传染性支气管炎病毒自然突变株，其特征在于，该病毒自然突变株与GenBank中登录的其它IBV毒株M基因相比，在M基因N端有10个氨基酸正向重复序列插入，其M基因的氨基酸序列如SEQIDNO:9所示。