CN105592847B - 含有以单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的慢性阻塞性肺病的预防或者治疗用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及含有以单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的慢性阻塞性肺病的预防或者治疗用药学组合物。本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物在EL‑4细胞中抑制IL‑4的表达,在动物模型中能够抑制支气管内炎症细胞的扩散。另外,本发明的化合物在抑制CXCL‑1,TNF‑α以及MIP‑2的表达上有非常好的效果,所以可以克服现阶段使用的慢性阻塞性肺病治疗剂的副作用,作为无毒性且治疗效果卓越的化合物可以有益的使用为慢性阻塞性肺病的预防、治疗及改善用组合物。
Description
技术领域
本发明涉及含有以单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的慢性阻塞性肺病的预防或治疗用药学组合物。
背景技术
慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是肺的异常炎症反应,是气道变窄的肺疾病中的一种,慢性阻塞性肺病主要是因为有害粒子或气体的吸入而产生的,特别是被发现吸烟是其主要原因。目前我国(韩国)的40岁以上慢性阻塞性肺病发病率每年成递增的趋势,并且即使是全世界上,慢性阻塞性肺病是唯一的发病率和死亡率都增加的疾病,因而推测到了2020年成为世界上第3大死亡原因。吸烟是肺组织内强力刺激物质的作用,增加多种传染症因子、生长因子、氧化物或趋化因子的生成,将炎症信号传递体系活性化,使得促进以中性粒细胞(嗜中性球)或巨噬细胞为首的炎症细胞的迁移导致更加恶化肺的炎症。由香烟烟雾及炎症细胞引起的例如金属蛋白酶 (metalloproteinase)的蛋白分解酶活性化后破坏肺间质组织内的构成物。这样的结果导致肺组织的异常变化,例如气道壁的肥厚、肺纤维化等,降低了肺的功能。并且,为了慢性阻塞性肺病的预防以及治疗,以疾病主要原因的肺炎症的改善为中心逐渐实现了多种物质的开发。其中,与哮喘治疗相似的,为了慢性阻塞性肺病的炎症改善的类固醇制剂以及抗生剂的治疗能够成为最有效的治疗方法。但是,如果使用类固醇制剂以及抗生剂的话,会产生抑制免疫及免疫耐受性等引起的多种副作用,因此,具有对于以长期治疗为必要条件的慢性阻塞性肺病患者来说具有并不适合的缺陷。
EC-18作为单乙酰基二酰基甘油(monoaetyldiacylglyceride)的一种,是从鹿茸分离出来的。EC-18具有造血功能,在利用盲肠结扎穿孔术(cecal-ligat ion-puncture)的败血症动物模型中使动物的生存率大大增加,并且在实验室管理规范GLP(GoodLaboratory Practice)毒性试验中也显示没有毒性。但是包括上述EC-18的单乙酰基二酰基甘油化合物对慢性阻塞性肺病有怎样的效果至今无任何揭示。因此本发明人为了开发天然物的衍生物或者新的化合物的慢性阻塞性肺病治疗剂而努力的结果,确认单乙酰基二酰基甘油化合物可以抑制IL-4的表达,可以抑制CXCL-1,TNF-α或MIP-2的分泌,可以抑制支气管内炎症细胞的扩散,更好的使用在慢性阻塞性肺病的预防或者治疗中并完成了本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的一个目的是,提供含有以下述化学式1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的,慢性阻塞性肺病的预防或治疗用药学组合物。
[化学式1]
上述化学式中R1及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。
本发明的另一个目的是,提供慢性阻塞性肺病的预防或治疗方法,包括以下步骤,将上述药学组合物对有慢性阻塞性肺病的发病可能性或得了慢性阻塞性肺病的个体给药。
解决问题的技术方案
作为为了达到上述目的的一种做法,本发明提供含有以下述化学式1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的,慢性阻塞性肺病的预防或者治疗用药学组合物。
[化学式1]
在上述化学式中R1及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。本说明书中的脂肪酸基指的是从脂肪酸的羧基中除去-OH基的剩下的部分。
具体的,本发明的慢性阻塞性肺病预防或者治疗用药学组合物可以包括以上述化学式 1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物。本发明中用语“单乙酰基二酰基甘油化合物”是指具有1个乙酰基和2个酰基的甘油衍生物,也可以称作单乙酰基二酰基甘油(MADG)。
以上述化学式1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物中R1及R2分别可以是碳数为14至20 之间的脂肪酸基,优选地可以是,棕榈酰(palmitoyl)、油酰(oleoyl)、亚油酰(linoleoyl)、亚麻酰(linolenoyl)、硬脂酰(stearoyl)、十四酰(myristoyl)、花生四烯酰(arachidonoyl) 等,但不仅限于此。更优选地,上述R1及R2的组合(R1/R2)可以是油酰/棕榈酰、棕榈酰/ 油酰、棕榈酰/亚油酰、棕榈酰/亚麻酰、棕榈酰/花生四烯酰、棕榈酰/硬脂酰、棕榈酰/ 棕榈酰、油酰/硬脂酰、亚油酰/棕榈酰、亚油酰/硬脂酰、硬脂酰/亚油酰、硬脂酰/油酰、十四酰/亚油酰或者十四酰/油酰等,但不仅限于此。再者,上述单乙酰基二酰基甘油化合物作为光学活性,可以是(R)-型、(S)-型或者外消旋体。
上述单乙酰基二酰基甘油化合物,优选地可以是以下述化学式2表示的化合物。
[化学式2]
以上述化学式2表示的化合物称为1-棕榈酰(palmitoyl)-2-亚油酰(linoleoyl)-3- 乙酰甘油(acetylglycerol),在本说明书中命名为PLAG或者EC-18。上述化合物的R1和R2 是分别属于棕榈酰和亚油酰。
上述单乙酰基二酰基甘油化合物可以从鹿茸中提取/分离或者以公知的有机合成法 (韩国公告号为第10-0789323)制备。具体的,鹿茸以乙烷提取,再将其提取残渣用氯仿提取后,获得的提取液再减压蒸馏而获得鹿茸中的氯仿提取物。上述提取中作为提取溶剂使用的乙烷及氯仿的量以可以没过各个使用的鹿茸的程度就很充分,一般对于1kg鹿茸可以使用各个以4~5l左右比例的乙烷及氯仿,但是提取溶剂的种类和使用量不限于此。用此类方法获得的鹿茸的氯仿提取物继续根据一系列硅胶柱色谱法及TLC方法进一步分馏并精炼,而获得本发明中使用的单乙酰基二酰基甘油类化合物。上述色谱法精炼阶段的洗脱液可以使用氯仿/甲醇、乙烷/乙酸乙酯、乙烷/乙酸乙酯/醋酸等,但并不限于此。
一方面,将上述单乙酰基二酰基甘油化合物以化学的合成方法已公开在韩国公告号为第10-0789323中。具体的,(a)在1-R1-甘油的3号位置附上保护基,制备1-R1-3-保护基-甘油的过程;(b)在1-R1-2-R2-3-保护基-甘油的2号位置导入R2基,制备1-R1-2-R2-3-保护基- 甘油的过程及;(c)可以包括1-R1-2-R2-3-保护基-甘油的脱保护反应及乙酰化反应同时执行的过程,根据需要精炼并且可以合成想要的单乙酰基二酰基甘油化合物,作为其他方法还可以用乙酰解(acetolysis)来获得卵磷脂,但不仅限于此。上述化学式1的立体异构体也可以包括在本发明的范畴内。
根据本发明,因确认上述单乙酰基二酰基甘油化合物可以减少IL-4,CXCL-1,TNF-α或MIP-2的分泌,所以确认可以有效的使用在慢性阻塞性肺病的预防或者治疗中。本发明中的用语“慢性阻塞性肺病”是指由于吸入有害粒子或气体导致肺引起异常炎症反应,由此逐渐引起气流受限导致肺功能降低并且诱发呼吸困难的呼吸器官疾病。慢性阻塞性肺病的主要症状是随着慢性咳嗦或慢性痰(咳痰)存在呼吸困难等症状,β2受体激动剂,抗胆碱药物,甲基黄嘌呤等支气管扩张剂或肾上腺皮质激素吸入剂等作为代表性治疗剂被使用。本发明中上述慢性阻塞性肺病优选可能是慢性支气管炎(chronic bronchitis)或肺气肿(emphysema),但并不仅限于此。本发明中的用语中,“慢性支气管炎(chronicbronchitis)”指的是,1年有3个月以上连续2年有痰且持续咳嗽的疾病。吸烟、大气污染、职业风险等刺激导致的支气管损伤被推定为其原因,主要症状为慢性咳嗦、痰、运动时呼吸困难等。并且,有可能引起慢性阻塞性肺病特征的急性恶化,这时,数小时到数日之间导致呼吸困难急剧恶化、痰的量增加、痰的形状由粘液变为化脓并显示为暗黄或微微发青的颜色,粘度增加不容易吐痰。本发明中的用语中“肺气肿(emphysema)”指的是终末细支气管(terminal bronchiole)由于远端气腔(airspace)的破坏导致异常且永久的外周气道以及肺泡的扩张状态。有害粒子和气体的吸入而产生,并且临床上被公知为最具有危险的因素为吸烟。主要症状为慢性咳嗦和痰、呼吸困难等症状。本发明中的用语,"预防"指的是通过给药上述组合物,抑制或迟延慢性阻塞性肺病的发病的所有行为,"治疗"指的是通过上述组合物使得慢性阻塞性肺病的症状有所好转或有利变更的所有行为。
如IL-4的细胞因子不仅是支气管炎症,与气道过敏性也有紧密的联系,气道过敏性是慢性阻塞性肺病的最具代表性的危险因素(Chest 2004,126(6),1832-9)。并且抑制IL-4 表达就能够抑制支气管炎症且降低气道过敏性,进而能够抑制慢性阻塞性肺病的进展。也如TNF-α细胞因子和如MIP-2的CXC趋化因子参与从肺血管循环到肺泡的中性粒子的运输 (trafficking)活动是公知的。它们都是与炎症相关的细胞因子或趋化因子,慢性阻塞性肺病的情况下,增加中性粒子数,并且分泌上述细胞因子或趋化因子。因此气道产生炎症、肌肉壁增厚、增加粘液分泌,出现支气管闭塞的现象。如果支气管闭塞的话肺泡就会扩张而损伤,进而氧气和二氧化碳的交换能力也受损伤,发生呼吸困难的现象增加。特别是,查明了这些细胞因子或趋化因子在患有COPD的患者中增加表达,因此查明与慢性阻塞性肺病之间的关联性。并且,抑制由上述IL-4、CXCL-1、TNF-α以及MIP-2组成的群中选择的蛋白质分泌来能够抑制慢性阻塞性肺病的反应。
本发明的实施例中,i)小鼠T细胞淋巴瘤(mouse T cell lymphoma)细胞的EL-4细胞中,由十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(佛波酯)(phorbol myristate acetate,PMA)诱导的IL-4的表达测定对于单乙酰基二酰基甘油化合物的抑制度的结果,确认了包括EC-18的多数的单乙酰基二酰基甘油化合物有意的抑制活性(实施例2),ii)测定诱发哮喘动物模型的支气管肺泡灌洗液内的CXCL-1、TNF-α以及MIP-2的表达量的结果,比起正常对照群, CXCL-1、TNF-α以及MIP-2所有COPD诱发群中大幅度增加,相反,确认了单乙酰基二酰基甘油化合物(EC-18)的给药群中这些因素有意减少的情况(实施例6)。从这些结果可以看出单乙酰基二酰基甘油化合物对慢性阻塞性肺病的治疗是有效的。
并且,通过本发明确认了上述单乙酰基二酰基甘油化合物能够减少支气管周围的炎症细胞数量或减少CD4+以及Neutrophils Gr-1+细胞。CD4+细胞被公知为是促进免疫的细胞,如果上述细胞过度增加时会发生自身免疫性。慢性阻塞性肺病患者比正常人CD4+细胞数显著增加是已被获知的(Proceedings of the American Thoracic Society,Vol.4,No.7(2007),pp.512-521.)。另外,慢性阻塞性肺病的情况下Neutrophils Gr-1+细胞也会增加(Eur Respir J 2011;38:285- 294.;Nikota et al.Respiratory Research 2011,12:39)。并且,减少上述CD4+以及Neutrophils Gr-1+细胞使得能够抑制慢性阻塞性肺病反应。
本发明的一实施例中,通过台盼蓝染色测定肺组织内炎症细胞,通过免疫荧光染色以及流式细胞术观察CD4+以及Neutrophils Gr-1+细胞的结果,i)观察到COPD诱发群炎症细胞数显著增加,相反,确认了单乙酰基二酰基甘油化合物(EC-18)所有给药群中,炎症细胞数在减少(实施例4),ii)观察到COPD诱发群中CD4+以及Neutrophils Gr-1+细胞数在增加,相反,确认了单乙酰基二酰基甘油化合物(EC-18)所有给药群中CD4+以及 NeutrophilsGr-1+细胞数在显著减少(实施例5)。从这些结果又充分可以看出单乙酰基二酰基甘油化合物对慢性阻塞性肺病的治疗是有效的。
包括本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物的药学组合物,还可以附加包括药学组合物的制备中惯用的合适的载体、赋形剂或者稀释剂。这时,包括在上述组合物的单乙酰基二酰基甘油化合物的含量虽不是特别限定于此,但是可以包括对组合物总重量以0.0001至100.0重量%,优选地以0.001至50重量%,更加优选地以0.01至20重量%。
上述药学组合物可以具有以片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂、灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻结干燥制剂及栓剂组成的群中选择的任一一个剂型,并且可以是口服或者非口服的各种各样的剂型。制剂化的情况下,使用惯用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、界面活性剂等的稀释剂或者赋形剂来调剂。为口服给药的固型制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等,这类固型制剂一个以上的化合物最少与一个以上的赋形剂,例如,淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose) 或者乳糖(lactose)、明胶等混合调剂。再者,除了单纯的赋形剂以外也会使用与硬脂酸镁、滑石一样的润滑剂。为口服给药的液相制剂可以适用悬浮剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等,除了经常使用为单纯稀释剂的水、液状石蜡以外还包括各种各样的赋形剂,例如,湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。为非口服给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻结干燥制剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮溶剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、像橄榄油的植物性油,像油酸乙酯的有注射可能性的酯等。作为栓剂的基质可以使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂精脂、甘油明胶等。
本发明的组合物可以以在药学中有效的量来给药。本发明中用语“药学中有效的量”是指在医学治疗中以适用可能的合理的受益/危险比例来治疗疾患充分的量,有效用量的标准是根据个体种类及重症度、年龄、性别、疾病的种类、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径及排出比率、治疗期间、包括同时使用的药物因素及其他医学领域公知的因素来决定。本发明的组合物可以以个别治疗剂来给药或者与其他治疗剂一并给药,也可以与现有的治疗剂依次或者同时给药。而且可以单次或者多次给药。重要的是考虑上述所有因素以没有副作用的最少量获得最大效果的量来给药,可以根据本领域技术人员轻而易举的决定。本发明的组合物优选的给药量是根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物的形态、给药途径及期间而不同,适当的总1日使用量是正确的医学判断范围内根据主治医生而决定,但是一般以0.001至1000mg/kg的量,优选地以0.05至200mg/kg,更加优选地以0.1至100mg/kg的量每日1次至分成数次给药。上述组合物只要是以预防或者治疗慢性阻塞性肺病为目的的个体就无特别的限定,任何个体都可以适用。例如,猴、狗、猫、兔子、豚鼠、大白鼠、小鼠、牛、羊、猪、山羊等非人类动物、人类、鸟类以及鱼类任何个体都可以适用,并且给药的方式无限制包括本领域技术人员惯用方法。例如,通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内注射给药。
作为另一种做法,本发明提供包括将上述药学组合物给有慢性阻塞性肺病怀疑个体给药的阶段的,慢性阻塞性肺病的预防或者治疗方法。本发明中上述慢性阻塞性肺病的怀疑个体是指已经发病的慢性阻塞性肺病或者可能发病的包括人类的所有动物,本发明的化合物或者包括及其药学许可可能的盐的药学组合物,用药给慢性阻塞性肺病怀疑个体而有效的治疗个体。对于慢性阻塞性肺病与上述说明所述。本发明中的用语“给药”是指以何种适当的方法对慢性阻塞性肺病怀疑个体导入本发明的药学组合物,给药途径是只要能达到目的可以通过口服或者非口服的多重途径用药。
本发明的治疗方法还可以包括,包含上述化学式1的单乙酰基二酰基甘油化合物的药学组合物的以药学有效量来给药。适当的总1日使用量是正确的医学判断范围内根据主治医生而决定,但是一般以0.001至1000mg/kg的量,优选地以0.05至200mg/kg,更加优选地以0.1至100mg/kg的量每日1次至分成数次给药。但是优选地,根据本发明的目的对特定患者的具体治疗的有效量是,根据为了想达到的反应的种类和程度、情况是否使用不同的制剂的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及组合物的分泌率、治疗期间、与具体的组合物一起使用或者同时使用的药物等多样的因素和医药领域公知的类似因素来分别适用。
发明的有益效果
本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物在EL-4细胞中抑制IL-4的表达,在动物模型中能够抑制支气管内炎症细胞的扩散。另外,本发明的化合物在抑制CXCL-1,TNF-α以及MIP-2 的表达上具有非常好的效果,所以可以克服现阶段使用的慢性阻塞性肺病治疗剂的副作用,作为无毒性且治疗效果卓越的化合物可以有益的使用为慢性阻塞性肺病的预防、治疗及改善用组合物。
具体实施方式
以下,在下述例中更加具体的说明本发明,但是下述例是为了帮助理解本发明,并不是为了限定本发明。
制备例1:制备标准烟提取物(Cigarette
smoking;CS)
制备例1-1:实验材料
使用标准烟CM7(Coresta Monitering Cigarette 7,Heinr Borgwaldt,Germany)60 支以及异丙醇(isopropanol)、乙醇(Merck,Germany)、十七烷(n-heptadecane, Sigma-Aldrich,USA),实验装备使用自动吸烟装置(Automatic smoking machine,ISO 3308 规格品,模型:RM20,Heinr Borgwaldt)。
制备例1-2:收集标准烟烟雾
标准烟CM7(Coresta Monitering Cigarette 7,Heinr Borgwaldt,Germany)烟雾凝结物的收集是根据ISO3402规定在吸烟室(温度为22±2℃,相对湿度为60±5%)进行,并且根据ISO3308的规定,使用RM20(Heinr Borgwaldt,Germany)自动吸烟装置(ISO3308 规格品),以吸烟量为35.0±0.3ml,吸烟周期为60±0.5秒,吸烟时间为2.00±0.02秒, 以及烟蒂长度为烟嘴纸(tip paper)长度+3mm(overwrap+3mm)为止的以ISO标准吸烟方法燃烧香烟,用92mm剑桥滤片(cambridge filter,ISO3308规格品)收集香烟的烟雾凝结物(ISO3308,2000)。
制备例1-3:提取标准烟烟雾凝结物
收集香烟烟雾凝结物的剑桥过滤器(camberidge filter)在香烟用烟嘴(cigaratte holder)中分离后分别放入100ml三角烧瓶中,分别加上提取溶剂异丙醇(isopropanol)50 ml后再摇匀,在室温放置8小时以上后提取。提取后过滤并用减压过滤浓缩机浓缩,将放在三个三角烧瓶内的浓缩液收集到闪烁管(scintillation vial)中使用氮气进行完全浓缩。
制备例1-4:计算总颗粒物质(TPM)含量
标准烟主流烟中TPM的含量用以下数学式1来计算。
[数学式1]
TPM:总颗粒粉尘物质(mg/cig),WFHA:吸烟后过滤器烟嘴(Filter Holder)的重量,
WFHB:吸烟前过滤器烟嘴(Filter Holder)的重量,N:每Trap吸烟的支数(cig.)
实施例1:EL-4细胞中单乙酰基二酰基甘油化合物的细胞毒性评价
添加胎牛血清(Fetal Bovine Serum)10%的RPMI培养基(Gibco)中,将小鼠T淋巴瘤细胞的EL-4细胞以5x 104cells/ml的浓度悬浮,每100μl在96壁板上接种后培养12小时。之后,用如下述表1所示的种类及浓度的单乙酰基二酰基甘油化合物(MADG)处理上述培养液后,追加培养24小时的时间。如可数细胞数量的CCK-8(Dojindo公司)工具(Kits)上说明的一样,添加CCK-8溶液各10μl,反应最少30分钟最多4小时的时间后,测定波长570 nm处的吸光度(OD)。细胞生存率(cell viability)按下述数学式1计算,将其结果表示在下述表1中。数学式1中阴性对照群显示将DMSO 0.2%处理的培养液。在下述表1所示,PLAG 是指1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetylglycerol,POAG是指
1-palmitoyl-2-oleoyl-3-acetylglycerol,PSAG是指
1-palmitoyl-2-stearoyl-3-acetylglycerol,PPAG是指
1-palmitoyl-2-palmitoyl-3-acetylglycerol,OPAG是指
1-oleoyl-2-palmitoyl-3-acetylglycerol,OSAG是指
1-oleoyl-2-stearoyl-3-acetylglycerol,LPAG是指
1-linoeoyl-2-palmitoyl-3-acetylglycerol,LSAG是指
1-linoeoyl-2-stearoyl-3-acetylglycerol。
[数学式1]
MADG处理群的OD 570nm值
【表1】
如上述表1所示,观察依据本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物(MADG)浓度的EL-4 细胞的细胞生存率的结果,确认了EC-18在200μg/mL以下的浓度没有显示细胞毒性,而其他化合物在20μg/mL以下的浓度下没有显示细胞毒性。
实施例2:单乙酰基二酰基甘油化合物的EL-4mRNA表达抑制
以实施例1的结果为基础,将上述单乙酰基二酰基甘油化合物以20μg/mL的浓度给药,测定了在EL-4细胞中的依据PMA的IL-4mRNA的表达抑制效果。具体的,由PMA(1ng/mL)诱导的IL-4mRNA的表达量用实时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction,real-time PCR,quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)来测定。细胞准备是将EL-4细胞以1x 106cells/well的浓度分注在6壁板上培养12小时的时间后,将单乙酰基二酰基甘油化合物以20μg/mL的浓度处理1小时的时间,将PMA以1ng/ml的浓度处理后,培养12小时。为了提取总RNA,使用Trizol B(invitrogen公司,美国)提取了核糖核酸(RNA),定量后,利用Omniscript RT kit(Qiagen,GmbH,Hilden,Germany) 合成了互补核酸(cDNA)。将合成的cDNA与模具和下述表2上的IL-4以及GAPDH引物分别混合,使用PCR mix(PCR Master Mix,Bioneer,Korea)在94℃温度下用5分钟时间变性 (Denaturation),以在95℃中30秒、在60℃中45秒、在72℃中45秒反应30周期(cycle) 后,72℃中10分钟进行了使酶惰性化的PCR。如上述测定的EL-4细胞的IL-4mRNA的表达抑制率在下述表3中表示如下。下述表3中各样品名称如表1所述说明。
【表2】
【表3】
如上述表3中所示,处理PMA的群中IL-4的表达量增加了,以此为基准(100%)的时候可以看出,单乙酰基二酰基甘油化合物显示了20%至50%的表达抑制率。
实施例3:阻塞性肺病模型以及样品给药
COPD小鼠模型的制作如下。将8周龄BALB/c公鼠用7%三氯乙醛水合物(chloralhydrate)麻醉后,LPS 100μg/ml和标准烟提取物(Cigarette smoking;CS)4㎎/ml按1:1 混合后的混合物(LPS+CS混合物)从鼻子吸入气管内(intratracheal)100μl,每周共一次 3周,制成COPD模型。即,轻微麻醉后不动的时候将小鼠的前牙用橡皮筋固定后往鼻子和嘴里分别吸入LPS+CS混合物50μl量,共100μl量吸入到气管内(intratracheal)。按浓度类别30mg/kg和60mg/kg的EC-18溶入到0.5%CMC(carboxmethylcellulose sodium)中后,将PS+CS混合物100μl吸入到气管内(intratracheal)的1小时之前口服给药。实验群分为 (i)没有进行任何处理的正常群(Intact),(ii)处理LPS+CS的对照群(COPD-control), (iii)处理LPS+CS1小时前将EC-18口服给药30mg/kg的实验群,(iv)处理LPS+CS混合物1 小时前将EC-18口服给药60mg/kg实验群。实验结束后将各群小鼠的血液、肺泡灌洗液以及肺组织予以分开。
实施例4:支气管肺泡灌洗液(BAL fluid;BALF)分泌及总细胞数测定
血液采学后进行解剖,为了从肺泡灌洗液(BALF)分离细胞,将注入FBS-free/DMEM培养液1ml的注射器注射到支气管(trachea)后用线捆绑固定后,循环3次来分离将ACK溶液在37℃处理5分钟时间溶解红细胞,重新用FBS-free/DMEM培养液灌洗后用0.04%台盼蓝(trypan blue)染色后测定总细胞数,其结果如下述表4。
【表4】
其结果如上述表4所示,对于慢性阻塞性肺病(COPD)来说肺的炎症是重要的特征,故观察了炎症细胞中的中性粒细胞的数量增加。COPD诱发群与正常对照群对比,观察了支气管肺泡灌洗液内总炎症细胞数的增加,并且炎症细胞中的中性粒细胞的数量显著增加了。相反,用药群的EC-1830mg/kg给药群中总炎症细胞数被抑制了15.1%,中性粒细胞的数量没有明显的变化。EC-1860mg/kg给药群中总炎症细胞数被抑制了44.8%(P<0.05),中性粒细胞的数量也被抑制了42%(P<0.05)。
实施例5:通过流式细胞术测定CD4±和中性粒细胞(Neutrophils Gr-1±)细胞数
将众多分离的BAL细胞调整到5×105细胞后,在4℃温度进行了免疫荧光染色(immunofluorescence staining)。分别放入PE-anti-CD4(553047,BD Pharmingen)和 PE-anti-Gr-1(553128,BD Pharmingen)后用30分钟时间在冰上进行反应。反应后3次以上用磷酸盐缓冲生理盐水水洗后使用流式细胞仪(flow cytometer)的配套软件(Cell Quest) 程序(643274,BD Biosciences)将CD4+和Gr-1+Neutrophil+细胞频率以百分比(%)分析后,采用总细胞数(total cells)算出各组织中的绝对总细胞数(absolute number)。
【表5】
其结果如上述表5所示,COPD诱发群是CD4+和中性粒细胞(Neutrophils+Gr-1+)细胞数与正常对照群相比都大幅度增加了。相反,EC-18 30mg/kg给药群中比起COPD诱发群,CD4+细胞数被抑制了39.6%、中性粒细胞(Neutrophils+Gr-1+)细胞数被抑制了 40.9%(P<0.05);60mg/kg给药群中,CD4+细胞数被抑制了70.0%、Neutrophils+Gr-1+细胞数被抑制了62.7%(P<0.05)。
实施例6:按ELISA方法肺泡灌洗液内的CXCL-1,TNF-α和MIP-2的表达量测定
小鼠中分离的肺泡灌洗液中将CXCL-1、TNF-α以及MIP-2标准用应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)来测定。CXCL-1、TNF-α以及MIP-2 的各抗体(antibody)用包被(coating)缓冲液(291195,R&D System)稀释后涂覆(coating) 微孔(microwell)后在4℃温度下过了一夜(overnight)。各孔用洗涤(washing)缓冲液洗涤3次后分别分注100μl血清(稀释10倍)。在室温放置1小时候用洗涤(washing)缓冲液洗涤2次后处理抗体(antibody)Avidin-HRP conjugeted(DY998,R&D System)100μl,在室温放置1小时后再次洗涤。分别分注100μl的TMB基质在暗室放置30分钟后,将50μl的停止液(stopsolution)处理后测定了ELISA reader(Emax,Molecular Devices)450nm 处的吸光度,计算表达抑制率的结果如下述表6所示。
【表6】
群(Group) | CXCL-1(pg/mL) | 抑制百分比(%inhibition) |
NC | 71.9±15.93 | - |
COPD | 312.6±63.16 | - |
EC18-30 | 264.3±79.77 | 15.4 |
EC18-60 | 142.9±26.99 | 54.3 |
如上述表6所示,COPD诱发群在支气管肺泡灌洗液内CXCL-1的生成比起正常对照群显著增加。但是,用药群的EC-18给药群比起COPD诱发群,在30mg/kg给药群中被抑制了15.4%,60mg/kg给药群中被抑制了54.3%(P<0.01)。
【表7】
群(Group) | TNF-α(pg/mL) | 抑制百分比(%inhibition) |
NC | 1.5±0.34 | - |
COPD | 35.0±9.68 | - |
EC18-30 | 22.4±13.98 | 36.0 |
EC18-60 | 13.4±5.33 | 61.8 |
另外,如上述表7所示,COPD诱发群在支气管肺泡灌洗液内TNF-α的生成比起正常对照群显著增加。但是,作为用药群的EC-18给药群与COPD诱发群比较,30mg/kg给药群中抑制了36.0%,60mg/kg给药群中抑制了61.8%(P<0.05)。
【表8】
群(Group) | MIP-2(pg/mL) | 抑制百分比(%inhibition) |
NC | 12.0±1.75 | - |
COPD | 48.7±15.02 | - |
EC18-30 | 28.9±5.72 | 40.6 |
EC18-60 | 17.6±4.07 | 63.8 |
另外,如上述表8所示,COPD诱发群在支气管肺泡灌洗液内MIP-2的生成比起正常对照群显著增加。但是,作为用药群的EC-18给药群与COPD诱发群比较,30mg/kg给药群中抑制了40.6%,60mg/kg给药群中抑制了63.8%(P<0.05)。
综上所述,本发明的所属技术领域的技术人员是能够明白不变更本发明的技术思想或者必要的特征下可以以其他具体的形态实施。与此相关,可以理解为以上的技术例在所有的面是一种例示,并且不仅限于此。解释为比起上述详细的说明,本发明的范围包括后述的专利权利要求范围的含义及范围,以及从其等同概念得出的所有变更或者变形的形态都应属于本发明的范围。
Claims (9)
1.一种含有以下述化学式1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分在用于制备预防或治疗慢性阻塞性肺病的药学组合物中的用途;
[化学式1]
所述化学式中R1及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述R1及R2分别为由棕榈酰(palmitoyl)、油酰(oleoyl)、亚油酰(linoleoyl)、亚麻酰(linolenoyl)、硬脂酰(stearoyl)、十四酰(myristoyl)、花生四烯酰(arachidonoyl)组成的群中选择。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述R1及R2的组合(R1/R2)由油酰/棕榈酰、棕榈酰/油酰、棕榈酰/亚油酰、棕榈酰/亚麻酰、棕榈酰/花生四烯酰、棕榈酰/硬脂酰、棕榈酰/棕榈酰、油酰/硬脂酰、亚油酰/棕榈酰、亚油酰/硬脂酰、硬脂酰/亚油酰、硬脂酰/油酰、十四酰/亚油酰或者十四酰/油酰组成的群中选择。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述单乙酰基二酰基甘油化合物是以所述化学式2表示的化合物
[化学式2]
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述单乙酰基二酰基甘油化合物是从鹿茸分离的组合物。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述慢性阻塞性肺病是慢性支气管炎或肺气肿(Emphysema)。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述单乙酰基二酰基甘油化合物能够减少由IL-4,CXCL-1,TNF-α及MIP-2组成的群中选择的任一一个以上的蛋白质分泌。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述单乙酰基二酰基甘油化合物能够减少支气管或血管周围的炎症细胞的数量,或者减少CD4+或中性粒细胞+Gr-1+细胞数量。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述组合物中以所述化学式1表示的单乙酰基二酰基甘油化合物的含有量为0.001至50重量%;
[化学式1]
所述化学式中R1及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。
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Citations (1)
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---|---|---|---|---|
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WO2005112912A1 (en) * | 2004-04-24 | 2005-12-01 | Sang-Hee Kim | Immunomoduating agent, anti-cancer agent and health food containing monoacetyldiacylglycerol derivatives |
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