CN105597094A - 猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的制备。所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂按照体积比为1:2-3配制。本发明在18只6周龄SPF级昆明乳鼠和猪体上对疫苗进行安全评价，其中粒径70nm、150nm的纳米硅TGEV灭活疫苗组诱导的IgG和IgA的抗体水平均高于其它各实验组，其中150nm组的抗体水平最高；在对CD4+/CD8+比值的检测结果表明，在首免后第1周，70nm组CD4+/CD8+比值明显高于其它各试验组；在第2周，70nm组和油乳剂组CD4+/CD8+比值较高，明显高于市售铝胶佐剂组。本发明猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂疫苗具有无遗传毒性，无免疫原性，不引起机体产生免疫反应，可靶向输送药物，有缓释作用的优越性。

Description

猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，本发明具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritisofpigs，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirusofswine，TGEV)引起的高度接触性传染病，该病显著的临床症状为严重腹泻、呕吐和脱水等。此病属于国际兽医局(OIE)法典中B类疫病。各品种和各饲养阶段的猪对本病均易感，这是由于仔猪的肠道内还没有建立起稳定的微生态系统，自身抵抗力较弱，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响，其中两周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100％。而随着日龄的增加，5周龄以上仔猪死亡率开始降低，成年猪几乎没有死亡，但有很多不良后果，常常造成饲料报酬率和生产性能下降，这给畜牧业带来极大的经济损失。1946年，Doyle和HutChings两位学者在美国首次对该病作了比较详细的报道，1956和1957年，该病相继在日本和英国发生。随之欧洲、美洲以及亚洲的大部分国家相继报道了本病。从此，该病受到世界各个国家的高度关注和重视，而我国就本病的报道始于上世纪60年代末。近年来该病毒与轮状病毒、流行性腹泻病毒混合感染的流行的趋势加剧。我国多数省份均有本病的发生，给中国养猪业乃至整个畜牧业带来了严重危害。

TGE是一种局部感染性疾病，该病治疗效果差，重在预防。实际生产常采用疫苗接种来获得免疫保护力，但畜牧行业目前所使用的疫苗在不同程度上存在免疫效果不理想，潜伏感染，重组复活，毒力返祖以及排毒散毒等不足。研发新型、安全性疫苗，从而达到有效防制TGE是一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案是：猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。

所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。

所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。

所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

(1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；

(2)制备纳米硅胶；

(3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6℃静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗。

所述步骤(2)中将正硅酸乙酯和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10，将氨水加入到反应液中，在转速为750-800rpm的条件下，搅拌3～5分钟，然后在200-400rpm的条件下搅拌12至16h，得到纳米硅胶。

本发明的有益效果在于：本发明在18只6周龄SPF级昆明乳鼠和猪体上对疫苗进行安全评价，其中粒径70nm、150nm的纳米硅TGEV灭活疫苗组诱导的IgG和IgA的抗体水平均高于其它各实验组，其中150nm组的抗体水平最高；在对CD4+/CD8+比值的检测结果表明，在首免后第1周，70nm组CD4+/CD8+比值明显高于其它各试验组；在第2周，70nm组和油乳剂组CD4+/CD8+比值较高，明显高于市售铝胶佐剂组。这说明各试验均能加强小鼠的细胞免疫状态，其中佐剂为纳米二氧化硅的70nm组免疫增强效果最佳。本发明猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂疫苗具有无遗传毒性，无免疫原性，不引起机体产生免疫反应，可靶向输送药物，有缓释作用的优越性。

附图说明

图1为粒径为70nm纳米的二氧化硅电镜图×60000；

图2为粒径为150nm纳米的二氧化硅电镜图×60000；

图3为免疫后不同时间血清中IgG含量标准曲线；

图4为特异性IgG抗体含量标准曲线；

图5为免疫后不同时间血清中IgG含量；

图6为IgA含量标准曲线；

图7为免疫后不同时间血清中IgA含量；

图8为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；

图9为免疫后小鼠外周血CD4+细胞所占百分比；

图10为免疫后小鼠外周血CD8+细胞所占百分比；

图11为免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的动态变化。

具体实施方式

猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。

所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。

所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。

所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：

(1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；

(2)将正硅酸乙酯和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10，将氨水加入到反应液中，在转速为750-800rpm的条件下，搅拌3～5分钟，然后在200-400rpm的条件下搅拌12至16h，得到纳米硅胶；

(3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6℃静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗。

本发明具体操作如下：

一、不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒株和细胞株

ST细胞购自中国兽药监察所，由本试验室冻存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEVHN-2012)由河南省动物性食品安全重点试验室分离鉴定、纯化并保存。

1.1.2试验动物

6周龄SPF级昆明乳鼠18只，购自河南省试验动物中心；许可证号为：SCXK(豫)2010-0002；编码为No.41003100000673。

1.1.3主要仪器

小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204-N电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；LEICADMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；CO₂培养箱，购自美国ThermoForma公司；fj200s数显高速分散均质机，购自上海索映仪器设备有限公司。

1.1.4主要试剂

“四季青”胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自GIBCOBR公司；甲醛溶液(分析纯)购自西陇化工股份有限公司；0.25％胰蛋白酶、吐温-80均购自Solarbio公司；司本-80购自上海申宇医药化工有限公司；MONTANIDEISA206VG成品白油佐剂为法国赛比克公司产品；正硅酸四乙酯(TEOS)购自国药；氨水购自烟台市双双化工有限公司；无水乙醇购自原天津市化学试剂三厂。纳米二氧化硅溶胶(粒径为70nm、150nm)购自南京东检生物有限公司。

1.2方法

1.2.1ST细胞复苏及传代培养

在无菌条件下，将冻存的ST细胞从液氮罐中取出，立即投入37℃水浴中适当晃动，使冰冻的细胞迅速融化(60s内)。1500rpm离心10min后用75％酒精将冻存管壁进行消毒，弃去冻存液，再转入细胞培养瓶中，加入适量的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，吹打细胞进行充分悬浮，置于5％、37℃恒温培养箱中培养，8h～12h后更换营养液，然后继续放置于5％、37℃恒温培养箱中培养。待细胞铺满细胞瓶后，用0.25％胰蛋白酶消化3～5min，经倒置显微镜下观察，待大部分贴壁的扁平细胞变圆并有少许细胞开始脱落时加营养液停止消化，加入少许营养液吹打数次至分散成单个细胞时，吸取适量细胞悬液至另一干净的细胞培养瓶中，继续培养4～5代，待ST细胞适应培养环境并且形态较好时即可使用。

1.2.2TGEV病毒的增殖

常规方法培养ST细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液作为ST细胞的培养液(pH7.2～7.4)；采用非同步接种猪传染性胃肠炎病毒(HN-2012株)第10代病毒液进行细胞传代培养病毒，10⁵TCID₅₀接毒^[95]，将其置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中进行吸附，吸附1～2h后加维持液，换成含2％胎牛血清的RPMI-1640培养液，继续培养24～36h，待贴壁细胞出现80％的CPE时收获病毒，将收获的病毒反复冻融三次，5000rpm离心30min去除细胞碎片，冻于－80℃保存备用。

1.2.3病毒的纯化

采用差速离心法纯化病毒，将增殖的病毒液于4℃8000rpm离心30min，取上清液于4℃30000rpm超速离心3h，弃上清液，用适量PBS缓冲液悬浮沉淀后，经两次差速离心，用适量PBS液溶解沉淀，将溶解液置于4℃8000rpm离心30min，取上清，即为纯化的病毒液，分装，-20℃保存备用。

1.2.4病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定

选择生长良好的致密单层ST细胞一瓶，按常规的消化方式，将消化后并吹匀的ST细胞悬液加入96孔细胞培养板，于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，用2％的RPMI-1640培养液将纯化后的TGEVHN-2012株病毒液作连续倍比稀释10^-1～10^-10，每个稀释度各作6个重复孔，分别接种于96孔细胞培养板，每孔200μL，设6孔正常细胞生长对照孔。逐日观察细胞病变并记录CPE的细胞孔数，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.2.5病毒的灭活及其灭活效果检验

1.2.5.1灭活时间的确定

取10μL甲醛溶液加到5mL病毒液中，使其终浓度为0.2％，充分混匀后放入37℃温箱中进行灭活，期间每2h混匀病毒悬液一次。分别于16h、20h、24h、36h、48h取出病毒液，加0.2％的焦亚硫酸钠作为中和剂进行终止灭活。对不同时间段的病毒进行灭活效果的检测，同时设不加甲醛溶液的病毒液为对照组。

1.2.5.2灭活病毒液的检测

(1)灭活效果检测

将不同灭活时间段取出的病毒液接种到长成单层的ST细胞上，同时设不加甲醛的对照组。这样连续盲传3代，期间观察细胞病变情况

(2)灭活病毒液无菌检验

将灭活的病毒液接种于普通营养琼脂和普通肉汤中，37℃培养24～36h，观察有无细菌生长。

1.2.6不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备

1.2.6.1猪传染性胃肠炎病毒油乳佐剂灭活疫苗的制备

(1)油相的制备

白油：95.5份

司本-80：4.5份

混合后加热，另加入硬脂酸铝1份，一边加入，一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

(2)水相的制备

灭活的病毒液：96份

吐温-80：4份

剧烈震荡，直至吐温-80完全溶解。

(3)乳化苗的配置：

油相：2份

水相：1份

首先将油相置于一个合适容器中，容器在冰浴中，使用数显高速分散均质机低速转动，缓慢加入水相，先低速后高速以10000rpm搅拌1min后使仪器休息3min，同样的过程重复2～3次，使油相和水相充分剪切混匀，使其成为乳白色油乳剂疫苗。乳化后，取样3～5mL，以3000rpm离心15min，若出现分层，应重复搅拌一次。

1.2.6.2猪传染性胃肠炎病毒纳米硅胶佐剂灭活疫苗的制备

(1)纳米二氧化硅的制备

本试验首先将TEOS和适宜的乙醇混合加入200mL的三颈锥圆底烧瓶中，用磁力搅拌器温和地搅拌3min，转速为500rpm。然后将去离子水和氨水用固定的转速充分混匀，再将混合液迅速地加入到上述的反应液中，迅速调高转速至750rpm，搅拌3～5分钟，再降至低转速进行搅拌12至16h，即可制得所需的二氧化硅凝胶溶液。反应温度、氨水的用量、TEOS的用量均是影响纳米二氧化硅的粒径大小及均一度的重要因素，因此可改变这几个影响因素，来获得需要的粒径。

(2)猪传染性胃肠炎病毒纳米硅胶佐剂灭活疫苗的制备方法：

将灭活的病毒液与70nm、150nm纳米硅胶佐剂分别按照1：2的比例配制，纳米二氧化硅的终浓度为1mg/ml。充分震荡均匀、4℃静置，即制成TGEV纳米硅胶佐剂灭活疫苗。

1.2.7猪传染性胃肠炎病毒油乳佐剂灭活疫苗的质量检验

按照兽用生物制品质量标准^[97]对PPV油乳剂疫苗进行物理性状的检验。

1.2.7.1冷水表面试验：取一支清洁吸管，吸取少量油乳剂疫苗缓慢滴于冷水中，观察油滴是否扩散以及扩散的程度。

1.2.7.2粘稠度检验：取lmL吸管于室温下吸满lmL油乳剂灭活苗，以吸管呈竖直状态时自然流出0.4mL疫苗所需的时间作为判定标准，小于8秒判定为稀薄乳剂，大于8秒判定为较粘稠乳剂。

1.2.7.3稳定性检验：将油乳剂灭活疫苗加满5mL小离心管，3000rpm离心15min，以不分层为稳定性良好；37℃放置30d，观察是否有破乳、分层现象，并记录其自然破乳时间。

1.2.8不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的无菌检验和安全性检验

1.2.8.1无菌性检验

将3种灭活疫苗接种于普通肉汤，普通营养琼脂，血琼脂培养基，37℃培养观察3天，无菌生长为合格。

1.2.8.2安全性检验:

将3种灭活疫苗(TGEV油乳剂灭活疫苗、粒径分别为70nm和150nm的纳米硅胶佐剂组疫苗)各皮下接种6只6周龄昆明乳鼠，每只0.6mL，同时设不接种的对照组；观察7d，看是否出现由疫苗接种而引起的任何不良反应(包括局部和全身的不良反应)。

2结果

2.1病毒滴度TCID₅₀的测定结果

常规培养ST细胞，将细胞置于96孔板中，非同步、倍比稀释后接毒，24h后开始观察细胞病变情况，观察至第5d。通过倒置显微镜观察，细胞明显出现脱落、拉网等现象记为CPE病变孔。统计并按Reed-Muench方法计算毒株的TCID₅₀，结果得出纯化后的HN-2012株的第7～11代TCID₅₀分别为10^-6.22/0.1mL；10^-5.83/0.1mL；10^-5.92/0.1mL；10^-6.22/0.1mL；10^-7.2/0.1mL。所以选取第10代TGEV病毒进行细胞的传代培养，培养出病毒滴度较高的第11代病毒。

2.2病毒灭活效果检验

用0.2％甲醛灭活病毒，分别将经甲醛灭活16h、20h、24h、36h、48h的病毒液取出，在ST细胞上盲传3代的同时观察细胞病变，均没有细胞病变产生。

2.3灭活病毒液的无菌检测

取灭活后的病毒液分别接种于营养肉汤和琼脂平板中，37℃培养24～30h后无细菌生长，符合生物制品规程的要求。

2.4纳米二氧化硅的制备

粒径为70nm、150nm粒径最终均购自南京东检生物有限公司。(如图1、图2所示)

2.5油乳剂灭活疫苗的鉴定

2.5.1冷水表面试验

制备的疫苗剂型为水包油包水型。将制备的油乳剂灭活疫苗滴于冷水的表面，油乳剂滴先不扩散，再向四周缓慢散去。

2.5.2黏度测定

用1mL吸管在室温下吸满1mL油乳剂灭活疫苗，令其垂直自然流出，放出0.4mL需4秒。在2～6秒范围内，说明疫苗较为粘稠。

2.5.3稳定性测定

将油乳剂灭活疫苗经3000rpm离心15min后观察到无分层和破乳现象，37℃放置30d后也未出现破乳、分层现象，说明该疫苗具有一定的稳定性。

2.6不同佐剂灭活疫苗的无菌性检验

3种疫苗接种于普通琼脂、营养肉汤培养基和血琼脂培养基上37℃培养24～48h后，没有肉眼可见的菌落或培养基变浑浊现象，表明无细菌生长，疫苗无菌性检验为合格。

2.7不同佐剂灭活疫苗的安全性检验

3种不同佐剂灭活疫苗各接种6只6周龄健康乳鼠，3倍免疫剂量(0.6mL)注射免疫后，7d后小鼠生长状况良好：精神状态良好、食欲正常，均无任何不良反应，注射部位无肿胀、硬结；疫苗注射组与阴性对照无显著差异，证明制备的3种灭活疫苗对小鼠是安全的。

3结论与讨论

猪传染性胃肠炎病是一种高度接触性的肠道传染病，发病急、传播快，不同饲养阶段的猪只均可感染，仔猪死亡率较高，母猪和种猪几乎无死亡，但是造成饲料报酬低，增加治疗药物的费用等，这让畜牧养殖行业蒙受了极大的损失。对已发生该病的猪场，药物只能起到缓解作用，治疗效果较差，对该病的阳性猪场要采取消毒措施，可采用2％～3％火碱消毒猪舍、运动场、用具、车辆等。并将发病猪与健康猪严格隔离开，严格控制传染源，使损失控制在最小范围内。目前来讲，采用免疫的措施还是预防该病的较为有效的手段，由于目前市场上的TGE疫苗的免疫效果欠佳，因此研究更为有效的疫苗是预防该病的有效途径。常规疫苗和基因工程疫苗市场上都有在用，而常规疫苗中的灭活疫苗作为预防TGE常用疫苗，具有安全、长效等优势在市场上生产和流通。研究更为有效的灭活疫苗意义重大。

研究灭活疫苗的关键点是选择免疫原性强，毒价较高的毒株及合适的细胞系、适宜的培养病毒的方法进行病毒的增殖传代培养；选择合适的佐剂使其辅助抗原发挥较好的免疫效果。

3.1猪传染性胃肠炎病毒的增殖情况

本试验采用的病毒抗原是本试验室分离鉴定并保存的TGEVHN-2012株。经过试验证明，该株病毒具有良好的稳定性、特异性和重复性。据TGEV的培养特性，资料研究显示试验室常用的是猪睾丸(ST)细胞，PKl5细胞等传代细胞进行病毒培养。本试验采用对该病毒较为敏感的猪睾丸(ST)细胞进行病毒的传代增殖。周燕等研究了感染复数、病毒感染时间和病毒维持液对细胞生长的影响，以及对猪传染性胃肠炎病毒繁殖的影响。结果表明，感染复数影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量，对于TGE病毒来说宜采用高病毒感染复数接毒，尽可能使细胞同步感染和病毒同步复制，使病毒效价很快达到最高值，单位细胞病毒产量在较短时间内可达到最大值以缩短生产周期。病毒感染时间也影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率；具有丰富的维生素、氨基酸等营养物质也有利于病毒效价的提高。本研究采用的是2％1640营养液，营养液中的胎牛血清含量低，使佐剂与机体相溶性好，这也是灭活疫苗研究要重点着手解决的问题。

本试验经过对TGEVHN-2012株7～12代病毒滴度的测定，发现病毒滴度在第11代时已基本稳定，且滴度最高，所以选取该代病毒液制备疫苗，经测定纯化后病毒液的TCID₅₀为10^-7.2/0.1mL，符合《兽用生物制品质量标准》中对病毒抗原的要求，为猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备奠定了基础。

3.2灭活剂的选择

本试验研究的关键在于降低猪用灭活疫苗的副作用和提高疫苗的安全性。灭活剂中和或水解充分是保证猪用灭活疫苗安全高效的主要前提之一。不同微生物、活性物质所采用的灭活方法、灭活剂也不尽相同，常用的灭活剂有甲醛、苯酚、β-丙烯内酯、N-乙酰乙烯亚胺(AEI)和二乙烯亚胺(BEI)。一般化学灭活剂的作用随着灭活剂浓度的增加、灭火温度的升高而增强。但是过多灭活剂的残留会起副作用。所以选取灭活剂时，应首先保证生物制品的安全和效力，采用低灭活剂量、低作用温度和短时间处理为最佳条件。甲醛是较古老但也很常用的灭活剂，其灭活的原理是氧化还原作用，该灭活剂易破坏病毒表面的抗原结构，但用量大时，其会有副作用，所以要保证在一定的使用浓度范围内使用，使其对动物机体产生的副作用降至最低。甲醛与病毒作用后，若直接进行细胞感染的检测，残留的甲醛会影响正常的细胞，使最终的结果判定产生偏差，采用非同步接毒的方法可降低甲醛对细胞的毒副作用。本试验病毒液经甲醛灭活后，灭活病毒液接种ST细胞培养，并盲传3代以上，细胞均未出现CPE，通过不断地摸索，最终确定为0.2％的甲醛灭活24h即能将TGEVHN-2012株完全灭活。

3.3佐剂的选择

佐剂可提升机体免疫系统对抗原的免疫应答反应，包括增强免疫反应的强度和持久性。其在增强兽用疫苗的效力方面起着重要的作用。能否选择合适的佐剂与疫苗的效力和安全性有直接的关系。根据来源不同，佐剂分为化学合成类佐剂和生物成分类佐剂。目前弗氏佐剂能够同时对体液和细胞免疫系统均发挥有效的免疫作用。但它也存在缺点：容易引起不良反应，能引起注射部位的组织损伤和造成动物机体的痛苦。因而一般不适于作为疫苗的组成成分使用；只用于免疫血清或抗体的制备，有时也用作对抗原的初期的免疫应答的研究。此外，佐剂的选择还取决于所要获得的免疫应答反应。有些佐剂是以细胞免疫应答反应为主，也有些佐剂以激发体液免疫应答反应为主。目前，市场上的佐剂多种多样，有铝盐佐剂、弗氏佐剂、油乳液、免疫刺激复合物、脂质体和类病毒颗粒等。

目前针对猪传染性胃肠炎疫苗的佐剂研究还较少，一般使用的还是常规佐剂。对其他病毒疫苗的研究，国内张超范等都进行了PPV不同佐剂灭活疫苗的免疫效果对比试验，结果表明国外进口油佐剂免疫效果最好，要优于国内矿物质白油佐剂和铝胶佐剂。

将二氧化硅纳米化后，其比表面积可大大增加，吸附抗原的能力增强，同时可提高抗原的靶向投递，大大降低其副作用。目前纳米硅佐剂用于兽用疫苗的还不多见，但据纳米二氧化硅的无毒、无味的特点，已建立了较为稳定的技术平台，科研人员在将其作为药物载体、疫苗佐剂等医学方面已经对其作出了相关的研究。有研究证明，其作为佐剂能提高疫苗效能，节约成本，并快速激活免疫应答。本试验所用纳米二氧化硅佐剂采用溶胶―凝胶法在最优条件下制备，其平均粒径在70nm和150nm左右，粒度较为均一，可直接用作佐剂。

3.4疫苗安全性检验

理想的灭活疫苗不仅仅能使免疫动物获得较好的免疫保护，其首要前提是应具备良好的安全性。因此，保证疫苗的安全也是疫苗研制过程中的重要环节。本研究在病毒灭活后，在细胞上作出了灭活效果的检测，然后又在在乳鼠上对疫苗进行了安全性检测，结果发现，在选取合适浓度的佐剂及灭活时间后，灭活效果较好，细胞没有病变发生，与佐剂结合后所制成的灭活疫苗对乳鼠进行皮下注射，无乳鼠死亡情况，也未发现有明显的全身或局部临床不良反应，充分证明所制灭活疫苗的安全性是有保证的。

二、不同佐剂猪胃肠炎病毒灭活疫苗小鼠免疫效果研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1疫苗

猪传染性胃肠炎病毒油乳佐剂灭活疫苗(试验一中制备)；粒径为70nm和150nm的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗(试验一中制备)；市售猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(郁可净)，购自上海海利生物技术股份有限公司(生产批号20130913)，佐剂为医用级铝胶佐剂。

1.1.2试验动物

20g左右SPF级昆明小鼠，60只，购自河南省试验动物中心，雌雄各半，编号为N0.41003100000673。

1.1.3主要仪器

小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204-N电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；LEICADMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；CO₂培养箱，购自美国ThermoForma公司；ThermoMultiskanMK3型酶标仪，购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司；流式细胞仪(COULTEREpicsXL)。

1.1.4主要试剂

猪传染性胃肠炎病毒抗体检测试剂盒，购自深圳市绿诗源生物技术有限公司；小鼠(Mouse)免疫球蛋白G(IgG)ELISA检测试剂盒、小鼠(Mouse)免疫球蛋白A(IgA)ELISA检测试剂盒均购自卡尔文生物科技；Goatanti-MouseIgGSecondaryAntibody(peroxidaseconjugated)，购自SAB公司；PEanti-mouseCD3ε、PEanti-mouseCD4、PEanti-mouseCD8a均购自BioLegend；人外周血淋巴细胞分离液、LPS购自北京索莱宝科技有限公司；ConcanavalinA(25mg)，购自SIGMA公司；GoatAnti-MouseIgG、TrizonReagent均购自北京康为世纪生物科技有限公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1动物分组免疫

72只小鼠随机分为6组(见表1)，每组12只，雌雄各半。其中Ⅰ为TGEV纳米二氧化硅灭活疫苗组(70nm)，0.2mL/只；Ⅱ为TGEV纳米二氧化硅灭活疫苗组(150nm)，0.2mL/只；Ⅲ为TGEV油乳剂灭活疫苗组，0.2mL/只；Ⅳ为TGEV市售铝胶佐剂灭活疫苗组，0.2mL/只；Ⅴ为TGEV无佐剂灭活病毒病毒组，0.2mL/只；Ⅵ为生理盐水对照组，0.2mL/只。免疫途径均采用皮下多点注射免疫，两周后进行第二次免疫，剂量同第一次免疫剂量，免疫方案见表1。

表1试验小鼠分组及免疫情况

1.2.2抗体水平的测定

分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6、8、10周，每组随机抽取3只小鼠进行断尾采血，分离的血清应使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中应避免任何细胞的刺激，收集血液后，置于37℃水浴锅或者温箱1h，3000r/min离心10min，使用移液器小心取出血清即可。按照猪传染性胃肠炎病毒抗体检测试剂盒(用Goatanti-MouseIgGSecondaryAntibody更换试剂盒里的辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG)说明书进行操作，应用酶联免疫法检测小鼠血清中的猪传染性胃肠炎病毒，以450nm波长检测。读取各孔吸光度值(OD值)，进行结果判定，样品OD值≥0.3时判为阳性；样品OD值＜0.2时判为阴性；0.3到0.2之间可疑。

按照小鼠(Mouse)免疫球蛋白G(IgG)ELISA检测试剂盒使用说明书进行操作，应用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测小鼠血清中的抗TGEV的IgG和IgA抗体，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度(OD)值，计算样品抗体的含量。

1.2.3淋巴细胞增殖反应的检测(MTT比色法)

在免疫后的第8周，每组取3只小鼠的脾脏，放入盛有少量Hanks液的研钵中，先用剪刀将脾脏剪碎，再用研杵进行研磨(研磨所用研钵及剪刀、镊子均需要高压)，制成组织悬液，再取等体积的淋巴细胞分离液按照淋巴细胞分离液使用说明书将淋巴细胞分离出来，用RPMI1640溶液借助血球计数板将细胞悬液稀释成每毫升1×10⁶单细胞悬液，然后于96孔板中每孔加入100μL，每只小鼠为9孔，其中3孔为ConA刺激组，加入终浓度25μg/mL；3孔为LPS刺激组，加入终浓度为50μg/mL；3孔为对照。同时设置调零孔(培养基、MTT染色液、Formanzan溶解液)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT染色液、Formanzan溶解液)；置5％CO2、37℃培养箱中进行培养，24h后倒置显微镜下观察，测定前4h时每孔加入10μL(5mg/mL)MTT染色液放入37℃培养箱中继续培养，测定时各孔加入100μL的Formanzan溶解液，置摇床上低速震荡10-30min，使结晶物充分溶解。用酶标仪波长为492nm处测定吸光度。结果用刺激指数(stimulationindex,SI)表示。SI＝(刺激物OD值－空白OD值)/(细胞OD值－空白OD值)。根据公式计算比较各试验组间的统计学差异。细胞免疫水平的测定

分别于免疫后0、1、2、3、4周，每组随机抽取3只小鼠经眼球采血0.8～1mL，使用加有抗凝剂的一次性负压采血管进行采血。采血后，标记T样本管分别加入CD3/CD4/CD8单色抗体1μL，全程严格注意避光。待测血液样本振荡30s使其充分混匀。样本管加待测样本全血25μL，振荡15s使其混匀，室温下避光孵育20min；加opticyleC溶血素150μL，振荡15s混匀，室温下避光放置10min；加生理盐水1ml，3000rpm，离心5min；加生理盐水200μL，继续振荡15s使其充分混匀；避光保存，采用流式细胞仪(COULTEREpicsXL)进行分析；检测CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞亚群的阳性率。

1.2.5统计学分析

用SPSS17.0及MicrosoftExcel2010统计软件将所得数据进行统计学处理，计算其平均值，显著水平为P﹤0.05。试验数据以均值Means±SD表示，并用SPSS软件进行Duncan’s多重分析。

2结果

2.1小鼠免疫后诱导的体液免疫应答效果观察

2.1.1小鼠免疫后抗体水平的测定

采用猪传染性胃肠炎病毒抗体检测试剂盒分别对每周断尾采血所分离的血清进行猪传染性胃肠炎病毒IgG抗体水平的检测，对各试验组所测数据进行统计学分析，结果如表2，得到猪传染性胃肠炎病毒IgG抗体消长的规律，如图3所示。经统计分析发现，免疫前各组之间的抗体水平无显著差异(P＞0.05)，从免疫第二周开始，各疫苗组抗体水平都开始明显升高，随着免疫时间的延长，其抗体水平逐渐升高。首免后第三周，除150nm组和无佐剂灭活病毒组外，其余各试验组抗体水平均达到最高水平，尤以70nm组的抗体水平为最高，其与市售铝胶佐剂灭活疫苗组差异不显著，与其余各组均差异显著。各试验组抗体水平一直维持到第10周，而生理盐水对照组不引起机体产生特异性抗体。

表2血清IgG抗体水平的检测结果(Means±SD)

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.2小鼠免疫后IgG抗体水平的测定

采用小鼠(Mouse)免疫球蛋白G(IgG)ELISA检测试剂盒分别对每周断尾采血所分离的血清进行IgG抗体水平的检测，对各试验组进行所测数据进行统计学分析，结果如表3，得到IgG抗体消长的规律，如图5、表3所示。经统计分析发现，免疫前各组之间的抗体水平无显著差异(P＞0.05)，从免疫第1周开始，随着免疫时间的延长，各疫苗组抗体水平都开始明显升高。一免后第4周，油乳剂组、市售铝胶佐剂组以及TGEV无佐剂灭活病毒组的抗体水平均达到峰值，其中抗体水平最高的为油乳剂组。而70nm组和150nm组均在首免后5周达到峰值，其中150nm组IgG抗体水平最高，可达218.58μg/ml，高于其它所有疫苗组的抗体峰值水平，与无佐剂灭活病毒组和生理盐水对照组差异显著(P<0.05)，与其他组差异不显著(P＞0.05)。随着时间的延长，抗体水平均开始慢慢下降。抗体水平下降的速度较慢，各组差异不明显。

表3血清IgG抗体水平的检测结果(Means±SD)

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.3小鼠免疫后IgA抗体水平的测定

采用小鼠(Mouse)免疫球蛋白A(IgA)ELISA检测试剂盒分别对每周断尾采血所分离的血清进行IgA抗体水平的检测，对各试验组所测数据进行统计学分析，结果如表4，得到IgG抗体消长的规律，如图7所示。经统计分析发现，免疫前各组之间的抗体水平无显著差异(P＞0.05)，从免疫第一周开始，随着免疫时间的延长，各疫苗组抗体水平都开始明显升高；首免后第3周，不同佐剂及无佐剂TGEV灭活病毒组的抗体水平均达到峰值，其中抗体水平最高的为150nm组，其次为无佐剂灭活病毒组，除与无佐剂灭活病毒组差异不显著(P＞0.05)外，与其它各试验组均差异显著(P﹤0.05)。各组在首免后第4周、第5周的抗体水平均逐渐下降，但在首免后第6周各组的抗体水平均有所回升，但各组的抗体水平均低于其在第3周所达到的抗体峰值水平。

表4血清IgA抗体水平的检测结果(Means±SD)

注：同一列数据肩标含不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.4疫苗诱导的淋巴细胞增殖效果动态变化

在首免后第8周，每试验组随机抽取3只小鼠，将其断颈处死后无菌摘取脾脏，制成悬液，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，分别用ConA和LPS进行刺激，观察脾细胞的T和B淋巴细胞增殖效果，其结果见表5。

表5不同佐剂灭活疫苗免疫脾淋巴细胞增殖试验结果

注：同列数据无字母相同者，表示差异显著(P<0.05)

由表5可知，不同佐剂疫苗组和生理盐水对照组均能引起淋巴细胞增殖，但对于T淋巴细胞增殖的诱导，150nm组和油乳剂组与生理盐水组差异显著(P＜0.05)，其余各组之间差异不显著；对于B淋巴细胞增殖的诱导，各组之间无显著性差异(P＞0.05)。

2.2免疫小鼠外周血中不同亚型T淋巴细胞动态变化

2.2.1小鼠外周血CD3⁺T淋巴细胞动态变化

各试验组免疫之后所测得的小鼠CD3⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化(如图8)。如图8所示，在首免后第1、2、3、4周，不同佐剂疫苗组的CD3⁺T淋巴细胞在外周血中所占的比例均有升高趋势，在首免后第1周，除无佐剂灭活病毒组外，其余各组的CD3⁺细胞在外周血中所占比例均达到最高。而70nm组与其它各组相比，其CD3⁺细胞在外周血中所占比例为最高，与无佐剂灭活病毒组差异显著(P＜0.05)，与其它各组差异不显著(P＞0.05)。在第2周，70nm组和油乳剂组的差异不显著(P＞0.05)，与其它各组差异显著(P＜0.05)。在第3、4周，各组的CD3⁺T淋巴细胞百分比值动态变化不尽一致，比值上升和下降并存。

表6免疫后小鼠外周血CD3⁺细胞所占百分比检测结果(Means±SD)

2.2.2小鼠外周血CD4⁺T淋巴细胞动态变化

各试验组免疫之后所测得的小鼠CD4⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化(如图9)。如图8所示，在首免后第1周，不同佐剂疫苗组的CD4⁺T淋巴细胞在外周血中所占的比例均有升高趋势，其中无佐剂灭活病毒组与其它各试验组差异显著(P＜0.05)，与生理盐水对照组差异也显著(P＜0.05)。在首免后第3周，70nm组与市售铝胶佐剂组CD4⁺T淋巴细胞在外周血中所占的比例达到最高。

表7免疫后小鼠外周血CD⁴⁺细胞所占百分比检测结果(Means±SD)

2.2.3小鼠外周血CD8⁺T淋巴细胞动态变化

各试验组免疫之后所测得的小鼠CD8⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化(如图10)。如10所示，在首免后第1、2周，除市售铝胶佐剂组在第1周的比值略微升高外，其余不同佐剂疫苗组的CD8⁺T淋巴细胞在外周血中所占的比例均呈现下降趋势。在首免后第3、4周各试验组小鼠CD8⁺T淋巴细胞百分比值下降更为明显。首免后第4周，生理盐水对照组CD8⁺T淋巴细胞百分比值与其它各组的差异显著(P＜0.05)。

表8免疫后小鼠外周血CD8⁺细胞所占百分比检测结果(Means±SD)

2.2.4小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺的动态变化

各试验组免疫之后所测得的小鼠CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞百分比值均呈现了动态的变化(如图11)。如表9、图11所示，在首免后第1周，70nm组CD4⁺/CD8⁺比值显著高于其它各试验组，与其它试验组差异显著(P<0.05)。在第2周，70nm组和油乳剂组CD4⁺/CD8⁺比值较高，和市售铝胶佐剂组相比差异显著(P<0.05)。在第3、4周，各试验组的CD4⁺/CD8⁺比值均呈上升趋势，各试验组之间差异不显著(P＞0.05)。

表9免疫后小鼠外周血CD4⁺/CD8⁺细胞所占百分比检测结果(Means±SD)

3结论与讨论

3.1TGEV灭活疫苗免疫小鼠后抗体水平的检测

IgG是体液免疫应答产生的主要抗体，是血清中的主要抗体成分。在机体免疫中起保护作用，能有效的预防相应的感染性疾病。其也有保护黏膜的作用，对防治TGEV感染也很有效果。IgA按免疫功能可以分为血清型和分泌型两种。血清型IgA虽然有IgG和IgM的某些功能，但在血清中并不显示重要的免疫功能。而分泌型IgA是机体黏膜局部抗感染免疫的主要抗体，故又被称为黏膜局部抗体。TGE是典型的局部感染，通过黏膜免疫(口、鼻)可以产生具有抗感染意义的IgA抗体。

本试验采用猪传染性胃肠炎病毒抗体检测试剂盒测小鼠血清中的抗猪传染性胃肠炎病毒抗体，试验结果显示首免后第三周，除150nm组外其余各试验组抗体水平均达到最高水平，尤以70nm组的抗体水平为最高。而采用小鼠(Mouse)免疫球蛋白G(IgG)和小鼠(Mouse)免疫球蛋白A(IgA)ELISA检测试剂盒分别测定了不同佐剂TGEV灭活疫苗免疫小鼠后小鼠血清相应抗体的变化。结果显示各不同佐剂试验组IgG抗体水平在首免后第4、5周时达到峰值。从抗体峰值水平来看，其中150nm组IgG抗体水平最高，可达218.58μg/ml，高于其它所有疫苗组的抗体峰值水平，从达到峰值水平速度来看，油乳剂组和商品化疫苗组在第4周最先达到峰值水平，相比之下自制油乳剂组的抗体水平较高。而各不同佐剂试验组的IgA抗体水平均在首免后第3周其抗体水平均达到峰值，其中抗体水平最高的为150nm组，其次为无佐剂灭活病毒组。达到峰值水平后，各组抗体水平均开始慢慢下降，各试验组抗体水平下降的速度较慢，各组差异不明显。

从针对TGEV的特异性抗体来说，70nm组的抗体水平上升速度较快且抗体水平最高；而对于抗体水平IgG与IgA抗体自首免1周后，IgG和IgA抗体水平均开始上升，其与生理盐水空白对照组均差异显著(P＜0.05)。这说明TGEV不同佐剂灭活疫苗组均能诱导机体产生较好的体液免疫应答。其中粒径为150nm的纳米硅TGEV灭活疫苗组的诱导的IgG和IgA的抗体水平均较高，效果相对较好。

3.2淋巴细胞的增殖情况

淋巴细胞的增殖和分化对机体的免疫应答非常重要，当淋巴细胞受到抗原或者促有丝分裂原(ConA是T淋巴细胞的有丝分裂原，LPS是B淋巴细胞的有丝分裂原)刺激时，均可发生增殖和分化，表现为淋巴细胞内核酸和蛋白质的合成增加，使其代谢旺盛。因此，测定体外淋巴细胞增殖反应被作为初步判断机体淋巴细胞免疫功能常用的方法。淋巴细胞增殖试验就是利用有丝分裂原能够刺激淋巴细胞增殖，在体外进行淋巴细胞增殖能力检测的一种方法。

试验结果显示，不同佐剂疫苗组和生理盐水对照组均能引起淋巴细胞增殖。不同佐剂疫苗组和生理盐水对照组均能引起淋巴细胞增殖，但对于T淋巴细胞增殖的诱导，150nm组和油乳剂组与生理盐水组差异显著(P＜0.05)，其余各组之间差异不显著；对于B淋巴细胞增殖的诱导，各组之间无显著性差异(P＞0.05)。所以，不同佐剂灭活疫苗诱导T淋巴细胞增殖的能力有一定的影响，对B淋巴细胞的诱导作用，各组之间无显著性差异。常规疫苗与核酸疫苗在某些地方存在着劣势，比如东北农大的梦凡丹等研究发现核酸疫苗能激起机体产生较强的细胞免疫应答，并且用特异性抗原刺激T淋巴细胞增殖的效果要优于非特异性T淋巴细胞有丝分裂原刺激淋巴细胞的增殖效果。其中以pIRES-T1-P2的增强作用最为明显。

3.3TGEV灭活疫苗诱导的细胞免疫应答

CD3⁺T淋巴细胞代表总淋巴细胞，CD4⁺和CD8⁺是T淋巴细胞的两个重要的表面标志，其中CD4⁺T淋巴细胞主要起辅助和诱导增强免疫应答的作用，CD8⁺T细胞主要起抑制、介导细胞毒杀伤的作用。正常机体中两者的互相诱导和制约调节着机体的免疫平衡，CD4⁺和CD8⁺的细胞的数量以及CD4⁺/CD8⁺的比值的反映出机体免疫状态的变化。

本试验采用流式细胞术监测小鼠免疫后不同时间T淋巴细胞亚群的变化，评价各灭活疫苗对机体细胞免疫水平的影响。从本研究的CD4⁺淋巴细胞百分比变化情况看，在首免后第1周，各疫苗组的CD4⁺T淋巴细胞百分比均有一定程度的升高，除了无佐剂灭活疫苗组与其它试验组差异显著之外，其余疫苗组与对照组差异均不显著，说明接种灭活疫苗后产生的是以CD4⁺T淋巴细胞介导的细胞免疫。从本研究的CD8⁺T淋巴细胞数变化情况看，在首免后第1、2周，除市售铝胶佐剂组在第1周的比值略微升高外，其余不同佐剂疫苗组的CD8⁺T淋巴细胞在外周血中所占的比例均呈现下降趋势。在3、4周，CD8⁺T淋巴细胞的比值下降更为明显。这说明不同佐剂灭活疫苗组在提高CD8⁺T淋巴细胞的能力较弱。促进CD8⁺T淋巴细胞增殖与分化的能力也较弱。

CD4⁺/CD8⁺的变化可作为预测感染与排斥的重要指标，是评估机体免疫状态的依据。本试验在首免后第1周，70nm组CD4⁺/CD8⁺比值明显高于其它各试验组。在第2周，70nm组和油乳剂组CD4⁺/CD8⁺比值较高，明显高于市售铝胶佐剂组。在第3、4周，各试验组的CD4⁺/CD8⁺比值大部分呈上升趋势，但各试验组之间差异不显著(P＞0.05)。这说明各试验均能加强小鼠的细胞免疫状态，其中佐剂为纳米二氧化硅的70nm组免疫增强效果最佳。

Claims (5)

1.猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。

2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。

3.如权利要求2所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。

4.如权利要求1或2或3所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

（1）将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；

（2）制备纳米硅胶；

（3）将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6℃静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗。

5.如权利要求4所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中将正硅酸乙酯和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10，将氨水加入到反应液中，在转速为750-800rpm的条件下，搅拌3~5分钟，然后在200-400rpm的条件下搅拌12至16h，得到纳米硅胶。