CN105586340A - HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种经过优化的HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途。首次揭示一种经过点突变的HER2/neu组织特异性启动子，该启动子选择性地在HER2/neu阳性细胞中具有启动子活性；并且其在低氧条件下具有强的启动子活性，因此可被应用于抗HER2阳性肿瘤基因治疗领域。

Description

HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途

技术领域

本发明属于生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及一种经过优化的HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途，该启动子变异体可在Her2/neu阳性细胞中驱动其下游目的基因表达，尤其可驱动目的基因在低氧环境下获得更高效的表达。

背景技术

erbb2基因编码产物是表皮生长因子受体2(epidermalgrowth-factorreceptor2)，又称HER2/neu抗原，其胞内段具有蛋白酪氨酸激酶活性。HER2/neu与配体结合后可以活化下游的多个信号途径，包括：Ras/MAPK和PI3K/AKT，最终激活c-fos和c-jun等转录因子，促进有丝分裂，引起细胞的增殖。HER2/neu是一种肿瘤相关抗原，过度表达在多种人类肿瘤组织并与这些肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、肺腺癌等。因此靶向HER2/neu阳性肿瘤是肿瘤生物治疗的热点。最显著的是，HER2基因是影响乳腺癌预后的一个重要因素，大约有25％-30％左右的乳癌患者，受到体内癌细胞HER-2基因过量表现的影响，他们的癌细胞不仅繁殖能力强，对部份化学治疗药物也容易有抗药性，造成病患即使接受手术治疗，癌细胞仍然有较高复发及转移的机率，无法长期存活。乳腺癌病人可分为Her-2/neu阳性或Her-2/neu阴性两种截然不同的预后之乳癌。HER-2蛋白过量表达的肿瘤生长速度较快且生物行为较为恶性，使得手术后复发率高于其他类型的乳癌。因此，以HER2/neu抗原为靶标的免疫治疗方案是治疗Her2阳性乳腺癌的研究热点，包括单克隆抗体、HER2/neu重组疫苗、HER2/neu-热休克融合蛋白、HER2/neu致敏的树突状细胞疫苗等，其中抗HER2/neu单抗(英文名：Herceptin；赫赛汀，注射用曲妥珠单抗)已广泛应用于临床治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌和转移性胃癌，但抗体治疗的成本无疑是昂贵的，并且对一些正常组织具有一定的毒性。因此，开发靶向HER2/neu、毒性低、成本低廉、制备方便、高效的生物新药领域的重要课题。

抑癌基因(tumorsuppressorgene)也称为肿瘤抑制基因。抑癌基因的产物能够在多个环节上保护正常细胞，使其免于最终发生癌变，主要参与抑制细胞增殖、促进细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞迁移，因此在肿瘤发生发展过程中起负调控作用。抑癌基因的产物主要包括转录调节因子(如，Rb、p53)、负调控转录因子(WT)、周期蛋白依赖性激酶抑制因子(如，p15、p16、p21)、DNA修复因子(如BRCA1、BRCA2)、与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分(如，APC、Axin)、信号通路的抑制因子(如rasGTP酶活化蛋白，NF-1)，磷脂酶(phosphataseandtensionhomologydeletedonchromosometengene，PTEN))等。肿瘤抑制蛋白Axin是一种多结构域支架蛋白，对Wnt/β-catenin、JNK信号途径具有负向调控作用，还能够活化另一个抑癌基因p53，因此参与细胞生长、增殖、分化、癌变和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程。在许多肿瘤组织中都发现了Axin异常表达和功能缺失，如肺癌、大肠癌、乳腺癌，恶性黑素瘤等，因此Axin功能异常参与多种肿瘤发生、发展的机制涉及信号转导、细胞周期、细胞增殖、凋亡以及细胞黏附等多个方面。PTEN是具有双特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制蛋白，其编码基因在多种恶性肿瘤中发生突变或缺失，导致其抑癌功能减弱或丧失，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。目前发现卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、恶性胶质瘤等存在PTEN基因的突变、缺失或低表达，从而影响其肿瘤抑制功能。PTEN主要通过抑制PI3k/Akt/mTor信号转导通路，负向调控细胞的增殖、侵袭、转移、血管形成和多药耐药等恶性生物学特征。因此，利用携带促进野生型抑癌基因如Axin、PTEN靶向肿瘤组织可以诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的过度增殖、促进肿瘤细胞分化、增加传统化疗药物对相关肿瘤的化疗效果，逆转肿瘤细胞的多药耐药等，目前已经成功应用于部分肿瘤的临床研究，并取得了初步成果。然而，如何将上述抑癌基因选择性的靶向肿瘤组织、减少对正常组织的毒性，并在肿瘤组织中获得优势表达，是肿瘤基因治疗领域的一个迫切需要解决的技术难题。

解决肿瘤靶向方面的一条途径是，通过将控制肿瘤相关抗原表达的启动子或调控元件构建于抗肿瘤基因的上游，使目的基因选择性高表达在表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞中，实现目的基因对肿瘤的抑制作用，这一方案无疑拥有潜在的临床应用前景。此外，研究调控肿瘤相关抗原表达的启动子以及调控序列也对研究肿瘤发生发展的机制具有指导意义。HER2/neu是乳腺癌等肿瘤组织特异表达的肿瘤相关抗原，相关文献(MarionLanteri等，BreastCancerResearch2005，7:R487-R494)曾报道过控制HER2/neu的启动子基因，能够将具有细胞毒效应的基因选择性的靶向HER/neu阳性的肿瘤细胞。

肿瘤组织微环境已被公认是促进肿瘤进展的重要因素，其中低氧是肿瘤微环境中的一个关键病理因素。低氧在肿瘤生物学中的许多方面扮演着重要的角色，包括肿瘤组织的血管生成、上皮间质转化、侵袭、转移、遗传不稳定性、永生化和干细胞维持、免疫逃避、代谢、PH调节和放射治疗耐受等。肿瘤内低氧是常见的并且往往是最严重的，正常乳腺组织的氧分压是65mmHg，而乳腺癌瘤内氧分压是10mmHg，会增加患者死亡风险，这一风险独立于肿瘤大小，分期，组织学分型，等级，或淋巴结状态等因素。低氧促进肿瘤进程的机制在于，作为转录因子的低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)促进肿瘤组织中的血管生成、诱导免疫抑制因子基因(如IDO，TGF-β，IL-10等)和癌基因(如，HER/neu，BCR-ABL，EGFR)但失活抑癌基因(如P53，PTEN等)的表达等。因此将低氧因素考虑到启动子设计方案中，使目的基因在具有低氧特征肿瘤组织中获得优势表达，是提高肿瘤靶向治疗效果的一个有效手段。

因此针对HER2/neu阳性肿瘤细胞，改造控制HER2/neu抗原表达的启动子序列，使下游目的基因能够在肿瘤低氧微环境下并选择性的在HER2/neu阳性肿瘤细胞中获得优势表达，是本发明的目标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经过优化的HER2/neu组织特异启动子变异体及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸选自下组：

(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的多核苷酸；

(2)核苷酸序列在严格条件下能够与SEQIDNO:1杂交且具有指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达功能的多核苷酸；

(3)核苷酸序列与(1)-(2)任一限定的序列互补的多核苷酸。

在一个优选例中，(2)或(3)所述的多核苷酸中，对应于SEQIDNO:1的第156位位置的核苷酸为C。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为启动子元件。

在一个优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因选自：能够被转录成多肽的RNA分子的目的基因，被转录成反义RNA分子或被转录成针对内源基因的干扰RNA或miRNA的目的基因；较佳地，所述的多肽是对于防止疾病有效的多肽，或是能指示体内存在HER2/neu阳性肿瘤细胞或组织的多肽；

较佳地，所述的目的基因选自：抑癌基因；或可以沉默或者抑制癌基因的反义核酸或干扰RNA、或者miRNA。

在另一优选例中，所述的目的基因包括但不限于：Axin、PTEN等。

在另一优选例中，所述相对于所述启动子元件，所述的目的基因是同源的或是异源的。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述核酸的下游，且与所述启动子的间隔小于1000bp；优选的，小于500bp；更优选的，小于100bp；如小于50bp。

在另一优选例中，所述的表达载体是病毒载体(如腺病毒载体)。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞：

含有所述的载体；或

其基因组中整合有外源的所述的核酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组病毒，所述的重组病毒由所述的载体包装而成。

在本发明的另一方面，提供所述的核酸的用途，用于作为启动子元件，指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达；更佳地，在低氧条件下，指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的载体或由其包装而成的病毒；以及药学上可接受的载体或赋型剂；并且，所述的载体中目的基因为抑癌基因。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pGL3-Promoter质粒的图谱，以及在HindIII和NheI中插入p665/p424/p253替换SV40启动子的示意图。

图2、在pGL3-promoter启动子位置分别插入来自erbb2基因的p665，p424，p253基因片段后，报告基因在不同HER2/neu表达水平肿瘤细胞中荧光素酶的相对活性。

图3、pGL3-promoter启动子区分别插入p253和突变的p253(SEQIDNO:2中第156位发生G→C点突变，形成SEQIDNO:1序列)片段后，报告基因质粒在常氧和低氧环境下，转染HER2/neu阳性肿瘤细胞中荧光素酶的相对活性。

图4、AdpH/HER2-Axin以及阳性对照AdpCMV-Axin的重组腺病毒表达载体在常氧和低氧条件下转染HER2/neu不同水平表达的HER2/neu阳性肿瘤细胞中Axin的表达。

图5、AdpH/HER2-Axin和AdpH/HER2-PTEN的重组腺病毒表达载体在常氧和低氧环境下对HER2/neu阳性(HCC419，MCF7，HCC1954)和阴性肿瘤细胞(HCC806，SMMC7721，SMMC7703)的凋亡诱导作用；其中，

A：腺病毒表达载体转染HCC1419细胞；

B：腺病毒表达载体转染MCF7细胞；

C：腺病毒表达载体转染HCC1954细胞；

D：腺病毒表达载体转染HCC1806细胞；

E：腺病毒表达载体转染SMMC7721细胞；

F：腺病毒表达载体转染SMMC7703细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种经过点突变的HER2/neu组织特异性启动子，命名为pH/HER2。该启动子选择性地在HER2/neu阳性细胞中具有启动子活性；并且其在低氧条件下具有强的启动子活性，因此适用于在HER2/neu阳性肿瘤低氧微环境下诱导目的基因的高效表达。

术语

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异(性)启动子”是指一类启动子，在其调控(驱动)下，基因往往只在某些特定的细胞、器官或组织部位表达。本发明中，所述的“组织特异性启动子”是HER2/neu组织特异启动子。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：能够被转录成编码多肽的RNA分子、或被转录成反义RNA分子或被转录成针对内源基因的干扰RNA或miRNA的目的基因；例如抑癌基因。

组织特异性启动子及其指导的基因表达

本发明提供一种HER2/neu组织特异启动子，其具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQIDNO:1指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。前提是：所述的多核苷酸中，对应于SEQIDNO:1的第156位位置的核苷酸为C。

“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在HER2/neu阳性细胞中特异性表达的功能。

本发明还包括与SEQIDNO:1序列具有70％或以上(优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上)相同性的核酸，所述核酸也具有指导目的基因在HER2/neu阳性细胞中特异性表达的功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是同源的或外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种功能性、治疗性多肽的核酸序列)。

本发明人发现，所述的启动子对于缺氧状态下的体内治疗是特别有用的。利用所述HER2/neu组织特异启动子控制可转录目的基因在HER2/neu阳性肿瘤细胞中表达，通过目的基因的性质，如编码肿瘤抑制蛋白或者可以沉默或者抑制癌基因的反义核酸或干扰RNA、或者miRNA用于预防和/治疗HER2/neu阳性肿瘤的用途。目的基因也可以是编码用于反映体内存在HER2/neu阳性肿瘤细胞的指示分子，用于判断HER2/neu阳性肿瘤治疗后的复发和预后等监测用途。

本发明的启动子除了在常氧条件下具有良好的HER2/neu组织特异启动子活性，可用于调控在HER2阳性细胞中目的基因表达的用途；其更大的优势在于：在低氧条件下，其具有显著更强的启动子活性，适合于在低氧微环境下在HER2阳性细胞中控制可转录目的基因高表达的用途，因此，本发明的pH/HER2启动子可被应用于抗HER2阳性肿瘤基因治疗领域。

在本发明的一个实施例中，所述的目的基因编码人类抑癌蛋白Axin分子；在本发明的另一个实施例中，所述的目的基因编码人类抑癌蛋白PTEN分子。应理解，在阅读了本发明后，任何需要进行HER2/neu阳性细胞针对性驱动表达的应用均包含在本发明中。

任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。

作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。作为本发明的优选方式，所述的载体是病毒。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、潮霉素抗性等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化或转染适当的宿主细胞，以使其能够表达目的基因。根据所应用的领域，本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、潜在的HER2/neu组织特异启动子基因

经过大量分析研究，发明人初步确定人HER2/neu(Homosapiensv-erb-b2avianerythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog2(ERBB2))基因组织特异启动子的大致范围(+16000-+17000)(参考序列ID:ref|NG_007503.1|)；在该序列中找到潜在核心启动子的CAAT和TATAA盒，发现在+16798存在潜在的CAAT盒，在16896存在潜在的TATAA盒，因此以此为中心，向3’下游扩展200bp左右，5’上游扩展500bp，将该区输入JASPAR数据库；根据已有的控制HER2/neu表达的转录因子和通用核因子(如：SP1，GATA2，NFKB，ARNT，ETS)结合序列信息，确定三个基因区，分别为：253bp(+16713--+16965)，命名为p253；424bp(+16678--+17101)，名p424；和665bp(+16437--+17101)，命名p665。分别为：

1)253bp(+16713～+16965)，命名为p253-HER2/neu(简称p253)，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；

2)424bp(+16678～+17101)，命名为p424-HER2/neu(简称p424)，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；

3)665bp(+16437～+17101)，命名为p665-HER2/neu(简称p665)，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。

实施例2、构建含有p665/p424/p253启动子荧光素酶报告基因质粒

根据上述SEQIDNO:2，3，4基因区序列，设计首尾序列、两端添加限制性酶切位点(NheI和HindIII)和保护碱基、合成引物。分别为：

p253上下游引物对：

SEQIDNO:5：5’-CTAGCTAGCAACCCAGGCGTCCCGGCGC-3’；

SEQIDNO:6：5’-CCCAAGCTTCCCGGGGGGCTCCCCTGGTTTC-3’；

p424上下游引物对：

SEQIDNO:7：5’-CTAGCTAGCATTCTCCGAGGAAAAGTGTGAGAAC-3’；

SEQIDNO:8：5’-CCCAAGCTTATGGTGCTCACTGCGGCTCC-3’；

p665上下游引物对：

SEQIDNO:9：5’-CTAGCTAGCGGAAGCCACAAGGTAAACACAACACATCCCCC-3’；

SEQIDNO:10：5’-CCCAAGCTTATGGTGCTCACTGCGGCTCC-3’。

以人MCF7肿瘤细胞基因组DNA为模板，PCR方法扩增上述三个潜在的启动子基因片段。PCR扩增条件：

将上述PCR扩增片段，经胶回收、双限制性酶切，克隆入p-GL3-promoter(获自Promega)荧光素酶报告基因质粒中；挑选测序正确的阳性克隆、大量扩增纯化。如图1，在NheI和HindIII中插入p665/p424/p253替换SV40启动子。

实施例3、筛选HER2/neu组织特异启动子

将分别携带P253，p424，p665报告基因质粒、用脂质体(Lipofectin2000，购自invitrogen)转染方法转染入表达不同水平HER2/neu抗原的肿瘤细胞(HCC-1954：HER2/neu^mid；HCC-1419：HER2/neu^hi，HCC1806：HER2/neu^-，Lovo：HER2/neu^-，购自美国ATCC)。细胞接种于96孔板，细胞浓度为1-5×10⁴/孔，标准条件下培养12h后，参照说明书使用lipo2000转染试剂，每孔共转40ng荧光素酶报告基因质粒或对照质粒，10ngpRL-TK-荧光素酶内参质粒。转染24h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光活性。记录Firefly荧光值与内参Renilla荧光值的比值，即为报告基因活性值。

结果如图2，显示p253具有较强的启动子活性、并且荧光素酶活性与HER2/neu的表达水平具有正相关关系，而p424，p665的启动子活性较弱。因此，p253具有HER2/neu组织特异启动子活性。

实施例4、低氧诱导增强的HER2/neu组织特异启动子

针对P253中的序列ggaggtgg，本发明人将该序列的第四个碱基突变为C，即对该位置进行G/C的点突变，突变后的p253如序列表中SEQIDNO:1所述。设计引入突变的引物对为：

SEQIDNO:11：5’-CAATCACAGGAGAAGGAGGACGTGGAGGAGGAGGGCTGC-3’；

SEQIDNO:12：5’-GCAGCCCTCCTCCTCCACGTCCTCCTTCTCCTGTGATTG-3’。

以P253的报告基因质粒为模板，扩增全长质粒序列，经DpnI酶清除模板质粒(未发生突变的)、产物转化DH5α；挑取数个克隆，小提质粒，测序验证。成功突变后的p253-HER2/neu组织特异启动子报告基因质粒于DH5α中大量扩增纯化。

分别在常氧(21％O₂)和低氧(2％O₂)环境下，脂质体转染p253-HER2/neu组织特异启动子报告基因质粒和突变后的p253-HER2/neu组织特异启动子报告基因质粒于HER2/neu阳性和阴性肿瘤细胞。细胞接种于96孔板，细胞浓度为1-5×10⁴/孔，标准条件下培养12h后，参照说明书使用lipo2000转染试剂，每孔共转40ng荧光素酶报告基因质粒或对照质粒，10ngpRL-TK-荧光素酶内参质粒。转染24h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光活性。记录Firefly荧光值与内参Renilla荧光值的比值，即为报告基因活性值。

如图3所示，在低氧环境下，在HER2/neu阳性肿瘤细胞中突变后的p253-HER2/neu组织特异启动子诱导荧光素酶的活性显著高于未突变的p253-HER2/neu组织特异启动子，但二者在HER2/neu阴性肿瘤细胞中的启动子活性均较低；在常氧环境下，未突变和突变的p253-HER2/neu组织特异启动子在HER2/neu阳性肿瘤细胞中的启动子活性没有明显差异，说明突变后的p253-HER2/neu组织特异启动子依然保持有HER2/neu组织特异启动子活性，但在低氧环境下比未突变的有更强的启动子活性，因此命名为低氧增强的HER2组织启动子(pH/HER2)，如图3。

实施例5、携带突变后p253启动子元件(pH/HER2)和抑癌基因(Axin或PTEN)的HER2/neu组织特异启动子重组腺病毒载体的构建及表达

1、pHBAd-U6-CMV-Axin或PTEN表达载体的构建

根据人Axin和PTEN的cds序列，设计引物，以人单核来源树突状细胞cDNA为模板，分别扩增Axin和PTEN；扩增片段经限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后，插入到pHBAd-U6-CMV载体(购自汉恒生物科技(上海)有限公司)的多克隆位点中，连接产物转化DH5α，筛选测序正确的克隆，获得pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN表达载体。

Axin引物对：

SEQIDNO:13：5’-AAACGGAATTCATGAATATCCAAGAGCAGGGTTTCC-3’；

SEQIDNO:14：5’-AACGGGGTACCGTCCACCTTCTCCACTTTGCCGATGA-3’；

PTEN引物对：

SEQIDNO:15：5’-AAACGGAATTCATGACAGCCATCATCAAAGAGATC-3’；

SEQIDNO:16：5’-AACGGGGTACCGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTG-3’。

2、pHBAd-H/HER2-Axin/PTEN表达载体的构建

根据pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN表达载体中启动子区上下游酶切位点特征，以前述制备的包含有突变后的p253-HER2/neu的荧光素酶报告基因质粒为模板，设计引物扩增pH/HER2片段，以替换pHBAd-U6-CMV-Axin中的CMV启动子。利用XbaI和MluI作为插入位点，切去pHBAd-U6-CMV-Axin表达载体的CMV启动子，插入pH/HER2启动子，获得pHBAd-H/HER2-Axin表达载体。常规法大量制备并纯化pHBAd-H/HER2-Axin/PTEN重组质粒。

扩增pH/HER2的引物对分别为：

SEQIDNO:17：5’-ACCTTCTAGAAACCCAGGCGTCCCGGCGCTA-3’；

SEQIDNO:18：5’-ATTAACGCGTCCCGGGGGGCTCCCCTGGTTTC-3’；

获得的重组质粒称为pHBAd-H/HER2-Axin/PTEN。

3、重组腺病毒载体的包装

转染前一天，将HEK293细胞接种于60mm培养皿中培养过夜；待细胞生长至底面积的长满到70～80％时，取重组腺病毒载体质粒pHBAd-H/HER2-Axin/PTEN(或pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN)和骨架质粒HBAd-BHG，用LipofiterTM转染试剂(汉恒生物)进行转染。具体步骤为：

a.转染前2小时更换完全培养基。取2ug重组腺病毒载体质粒pHBAd-H/HER2-Axin/PTEN(或pHBAd-U6-CMV-Axin/PTEN)，4ug骨架质粒pHBAd-BHG。用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

b.取15ul的LipofiterTM，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

c.将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养。转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

4、重组腺病毒载体的收毒和扩增

每天观察细胞出毒迹象，出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为AdpH/HER2-Axin/PTEN或AdpCMV-Axin/PTEN过表达第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。从P1代病毒上清(约3ml左右)中取2ml感染一个10cm的细胞培养皿的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，作为毒种保留。

实施例6、在常氧和低氧条件下，AdpCMV-Axin和AdpH/HER2-Axin转染的人HER2/neu阳性或者阴性肿瘤细胞中Axin的表达

分别在常氧(21％O₂)和低氧(2％O₂)环境下，将携带通用启动子的AdpCMV-Axin和携带pH/HER2启动子的AdpH/HER2-Axin分别感染HER2/neu阳性和阴性肿瘤细胞(图4)。细胞接种于24孔板，细胞浓度为1×10⁵/孔，标准条件下培养12h后，按照MOI＝300感染细胞。24h后，使用定量PCR方法检测Axin的表达。

结果显示，与阳性对照(AdpCMV-Axin)比较，在常氧环境下，AdpH/HER2-Axin感染的HER2/neu阳性肿瘤细胞表达Axin的水平与其相当，但在HER2/neu阴性肿瘤细胞中表达水平明显低于阳性对照(CMV启动子)重组腺病毒，说明在HER2/neu阳性肿瘤细胞中AdpH/HER2-Axin能够使肿瘤细胞转录抑癌基因Axin，而在HER2/neu阴性肿瘤细胞中不能使肿瘤细胞转录；在低氧环境下，转染AdpH/HER2-Axin的HER2/neu阳性肿瘤细胞表达Axin水平显著高于AdpCMV-Axin，说明AdpH/HER2-Axin在低氧环境下能够更强地诱导Axin的转录，如图4。

实施例7、在常氧和低氧条件下，AdpCMV-Axin/PTEN和AdpH/HER2-Axin/PTEN诱导表达不同水平人HER2/neu肿瘤细胞的凋亡

将HER2/neu阳性和阴性肿瘤细胞(图5)，按照1×10⁵/ml铺于24孔板，过夜，然后在低氧和常氧环境下，分别用AdCMV-Axin，AdpH/HER2-Axin，AdCMV-PTEN，AdpH/HER2-PTEN转染(MOI＝300)，48小时后，收集肿瘤细胞，PI染色，检测肿瘤细胞的死亡。

结果显示：与相应的阳性对照(AdpCMV-Axin和AdpCMV-PTEN)比较，在常氧环境下，AdpH/HER2-Axin和AdpH/HER2-PTEN诱导HER2/neu阳性肿瘤细胞(如图5A：HCC1419；B：MCF7；C：HCC1954)凋亡的水平与其相当；但在低氧环境下，AdpH/HER2-Axin和AdpH/HER2-PTEN诱导HER2/neu阳性肿瘤细胞凋亡的水平显著的高于AdpCMV-Axin或AdpCMV-PTEN；说明pH/HER2在低氧环境下，诱导目的基因表达的活性更高，具有更显著的凋亡诱导活性。

与阳性对照(AdpCMV-Axin和AdpCMV-PTEN)比较，无论在常氧还是低氧环境下，AdpH/HER2-Axin和AdpH/HER2-PTEN不能诱导HER2/neu阴性肿瘤细胞发生明显的凋亡(如图5D：HCC806；E：SMMC7721；F：SMMC7703)说明在HER2/neu阴性肿瘤细胞中AdpH/HER2-Axin和AdpH/HER2-PTEN不能使肿瘤细胞过表达抑癌蛋白Axin和PTEN，因此不能诱导明显凋亡，因此具有HER2组织特异性。

综上，本发明的启动子具有HER2/neu组织特异性启动子活性，并且在低氧环境下，具有更强的诱导目的基因转录的活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：

(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的多核苷酸；

(2)核苷酸序列在严格条件下能够与SEQIDNO:1杂交且具有指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达功能的多核苷酸；

(3)核苷酸序列与(1)-(2)任一限定的序列互补的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，(2)或(3)所述的多核苷酸中，对应于SEQIDNO:1的第156位位置的核苷酸为C。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1或2所述的核酸，作为启动子元件。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因选自：能够被转录成多肽的RNA分子的目的基因，被转录成反义RNA分子或被转录成针对内源基因的干扰RNA或miRNA的目的基因；较佳地，所述的多肽是对于防止疾病有效的多肽，或是能指示体内存在HER2/neu阳性肿瘤细胞或组织的多肽；

较佳地，所述的目的基因选自：抑癌基因；或可以沉默或者抑制癌基因的反义核酸或干扰RNA、或者miRNA。

6.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的表达载体是病毒载体。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞：

含有权利要求3-5任一所述的载体；或

其基因组中整合有外源的权利要求1-2任一所述的核酸。

8.一种重组病毒，其特征在于，所述的重组病毒由权利要求6所述的载体包装而成。

9.权利要求1-2任一所述的核酸的用途，其特征在于，用于作为启动子元件，指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达；更佳地，在低氧条件下，指导目的基因在HER2/neu阳性细胞或组织中特异性表达。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有有效量的权利要求6所述的载体或由其包装而成的病毒；以及药学上可接受的载体或赋型剂；并且，所述的载体中目的基因为抑癌基因。