CN1056122A - 一种生产六氨基青霉烷酸的膜反应器 - Google Patents

Abstract

一种用于固定化细胞裂解解青霉素生产六氨基 青霉烷酸的膜反应器，该膜为聚砜中空纤维或平板微 滤、超滤膜，利用该膜反应器将含有青霉素酰化酶的 整细胞经交联截留固定化在具有高面体比的中空纤 维和平板膜上、采用反冲模式操作。该反应器的效率 与固定化酶反应器相当，可长期稳定裂解高浓度青霉 素溶液，获得高的产品收率，物料经膜反复过滤，使产 品得以纯化。此类反应器实质为大面积薄层填充床， 在放大时，无放大效应、适宜于工业生产。

Description

本发明是一种用于生化反应工程中的膜反应器及该反应器用于固定化细胞裂解青霉素（PG）生产六氨基青霉烷酸（6APA）技术。

6APA是半合成青霉素的基本原料，目前它主要由酶法裂解青霉素制备。酶法生产6APA有固定化青霉素酰化酶和固定化含有青霉素酰化酶的细胞两种技术。用固定化细胞裂解PG生产6APA省去了酶的分离提取等繁杂步骤，工艺简单、成本低廉，但由于酶包含在整细胞内，以常规方法制得的固定化细胞颗粒大，比活低。通过菌株筛选和基因重组虽然能得到高活力的细胞，但固定化细胞比活低于固定化酶，应用远没有固定化酶广泛。在酶法生产6APA中多采用填充床反应器。线度为几个毫米的颗粒状或纤维状的固定化酶或固定化细胞装填于圆筒式反应器内，青霉素溶液流过固定化酶，固定化细胞床层被催化裂解后流出。由于一次转化率不高，出料经PH调节返回反应器，如此反复循环直至底物接近完全转化。这种常规的填充床反应器在放大时，床层高度和固定化酶或细胞的装填量都有限制，否则将因流动阻力过大而难以正常操作。同时因固定化酶或细胞的粒度较大，装填的不均匀性和反应时的扩散限制都影响酶活力的有效发挥。此外底物溶液对床层的反复冲刷会引起固定化酶或细胞的破碎和酶的脱落，并污染物料导致产品质量下降。近年来出现采用膜反应器浓集游离青霉素酰化酶生产6APA的研究，由于游离酶的不稳定性，反应过程又采用扩散控制或超滤模式操作，反应器效率不高，表现在裂解转化时间长或裂解浓度过低，难以长期稳定操作。

本发明为固定化细胞裂解PG生产6APA提供一种膜反应器及利用该反应器的操作技术，从而提高了单位反应器体积内细胞的装填密度和催化活力，实现了膜反应器生产6APA的长期稳定操作，并可在高底物浓度下获得高的产品收率和高纯优质6APA产品。

本发明反应器所用的膜为聚砜中空纤维或平板微滤、超滤膜，也可采用孔径为30～80μm的滤纸，滤布。由采用膜的不同可分为中空纤维膜反应器和为获得高面体比而将平板膜折迭定形后制成的折迭式平板膜反应器，其膜孔径大小可按与实际所用的固定化细胞的粒度来确定。

图1是中空纤维膜反应器的示意图，图中：1、上下封盖;2、壳体;3、中空纤维膜束;4、环氧树脂固定层，反应器上下封盖1上各带有一管口，壳体2上带有连接管口。成束的中空纤维3用环氧树脂4固定在反应器壳体2内，将反应器隔成内外两个腔室。物料从反应器壳体2的两个连接管口进入外腔，透过膜集流至反应器上下封盖1。中空纤维膜的外径越小，装填根数越多，膜的总面积越大，外径以0.5～1mm，膜厚为150±10μm为佳。

图2是折选式平板膜反应器示意图。图中：5、上下封盖;6、壳体;7、9、分配隔网;8、膜;10、中心管;11、环氧树脂固定层，反应器上下封盖5上各带有一管口，壳体6上带有连接管口。将平板膜按定长、定宽折迭定形后装入中心集流管10和反应器壳体6之间的环形空间，膜8和中心管10、壳体6之间插有尼龙分配隔网9和7。环氧树脂11将膜8、中心管10、壳体6、分配隔网7、9与反应器上下盖5粘接固定。膜将反应器分隔成内外两腔，物料从壳体6的两个连接口进入外腔，依靠隔网分配至膜8与隔网之间形成的各个扇形柱空间，物料透过膜后依靠隔网，进入中心集流管10并通过上下盖5的两上管口流出。为保证各个扇形较均匀地排布，扇形间可填充厚0.5mm左右的尼龙网。膜的折迭总数可按公式πd/δ计算，d为隔网的外径、δ一般取1mm左右。

折迭式平板膜的反应器的折迭平板膜可设计成双层或多层结构。图3为双层折迭膜结构的横截面示意图。图中：6、壳体;7、9、11分配隔网;8、外膜、10、中心管;14、内膜;12、支撑网;13、集注板。中心集管10、支撑网筒12和反应器壳体6之间形成内外两个环形空间，折迭膜8、14分内、外两层装入两上环形柱空间。内层折选膜8在集流板13处反向折迭成半圆形并从支撑网筒12的引流口处伸出与外层折迭网连成一片。反应器的上下两端用环氧树脂与上下盖固定。膜将反应器分隔成两腔。物料从反应器壳体6的两上管道连接口进入，一部分通过分配隔网7流入外层膜与隔网7间的各个扇形柱空间，另一部分通过隔网15从支撑网筒12的引流口流入内层膜的膜外扇形空间，由外层膜渗出的物料流通过集流板13间的入口进入中心管10，由内层膜14渗出的物流通过隔网9进入中心管10，并从反应器上下盖的管口流出。

多层结构与双层结构类似，由于零部件的增多对反应器的组装带来困难，多层或双层结构的折迭平板膜各膜等长折迭、较佳的折迭长度为中心管10外隔网外径的1/2，这时所得到的膜面积最大。在壳体内径相同时，双层结构比单层的膜面积约增加30%。

利用本发明的膜反应器由PG生产6APA的工艺方法，其特点是将含有毒霉素酰化酶的细胞直接通过交联截留的方法固定化在膜反应器内，膜反应器采取反冲操作，反应器无放大效应，物料在反应时反复过滤，以获得高纯度6APA。图4为膜反应器裂解PG生产6APA的流程示意图。图中：16、调节罐;17、泵;18、反应器;19、碱罐;20、自动电位滴定仪。其工艺采用反冲操作模式，具体地说，含有青霉素酰化酶的细胞在PH调节罐16内配成细胞悬浮液，用泵17将悬浮液输入反应器19的外腔，当液体透过膜渗出时，细胞因膜的阻挡截留在膜表面形成固定化细胞床层，为避免细胞自溶，可用戊二醛交联。细胞固定化后，在罐16内配制浓度为8%左右，PH在7.8～8.0的PG溶液，在38～40℃下泵入反应器18，PG被细胞裂解为6APA和苯乙酸（PAA），并透过膜返回罐16，用自动电位滴定仪20控制碱罐19中NaOH的加入以维持反应体系的最佳PH值，碱浓度为1～4N，经PH调节的溶液循环返回反应器17直至加碱终止，停止反应。

从反应系统中排出反应液，加入甲醇、乙醇或醋酸丁脂等溶剂，在0℃左右滴加6NHCl，调节PH至4.0～4.2，6APA即从溶液中析出，经抽滤，干燥后，得白色针状6APA产品。

在上述流程中，细胞依靠交联截留固定化在膜的表面，细胞在膜各部分的截留量与悬浮液通过膜各部分的通量有关，而细胞的截留又降低了膜各部分的渗透通量，这种约制和调节使细胞以一种动态的形式相对均匀地分布在膜表面，反应过程中不会出现短路或沟流现象。此外，膜反应器效率与截留的固定化细胞装填密度有关，当固定化细胞的线度控制在5～100μm时，其装填密度较高，这时的固定化细胞活力与游离细胞相近，稳定性远高于游离细胞，可以长期使用。

进一步讲，反应器的效率取决于固定化细胞的有效装填密度。而细胞的有效装填密度与反应器的面体比及单位膜表面的细胞负载密度有关。本发明的中空纤维膜反应器和折迭式平板膜反应器都具有高的面体比，固定化细胞的线度又有利于提高细胞在膜表面的负载密度。因此，本发明的膜生物反应器的效率高于常规固定化细胞反应器，并达到与固定化酶反应器相当的水平。由于反应器中，总的有效酶活提高，采用本发明的技术可以裂解高浓度青霉素底物，产品可不经浓缩而直接结晶，并获得高的产品收率。

本发明采用反冲操作模式，从外腔进入的PG溶液在透过膜前先通过固定化细胞床层。按此方式操作的膜反应实质上是一个大面积的薄层填充床。放大时，膜的总面积扩大，床层的面积增加，床层的厚度可维持不变，无放大效应。此外，采用反冲操作，物料经过膜的反复过滤使产品的质量提高。下面通过实例对本发时给予进一步地说明。

实例1

取聚砜中空纤维超滤膜564根，用环氧树脂固定在φ36×344的不锈钢管件内，构成膜反应器，膜的内径0.66，外径0.96，有效长275（单位mm）。反应器的体积285ml，有效膜面积4600cm²。

细胞采用中国科学院上海药物所提供的青霉素酰化酶基因工程菌大肠杆菌A56（PPA22）。取菌体50g在PH4.0条件下用戊二醛交联，交联后的菌体活力为原菌体的87%。用2.5l，PH7.8的磷酸盐缓冲液将交联菌体配成菌体悬浮液，输入反应器内，固定化在反应器的外腔。

在充满PH7.8磷酸盐缓冲液中加入医用青霉素钠盐29.4g，在8.2%浓度，38℃，PH7.8的稳定条件下以200ml/min的流量泵入已固定化细胞的膜反应器，反应过程中滴加4N  NaOH溶液借助自动电位滴定仪维持PH恒定。待加碱速度缓慢，加碱量接近理论值时，终止反应。收集裂解液，并加入1/2体积的甲醇，在0-2℃时滴加6NHCl，调节PH至4.0～4.2，即得6APA的结晶液。结晶液经过滤洗涤，干燥后得到白色针形产品。连续裂解50批结果见表1。

表1

批号  反应时间（分）  产品（g）  收率%  纯度%  残余酶活%

1  75  15.8  88.6  98.9  100.0

10  80  15.75  88.3  100.0  96.0

20  80  16.60  93.1  99.9  93.3

30  80  16.20  90.8  99.6  91.0

40  80  16.40  91.9  96.3  83.1

50  80  15.80  88.6  97.9  84.0

实例2

将聚砜平板超滤膜按双层结构固定在φ156×1070mm³的不锈钢管件内。内层膜宽20共314面，外层膜宽28共690面，膜约有效长约0.95米。反应器的体约为17.7l，膜面积的24.3米²。

细胞采用江西乐风制药厂生产的大肠杆菌A56（PPA22）。取菌体3kg在PH4.0条件下用戊二醛交联，交联后菌体活力为原菌体的82%。用PH7.0磷酸盐缓冲液将交联菌体配成悬浮液，输入反应器内，固定化在膜外表面。

2.1kg工业青霉素钾盐倒入PH调节罐内，在PH7.8-8.0，温度38-40℃，浓度7.4%条件下反应。反应终止后，收集裂解液加入1/6体积乙醇，1/2体积的醋酸丁脂，在0℃左右下调PH至4.0。结晶液抽滤，洗绦、干燥。连续裂解51批的结果见表2。

表2

批号  产品（kg）  收率%  纯度%  透光度%

1  1.111  90.7  97.6  99

10-11  2.188  89.8  94.7  98.7

20-21  2.153  88.4  98.1  100

30-31  2.083  85.5  95.3  100

40-41  2.143  88.0  96.1  100

50-51  2.208  90.6  98.5  100

Claims (7)

1、一种用于固定化细胞裂解表霉素生产六氨基青霉烷酸的膜反应器，其特征在于所说的膜为聚砜中空纤维滤膜，制成中纤维膜反应器或聚砜平板膜滤膜，将平板膜折迭定形后制成折迭式平板膜反应器。

2、按照权利要求1所述的膜反应器，其特征在于所用的中空纤维膜的较佳外径为0.5～1mm，膜厚150±10μm。

3、按照权利要求1所述的膜反应器，其特征在于折迭式平板膜反应器中平板膜可采取双层或多层结构的折迭式平板膜反应器。

4、按照权利要求3所述的折迭式平板膜反应器，其特征在于双层或多层结构的折迭平板膜各层膜等长折迭，较佳的折迭长度为中心管，外隔网外径的1/2。

5、按照权利要求1所述的膜反应器，其特征在于所说的膜也可采用孔径为30～80μm的滤纸、滤布。

6、一种利用权利要求1所述的膜反应器，用于固定化细胞裂解青霉素生产六氨基青霉烷酰的工艺方法，其特征是将含有青霉素酰化酶的细胞直接通过交联截留的方法固定化在膜上，膜反应器采取反冲操作。

7、按权利要求6所述的工艺方法，其特征在于较佳的固定化细胞的线度控制在5～100μm。

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