CN111004848B - Fbxl6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Fbxl6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，通过一系列体外实验，发现FBXL6基因在促进肿瘤细胞增殖和转移中起着关键作用；通过转基因小鼠体内实验，发现FBXL6基因可以促进小鼠肿瘤的生成，FBXL6单基因在小鼠肿瘤调控中起着关键作用；基于正常细胞与肿瘤细胞之间FBXL6基因表达的差异性，首次发现FBXL6可以作为一种新的抗肿瘤药物靶点，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。

Description

FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤药物靶点研究技术领域，涉及FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是全球致死率最高的疾病之一，严重危害人类的健康和生活。手术切除、放疗、化疗等常规手段较多应用于肿瘤治疗中，但对于中晚期及转移型恶性肿瘤患者这些手段就显示出其局限性。随着肿瘤生物学及其相关学科的发展，越来越多的证据显示，肿瘤是一个逐步的异质性疾病，是一个多病因、多阶段、多基因的长期过程。
近年来，抗肿瘤药物的研发热点已从传统的细胞毒性药物转移到可以特异性针对基因靶点的新一代肿瘤药物。如靶向HER2/neu的人源化单抗Herceptin用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌；如靶向EGFR的Erlotinib用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)等。这类针对正常细胞和肿瘤细胞之间差异的靶点特异性的抗肿瘤药物与传统的细胞毒药物相比具有选择性高，毒性低的治疗效果，可以适当延长患者生存期和改善患者生活质量。
虽然目前有部分靶向药物已在临床研究上取得进展，但由于肿瘤细胞的异质性以及肿瘤微环境的复杂性，绝大部分的抗肿瘤靶向药是无效或者效果甚微。恶性肿瘤治疗仍面临许多障碍，故对恶性肿瘤发生发展机制的深入探索，寻找发现新的、特异性的肿瘤相关基因并以此为靶点依然是肿瘤治疗的研发重点。
已有文献报道F-box蛋白作为肿瘤靶点的应用，F-box蛋白主要通过构成SCF复合物的重要成份而识别底物，其通过识别和降解底物蛋白在细胞周期转换、细胞凋亡、转录调控、细胞信号转导及其他多种生理功能中起重要作用。F-box蛋白参与的蛋白降解过程的失调会导致肿瘤的发生，故可针对F-box蛋白进行癌症药物的设计。
根据C端二级结构的差异，常将F-box蛋白分为FBXL、FBXW和FBXO三个亚家族，C端含有富含亮氨酸重复序列(LRRs)的为FBXL亚族，C端含有WD重复序列的为FBXW亚族，C端是其他二级结构，如锌指结构，亮氨酸拉链等或无明显结构特征的为FBXO亚族。各类不同的F-box蛋白在各种生化反应及信号通路中发挥重要作用，但是对于其具体是如何参与疾病的发生发展尚不明确，仍有待探索。结合现有研究分析，即使同一亚族的不同基因，功能不完全相同，有些基因可以促进肿瘤的发生发展，有些基因可以抑制肿瘤的发生发展，还有部分基因与肿瘤的发生发展无关，因此发现新的、特异性的肿瘤相关基因，有望成为新一代药物开发的靶点。在F-box蛋白质中，FBXW7是一个研究较为成熟的肿瘤抑制因子。FBXW7是一种抑制肿瘤生长的SCF-E3泛素连接酶，通过识别磷酸化底物并促进底物泛素化降解来发挥抑癌作用。已有报道显示，FBXW7泛素化降解促癌底物包括c-Myc、MCL-1、c-Jun、Notch1和cyclin E。其他的已经发现可能具有肿瘤抑制作用有FBXO11和FBXO31，已有研究显示，在肺腺癌中，FBXO11通过与锌指结构DNA结合蛋白Snail相互结合发挥其抑癌作用；在胃癌中，FBXO31能够泛素化降解转录因子Snail1，进而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力，从而发挥抑癌作用。FBXW7、FBXO11、FBXO31这些肿瘤抑制因子，因其在肿瘤组织中低表达，作为抗肿瘤药物的靶点就显示出其局限性。故寻找发现一个肿瘤组织中高表达，且显著促进肿瘤生长的F-box蛋白可能为抗肿瘤药物靶点治疗带来新的曙光。基于目前的局限性，本发明首次发现FBXL6基因在肿瘤细胞中高表达，基于正常细胞与肿瘤细胞之间的表达差异性，首次发现FBXL6可以作为一种新的抗肿瘤药物靶点，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
FBXL6(已知序列源于NBCI：NM_012162.4)作为检测靶标在制备肿瘤预测、检测或预后判断试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒中含有检测FBXL6表达量的试剂，通过对样本中FBXL6表达量进行检测，实现对肿瘤的预测、检测或预后判断。
进一步优选的，所述样本为全血。
进一步优选的，倘若样本中FBXL6表达量高于正常细胞表达值，则预测将发生肿瘤、正患有肿瘤或者肿瘤预后差。
一种用于肿瘤预测、检测或预后判断的试剂盒，其含有检测FBXL6的试剂。
FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。
FBXL6的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤药物，其含有FBXL6的抑制剂。
优选的，所述肿瘤包括：肾上腺皮质癌(ACC)、胰腺癌(PAAD)、肝细胞性肝癌(LIHC)、肾透亮细胞癌(KIRC)、嫌色细胞癌(KICH)、胆癌(CHOL)、结肠癌(COAD)等。
优选的，所述肿瘤为肝癌。
本发明的有益效果在于：
在已有研究中显示，FBXL亚族位于N末端的降解结构域，可以维持SKP2的蛋白稳定性，而SKP2可以调节细胞周期调节子的泛素化降解，SKP2的蛋白水平在多种癌症中呈现高表达状态，包括淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和鼻咽癌，SKP2的表达水平与人肝癌肿瘤的大小相关，因此FBXL亚族中蛋白可能存在潜在靶点。申请人利用TheCancerGenome Atlas(TCGA)数据库分析发现FBXL6基因在多种肿瘤组织中高表达，且与多种肿瘤的不良预后相关，有鉴于此，FBXL6很有可能作为抗肿瘤药物的靶点，通过一系列研究证实我们的新发现FBXL6可以作为一种新的抗肿瘤药物靶点，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。
事实上，FBXL6是一个重要的原癌基因。FBXL6在肿瘤细胞中表达增加，同时可以显著促进肿瘤细胞的增殖和转移，加速肿瘤的进展。研究分析癌组织中FBXL6基因和蛋白表达水平，FBXL6表达水平与癌症患者预后之间存在显著负相关，FBXL6表达水平高的患者，预后都比较差，统计学分析也印证了FBXL6是一个独立的影响患者预后的因素。利用体外实验和转基因小鼠体内实验进一步证明了FBXL6可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移。基于FBXL6在肿瘤细胞中表达的差异性，申请人首次发现FBXL6可以作为一种新的抗肿瘤药物靶点，可以特异性针对FBXL6高表达的肿瘤，筛选出可以用于肿瘤治疗的药物。此外FBXL6作为一个重要的癌基因，因其表达的差异性，在肿瘤预测的方面也可以发挥重要作用。
具体如下：
1、通过一系列体外实验，发现FBXL6基因在促进肿瘤细胞增殖和转移中起着关键作用；
2、通过转基因小鼠体内实验，发现FBXL6基因可以促进小鼠肿瘤的生成，FBXL6单基因在小鼠肿瘤调控中起着关键作用；
3、基于正常细胞与肿瘤细胞之间FBXL6基因表达的差异性，首次发现FBXL6可以作为一种新的抗肿瘤药物靶点，在肿瘤免疫治疗上有着潜在的临床应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1a～图1c为FBXL6与癌症患者不良生存预后的相关性，其中，图1a为FBXL6基因表达水平与7种癌症患者预后的相关性，图1b为FBXL6在肝癌组织中表达情况，图1c为FBXL6蛋白表达水平与肝癌患者预后的相关性。
图2a～图2c为FBXL6促进肿瘤细胞增殖和迁移，其中，图2a为过表达FBXL6促进HepG2细胞的增殖，图2b为过表达FBXL6促进Huh7细胞的增殖，图2c为过表达FBXL6促进Huh7细胞的迁移。
图3a～图3c为FBXL6基因敲入促进C57BL/6小鼠肝癌的生成，其中，图3a为构建含同源序列和FBXL6序列片段的示意图，图3b为Southern blot杂交鉴定小鼠基因型，图3c为FBXL6促进C57BL/6小鼠肝癌的生成。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例：
1.FBXL6与癌症患者不良生存预后相关
1.1 FBXL6基因水平高表达与7种癌症的不良预后相关
本发明利用The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库分析FBXL6基因表达差异与肾上腺皮质癌(ACC)、胰腺癌(PAAD)、肝细胞性肝癌(LIHC)、肾透亮细胞癌(KIRC)、嫌色细胞癌(KICH)、胆癌(CHOL)、结肠癌(COAD)7种癌症患者生存预后的相关性。1508例患者生存分析结果显示，FBXL6基因表达水平与预后有显著相关性(p<0.01)，表达越高，预后越差(图1a)，提示FBXL6可以作为潜在临床预后的指标。
1.2 FBXL6蛋白水平高表达与肝癌的不良预后相关
TCGA数据库提供的是mRNA水平的数据，无法完全代表FBXL6在蛋白水平的表达情况，为研究FBXL6蛋白在肝癌中表达情况与临床预后的相关性，本发明从陆军军医大学第一附属医院，收集了93例有预后信息的肝癌组织和癌旁组织，采用免疫组化的方法[2]对肝癌组织与癌旁组织的FBXL6蛋白进行检测，发现FBXL6主要在细胞质中表达，且在肝癌组织中高表达(图1b)。Kaplan-Meier生存曲线分析表明，与低FBXL6表达的患者相比，高FBXL6表达的患者生存率较低，与肝癌预后有显著相关性，表达越高，预后越差(p＝0.0011，图1c)。
根据FBXL6高低表达分组，分析FBXL6基因与多项临床指标之间的关系，统计结果显示FBXL6表达量与年龄、性别、肿瘤大小、复发和转移无关，而与肿瘤的临床分期和病理分级有关(表1)。通过单变量分析发现，对于总生存率(overall survival,OS)来说，FBXL6的表达水平、临床分期、病理分级、肿瘤大小、复发和转移都是影响预后的因素。通过多变量分析发现，FBXL6的表达水平是一个独立的影响预后的因素(表2)。
表1.FBXL6与肝癌患者临床病理特点间的关系
Figure BDA0002312886210000051
表2.单因素和多因素分析总体生存率与各种危险因素之间的关系
Figure BDA0002312886210000052
Figure BDA0002312886210000061
体外实验的临床结果均提示FBXL6基因在癌组织中高表达，且会导致癌症患者的不良预后，故FBXL6基因很可能因为正常细胞与肿瘤细胞之间的差异表达来作为一个新的抗肿瘤药物的靶点，为肿瘤的治疗带来新的曙光。
2.FBXL6促进肿瘤细胞的增殖和转移
应用几种不同肿瘤细胞系，过表达FBXL6，观察其对细胞增殖、迁移能力的影响。应用肿瘤细胞系包括：人肝癌细胞系Huh7(源于Naka bayashi等人建立，购买于中国科学院上海细胞库)，人肝癌细胞系HepG2(源于
Figure BDA0002312886210000062
HB-8065TM)。
2.1 FBXL6促进肿瘤细胞增殖
肿瘤细胞因其细胞周期失控，就像寄生在细胞内的微生物，不受正常生长调控系统的控制，能持续的分裂与增殖，由于其不断增殖将导致疾病进展迅速。本发明为探索发现FBXL6基因对肿瘤细胞增殖的影响，应用HepG2、Huh7这两株细胞系，转染FBXL6质粒(购买于上海吉凯基因化学技术有限公司)，通过CCK8的方法[1]检测FBXL6基因对肿瘤细胞增殖的影响。研究结果显示，过表达FBXL6可以显著促进肿瘤细胞增殖(图2a和图2b)，说明FBXL6高表达将加速细胞增殖，加速疾病的进展。
2.2 FBXL6促进肿瘤细胞迁移
肿瘤转移是指恶性肿瘤脱离原发灶，到达继发组织或器官后，得以继续增殖生长，形成于原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，是临床上绝大多数肿瘤患者的致死因素。为探索发现FBXL6基因对肿瘤细胞迁移的影响，本发明应用Huh7这株细胞系，转染FBXL6质粒，通过Transwell的方法[2]检测FBXL6基因对肿瘤细胞迁移的影响。研究结果显示，过表达FBXL6可以显著促进肿瘤细胞迁移(图2c)。
体外实验细胞结果均提示，高表达FBXL6基因可以促进肿瘤细胞的生长和转移。进一步印证我们的发明结果，FBXL6是一个重要的原癌基因，显著促进肿瘤细胞的生长和转移，加快疾病的进程，故以FBXL6为靶点，沉默或抑制其表达，对肿瘤细胞的生长和转移都将起到显著的抑制作用。有望可以缓解疾病进程。
3.FBXL6基因敲入促进C57BL/6小鼠肝癌的生成
3.1 FBXL6基因敲入C57BL/6小鼠模型的构建策略
本发明采用Rosa26位点基因敲入的方法构建FBXL6转基因小鼠模型，该方法优点在于插入位点精准而且同时由于Rosa26是安全区域，外源性的基因定点插入不会影响其他基因的表达，同时由于是单拷贝基因插入，因此更容易预测表达量；结合Cre-loxP系统，可使外源基因在特定组织及特定时间稳定表达。
Rosa26位点基因敲入方法的原理：通过CRISPR-cas9基因编辑工具，在ROSA26位点进行编辑切割，产生双链断裂(DSB：Double-strand break)，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接(NHEJ：non homologous DNA end joining)的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。
Rosa26位点基因敲入方法的策略流程：
(1)构建含同源序列和FBXL6序列片段的片段：以小鼠基因组为模板，使用引物5’arm forward primer(F1，如SEQ ID NO.1所示)、3’KI reverse primer(R1，如SEQ ID NO.2所示)、5’KI forward primer(F2，如SEQ ID NO.3所示)、3’arm reverse primer(R2，如SEQID NO.4所示)在DNA聚合酶作用下，产生含有同源序列和FBXL6序列的片段(图3a)。各引物序列如下：F1:5’-AATTCCTGTGTCCTCCAAACTCAG-3’，如SEQ ID NO.1所示；R1:5’-GATGGGGAGAGTGAAGCAGAACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；F2:5’-CTTCAGCGAGAAGGACTTGGAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；R2:5’-TCCAAACTGCATAGCAACATTTAACACAG-3’，如SEQ ID NO.4所示。
(2)显微注射和F1代鼠繁殖：体外转录得到的构建序列与Cas9核酸酶mRNA混合，用TE缓冲液稀释，使用显微注射仪将混合物注射到C57 BL/6小鼠单细胞受精卵的胞质中。胚胎体外培养1-2小时后移植入假孕母鼠的输卵管，代孕鼠伤口缝合后饲养待产。此时Cas9mRNA、sgRNA与基因组靶序列结合并切割双链DNA，以含有目的片段的同源序列为模板修复基因组DNA，最终获得在Rosa26基因内含子中定点插入FBXL6片段的小鼠(注：实验中涉及到Cas9核酸酶mRNA，C57 BL/6小鼠单细胞受精卵以及母鼠均来自赛业生物科技有限公司)。
(3)基因型鉴定：小鼠出生一周后，剪取脚趾或者尾尖消化后提取小鼠DNA。首先以小鼠DNA为模板，通过目标片段上、下游引物PCR扩增条带验证目的片段FBXL6有没有整合到对应的基因组中。PCR结果显示FBXL6基因已经整合到小鼠基因组中。接着应用Southernblot杂交法进行基因组DNA特定序列定位，其操作过程是利用电泳分离经酶消化后的DNA片段，然后在将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记5’探针(正向引物，如SEQ ID NO.5所示；反向引物，如SEQ ID NO.6所示)和3’探针(正向引物，如SEQ ID NO.7所示；反向引物，如SEQ ID NO.8所示)进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量，检测结果显示3、4、5、6、7、8、9和10号小鼠均阳性(图3b)，已成功建立FBXL6基因敲入C57BL/6小鼠模型。各探针序列如下：5’探针正向引物:5’-AAACCAGGGCTTTTGCCCACTAC-3’，如SEQ ID NO.5所示；5’探针反向引物:5’-TTGTGACAACTCTGGTCGCTCGT-3’，如SEQ ID NO.6所示；3’探针正向引物:5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’如SEQ ID NO.7所示；3’探针反向引物:5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3’,如SEQ ID NO.8所示。
3.2 FBXL6基因敲入鼠肝癌模型的建立
FBXL6基因敲入鼠肝癌模型的建立方法如下：Wild type和FBXL6转基因小鼠出生后的第5周给予腹腔注射25mg/kg体重的二乙基亚硝胺(DEN)，在小鼠7周龄给予腹腔注射体积分数为20％四氯化碳(CCl4)油剂溶液(CCl4：橄榄油＝1：4)，每周1次，连续给药14周，在小鼠27周龄时收集标本。
3.3 FBXL6促进C57BL/6小鼠肝癌的生成
在小鼠27周龄时收集标本取材时，通过观察记录小鼠体重、肝脏重量、肿瘤个数、最大肿瘤直径等各项指标，检测FBXL6基因对小鼠肝癌发展的影响。研究结果显示，FBXL6转基因小鼠肿瘤个数显著多于对照小鼠(图3c)，说明FBXL6基因可以显著促进C57BL/6小鼠肝癌的发展。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
参考文献
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序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> FBXL6作为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aattcctgtg tcctccaaac tcag 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatggggaga gtgaagcaga acg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttcagcgag aaggacttgg aac 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccaaactgc atagcaacat ttaacacag 29
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccagggc ttttgcccac tac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtgacaac tctggtcgct cgt 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttctgggcag gcttaaaggc taac 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggagcggga gaaatggata tgaag 25

Claims (3)

1.FBXL6的表达量作为检测靶标在制备肿瘤预后判断试剂盒中的应用；所述肿瘤为肝癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中含有检测FBXL6表达量的试剂，通过对样本中FBXL6表达量进行检测，实现对肿瘤的预后判断。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本为全血。
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