CN105585614A - 用于淀粉样蛋白显像的血管肽及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及淀粉样蛋白的分子标记和在体显像领域。具体而言，本发明涉及一种基于多肽的靶向淀粉样蛋白的方法和载体。该方法和载体用于运送化合物或药物穿过个体的血脑屏障并与脑内淀粉样蛋白相结合。特别的，本发明涉及的载体将与之相连接的成像基团运送穿过血脑屏障，该载体能够与脑中的淀粉样蛋白相互结合，从而达到淀粉样蛋白沉积标记与显像的功能。该载体作为用于检测体内或组织淀粉样蛋白沉积物的显像剂时，使用合适的光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI,CT检测的显像基团对其进行标记。该方法和载体尤其适用于在体无创性诊断包括阿尔茨海默病在内的患有淀粉样蛋白沉积的相关疾病，亦可用于观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果。

Description

用于淀粉样蛋白显像的血管肽及其衍生物

发明领域

本发明涉及一种多肽及其衍生物的新用途，及使用光学成像等方法进行显像和诊断相关疾病的方法。

背景技术

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sDisease，AD)是一种隐匿发病并进行性加重的神经退行性疾病，主要临床表现为认知功能减退、不可逆的记忆缺失、定向力障碍和语言功能障碍等。脑组织尸检证实有大量的由淀粉样蛋白-β(Aβ)肽聚集而形成的老年斑(Senileplaques,SPs)和许多由高度磷酸化的tau蛋白的细丝形成的神经纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)，以及神经元和突触的丢失等，本发明中提到的淀粉样沉积物包括但不限于老年斑。

淀粉样蛋白沉积物构成的老年斑作为AD的标志物之一，也是临床尸检或活检诊断AD的金标准。目前，淀粉样蛋白沉积物的检测方法主要包括活组织检查和尸检材料的组织学分析等。这两种方法都有明显的缺陷：活组织检查有较大的创伤和风险，尸检仅能用于死后诊断等。因此，一种简单有效且非侵入性的在患者脑中检测并定量淀粉样蛋白沉积物的方法将对相关疾病尤其是阿尔茨海默病的诊断和治疗很有用。

由于脑内的淀粉样蛋白沉积物与正常脑组织具有许多相同的物理性质(例如密度和水分含量)，因此这些沉积物在体内难以直接成像。以前试图使用磁共振成像(MRI)和计算机X线断层摄影术(CT)对淀粉样蛋白沉积物直接成像(不使用显像剂)的研究，效果都难以令人满意或者仅在某些有利条件下才能检测到淀粉样蛋白沉积物。

过去一些经典的荧光染料，如刚果红(CongoRed,CR)、硫黄素S(ThioflavinS，ThS)或硫黄素T(ThioflavinT,ThT)等都能在体外高度特异性地结合淀粉样蛋白沉积物(老年斑)。将这些高亲和力的配体改造并使用正电子放射性同位素标记，若这些标记好的配体能顺利进入脑组织，采用正电子发射体层摄影术(PET)技术来对AD患者老年斑进行分布、定量等在体可视化检测，是目前研究的最多的方法。这些PET显像剂提高诊断的准确性，同时也可以为抗Aβ的药物的研究和治疗提供直观的评价，从而为早期诊断打下基础。

检测活体脑内的淀粉样蛋白沉积物的配体必需能顺利穿过血脑屏障(Blood-Brain-Barrier,BBB)。刚果红、硫黄素S和硫黄素T等由于分子较大或带有电荷而难以通过血脑屏障。使用具有相对小的分子大小(与刚果红相比)的配体可以提高脑摄取并增加亲脂性。目前比较有潜力的几个配体，大都是基于刚果红、硫黄素T、硫黄素S)的结构改造，例如[¹¹C]PIB[¹²³I]IBOX(Zhuang,Kungetal.2001.28:887-94.),[¹²³I]IMPY,[¹⁸F]FDDNP,[¹¹C]SB-13，[¹¹C]-BF-227，其中[¹⁸F]FDDNP,[¹¹C]PIB,[¹¹C]SB-13,[¹¹C]-BF-227,[¹¹C]-AV-45都已经用AD患者和年龄匹配的正常老年人利用正电子发射体层摄影术(PET)做了一些临床研究。

在脑疾病新疗法的开发中，血脑屏障(BBB)被认为是潜在使用治疗中枢神经系统(CNS)疾病的药物的主要障碍，成为抗CNS多种疾病的潜在药物使用的主要障碍。作为一般规则，只有小于约500道尔顿的亲脂性分子能够穿过BBB，即从血液至脑中。以上提到的PET显像剂都是基于化学小分子的。为了使其通过BBB，这些小分子必须具有一定的脂溶性，从而通过被动扩散的方式通过BBB。然而亲脂性的提高同时又伴随着非特异性结合的升高。因此，一种摆脱化学小分子结构和被动扩散方式的淀粉样蛋白显像剂显得很有意义和必要。

有研究发现血管肽2做为低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的配体表现出比转铁蛋白(transferrin)等脑靶向基团更强的跨血脑屏障效率。更重要的是，LRP不仅在脑毛细血管内皮细胞上表达，它在淀粉样蛋白沉积中也有表达。现有技术表明血管肽2作为靶向基团能够有效地提高药物对完好BBB的穿越效率并取得良好的治疗效果，比如angiochem公司研发的ANG1005药物。因此标记有血管肽2的显像剂有望通过受体介导作用穿越血脑屏障并对实现对脑内淀粉样蛋白沉积的靶向性标记。

目前尚未见有关同时以血管肽2为BBB跨越基团和淀粉样蛋白沉积靶向基团，标记有成像基团的淀粉样蛋白沉积显像剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新型基于多肽的靶向示踪的淀粉样蛋白沉积诊断影像药物，尤其涉及具有跨越血脑屏障(BBB)能力和结合淀粉样蛋白沉积并标记有显像基团的影像药物，其用于淀粉样蛋白沉积的无创动态示踪，尤其对血脑屏障未受破坏条件下的淀粉样蛋白沉积具有靶向示踪功能。

具体地，本发明涉及以下各项：

1.一种式R-L-M的缀合物，其中R是血管肽2，L是接头或者化学键，M是光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI,CT检测的显像基团。

2.根据1所述的缀合物，其中所述血管肽2的序列为TFFYGGCRGKRNNFKTEEY。

3.根据1所述的缀合物，其中所述光学显像基团为FITC、Cy5.5、荧光蛋白。

4.根据1所述的缀合物，其中所述放射性同位素为⁹⁹mTc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、²²Na、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸²Rb。

5.根据1所述的缀合物，其中所述MRI检测的显像基团为¹⁹F、¹³C、¹⁵N、Mn²⁺、Gd³⁺、Dy³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺元素或者纳米铁、Gd-DTPA、Gd-DOPA、Mn-DPDP、氧化铁颗粒、转铁蛋白、卟啉化合物或金属螯合物。

6.根据1所述的缀合物，其中所述CT检测的显像基团为碘原子，纳米金颗粒。

7.一种药物或显像剂，所述药物或显像剂包含1-6任一项所述的缀合物，或者其药学可接受的盐。

8.一种靶向淀粉样蛋白沉积的方法，其中使用1-6任一项所述的缀合物或血管肽2作为靶向剂。

9.1-6任一项所述的缀合物用于制备显像与诊断淀粉样蛋白相关疾病、监控所述疾病发生发展过程、观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果，淀粉样蛋白疾病动物模型的诊断、病程监测和疗效评估的药物或试剂盒的用途。

10.根据9所述的用途，其中所述淀粉样蛋白相关疾病包括阿尔兹海默病、II型糖尿病、血管淀粉样蛋白沉积、具有淀粉样变的遗传性脑出血。

具体而言，本发明的第一个方面提供一种基于多肽的缀合物，其可以作为靶向示踪淀粉样蛋白沉积的诊断影像药物，其中血管肽2同时作为BBB跨越基团和淀粉样蛋白靶向基团，利用缀合物上的显像基团实现淀粉样蛋白沉积的标记和成像，以诊断或追踪淀粉样蛋白相关疾病如阿尔茨海默病的发病进程。

在一个优选的实施方案中，将药物组合物通过动脉内、鼻内、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、透皮或口服施用于个体。

在一个优选的实施方案中，所述施用包括以下步骤：向患者给予有效量的缀合物和/或包含有药学可接受的载体的混合物。

在一个优选的实施方案中，提供了一种式为R-L-M的缀合物或其药学可接受的盐，其中R是血管肽2，L是接头或化学键，且M是选自合适的光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI,CT检测的显像基团。

在一个优选的实施方案中，所述放射性标记适用于PET(正电子发射体层摄影术)或SPECT(单光子发射计算体层摄影术)检测，所述放射性同位素包括⁹⁹mTc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、²²Na、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸²Rb。

在一个优选的实施方案中，所述适用于MRI检测的显像基团主要包括：¹⁹F、¹³C、¹⁵N、Mn²⁺、Gd³⁺、Dy³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺元素或者纳米铁、Gd-DTPA、Gd-DOPA、Mn-DPDP、氧化铁颗粒、转铁蛋白、卟啉化合物或金属螯合物。

在一个优选的实施方案中，所述适用于CT检测的显像基团主要包括：碘原子，纳米金颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述适用于光学检测的显像基团主要包括：FITC、Cy5.5、荧光蛋白等。

本发明的第二个方面提供一种药物，所述药物包含本发明第一个方面所述的缀合物，或者其药学可接受的盐。

本发明的第三个方面提供一种靶向淀粉样蛋白沉积的方法，其中使用本发明第一个方面所述的缀合物作为靶向剂。

本发明的第四个方面提供本发明第一个方面所述的缀合物用于制备显像与诊断淀粉样蛋白相关疾病、监控所述疾病发生发展过程、观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果的药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述淀粉样蛋白相关疾病包括：阿尔兹海默病、Down氏综合征、II型糖尿病、血管淀粉样蛋白沉积、淀粉样蛋白多发性神经病、淀粉样蛋白心肌病、全身性老年淀粉样蛋白病、具有淀粉样变的遗传性脑出血等。

在一个优选的实施方案中，本发明的缀合物和方法还适用于人工制造的淀粉样蛋白相关疾病模型动物，包括转基因动物，基因敲除、敲出动物，如APP转基因小鼠等。

在一个优选的实施方案中，本发明的载体和载体-药剂缀合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。

在一个优选的实施方案中，当本发明载体-显像基团缀合物与用其他药剂联合使用时，它们可以顺序或同时给予个体。可替代地，如本申请所述，本发明药物缀合物可以由与药学可接收的赋形剂以及另ー种本领域公知的治疗或显像剂结合的本发明载体-显像基团缀合物的组合组成。

将理解，对于任何特定个体的特定“有效量”将取决于多种因素，所述因素包括：使用的特定药剂的活性、个体的年龄、体重、一般健康、性别和/或饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物结合以及经受预防或治疗的特定疾病的严重程度。

药学可接收的酸加成盐可以通过本领域公知的方法制备。

如本文所使用的，“药学可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂(诸如磷酸盐缓冲盐水缓冲剂、水、盐水)、分散介质、包衣剂、抗细菌剂以及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。这类介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域非常公知的。任何的常规介质或药剂在治疗组合物中的使用都被想到，除了其与活性成分不相客。也可将补加的活性成分掺入到组合物中。

术语“衍生物”指的是本发明的载体或载体-显像基团缀合物或它们的盐的“化学衍生物”、“片段”或“变体”生物学活性序列或部分。载体衍生物能够与另ー种化合物或药剂相连接或缀合，并穿过血脑屏障，从而能够将其它的化合物或药剂转运穿过血脑屏障并且结合于淀粉样蛋白沉积。

术语“化学衍生物”指的是本发明的载体或载体-显像基团缀合物，其含有附加的化学部分，该化学部分不是载体或载体-显像基团缀合物的一部分。共价修饰也包括在本发明的范围之内。化学衍生物可以通过直接的化学合成，使用本领域公知的方法方便制备。这类修饰可以是，例如，通过将靶氨基酸残基与能够与经选择的侧链或末端残基发生反应的有机衍生化剂进行反应，导入到蛋白或肽载体或载体-显像基团缀合物中。载体化学衍生物能够穿过血脑屏障并能与另ー种化合物或药剂相连接或缀合，并由此将另ー种化合物或药剂运送穿过血脑屏障同时结合于淀粉样蛋白沉积。

附图说明

图1.血管肽2的ESI-MS图谱，其中多肽序列为TFFYGGSRGKRNNFKTEEY，分子量为2301.52Da

图2.血管肽2的HPLC图谱，其中色谱方法：色谱柱:VenusilMPC18-5HPLCCOLUMN250X4.6mm；流动相A:0.1％TFA水溶液；流动相B:0.1％TFA水溶液；流速:1mL/min；时间:30分钟；在220处探测；洗脱程序:在0.01到25分钟，洗脱程序从85％到60％的B线性变化，最后，用0％的B冲洗柱子至30分钟

图3.血管肽2与FITC形成缀合物的结构图

图4.血管肽2与Cy5.5形成缀合物的结构图

图5.血管肽2与FITC形成缀合物的ESI-MS图谱,分子量为2804.06Da

图6.血管肽2与FITC形成缀合物的HPLC图谱，其中色谱方法：色谱柱:VYDAC-C18HPLCCOLUMN250X4.6mm；流动相A:乙腈溶液；流动相B:0.01M磷酸水溶液；流速:1mL/min；时间:30分钟；在220处探测；洗脱程序:在0.01到25分钟，洗脱程序从85％到40％的B线性变化，最后，用0％的B冲洗柱子至30分钟。

图7.血管肽2与Cy5.5形成缀合物的ESI-MS图谱,分子量为2880.24Da

图8.血管肽2与Cy5.5形成缀合物的HPLC图谱，其中色谱方法：色谱柱:SHIMADZUInertsilODS-SPHPLCCOLUMN250X4.6mm；流动相A:0.1％TFA水溶液；流动相B:0.1％TFA水溶液；流速:1mL/min；时间:40分钟；在214处探测；洗脱程序:在0.01到30分钟，洗脱程序从30％到95％的B线性变化，在30到33分钟，洗脱程序从95％到100％的B线性变化,最后，用0％的B冲洗柱子至40分钟。

图9.血管肽2与FITC形成缀合物标记AD病人脑切片的荧光染色图片

图10.血管肽2与FITC形成缀合物标记APP转基因小鼠脑切片的荧光染色图片

图11.血管肽2与FITC形成缀合物和Aβ1-42相互作用的图谱，显示其与Aβ1-40之间的亲和力

图12.血管肽2与FITC形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微图片

图13.血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后在体近红外成像图片

图14.血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微图片

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

以下实施例中血管肽2购于吉尔生化(上海)有限公司，FITC、ThioflavinS、Aβ1-42购于西格玛奥德里奇(中国)公司，Cy5.5-NHS购于天津希恩思生化科技有限公司。其余常用试剂如无特别说明均购于国药集团化学试剂有限公司。APP小鼠购于南京大学—南京生物医药研究院。AD人脑石蜡组织来自于EthicalCommitteeoftheMedicalFacultyoftheFreeUniversity(VUMC,Amsterdam,TheNetherlands,971019)。

实施例1：血管肽2与FITC形成的缀合物的合成方法：

1用Fmoc-Tyr(tbu)-wangresin，用DMF浸泡30分钟。

2脱帽：用20％六氢吡啶/80DMF脱帽30分钟，然后DMF洗6遍，三倍量的Fmoc-Glu(otbu)-oh、HBTU、NMM，DMF溶液中反应30分钟。

3DMF洗三次，取少许树脂用检测液(茚三酮，苯酚，吡啶每个滴两滴)120°加热3分钟，无色透明即为反应终点结束。

4依次重复2和3，反应Fmoc-Glu(otbu)-oh、Fmoc-Thr(tbu)、Lys(boc)-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Asn(trt)-oh、Fmoc-Asn(trt)-oh、Fmoc-Arg(pbf)-oh、Fmoc-Lys(boc)-oh、Fmoc-Gly-oh、Fmoc-Arg(pbf)-oh、Fmoc-Ser(tbu)-oh、Fmoc-Gly-Gly-oh、Fmoc-Tyr(tbu)-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Thr(tbu)、Fmoc-Acp-oh、5-Fitc。

5最后甲醇，DCM交替洗三次，甲醇再洗两次，抽干，称取树脂重量

6切割取做好的树脂加入切割液(87.5％TFA/2.5％H2O/2.5EDT/2.5苯酚/5％苯甲硫醚)，1g树脂加入切割液10mg，反应2小时。反应结束，过滤，取过滤液加入5倍乙醚析出固体

7最后离心，烘干得到粗品固体。制备型HPLC纯化。

8质谱及分析型HPLC分析样品。其中血管肽2部分的产物质谱与HPLC图谱见附图1，2。最终产物血管肽2与FITC形成的缀合物结构示意图见附图3。血管肽2与FITC形成的缀合物的质谱与HPLC图谱见附图5，6。以上附图说明对于血管肽2以及血管肽2与FITC形成的缀合物合成的结构无误。

实施例2：血管肽2与Cy5.5形成的缀合物的合成方法：

1用Fmoc-Tyr(tbu)-wangresin，用DMF浸泡30分钟。

2脱帽：用20％六氢吡啶/80DMF脱帽30分钟，然后DMF洗6遍，三倍量的Fmoc-Glu(Otbu)-OH、HBTU、NMM，DMF溶液中反应30分钟。

3DMF洗三次，取少许树脂用检测液(茚三酮，苯酚，吡啶每个滴两滴)120°加热3分钟，无色透明即为反应终点结束。

4依次重复2和3，反应Fmoc-Glu(otbu)-oh、Fmoc-Thr(tbu)、Lys(boc)-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Asn(trt)-oh、Fmoc-Asn(trt)-oh、Fmoc-Arg(pbf)-oh、Fmoc-Lys(boc)-oh、Fmoc-Gly-oh、Fmoc-Arg(pbf)-oh、Fmoc-Ser(tbu)-oh、Fmoc-Gly-Gly-oh、Fmoc-Tyr(tbu)-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Phe-oh、Fmoc-Thr(tbu)、Fmoc-Acp-oh、Cy5.5-NHS。

5最后甲醇，DCM交替洗三次，甲醇再洗两次，抽干，称取树脂重量

6切割取做好的树脂加入切割液(87.5％TFA/2.5％H2O/2.5EDT/2.5苯酚/5％苯甲硫醚)，1g树脂加入切割液10mg，反应2小时。反应结束，过滤，取过滤液加入5倍乙醚析出固体

7最后离心，烘干得到粗品固体。制备型HPLC纯化。

8质谱及分析型HPLC分析样品。其中最终产物血管肽2与Cy5.5形成的缀合物结构示意图见附图4。血管肽2与FITC形成的缀合物的质谱与HPLC图谱见附图7，8。

以上附图说明对于血管肽2以及血管肽2与Cy5.5形成的缀合物合成得到的结构无误。

实施例3：血管肽2与FITC形成的缀合物标记AD病人脑切片的荧光染色方法

使用连续的AD人脑石蜡切片进行对比染色，步骤如下：

1.脱蜡至水：二甲苯Ⅰ,10分钟；二甲苯Ⅱ,10分钟；100％乙醇Ⅰ，10分钟；100％乙醇Ⅱ,10分钟；95％乙醇5分钟,90％乙醇5分钟,80％乙醇5分钟,70％乙醇5分钟,超纯水漂洗5秒，PBS(Ph7.4)5分钟2次。

2.高锰酸钾(0.25％，PBS配制)溶液处理20分钟(待切片出现棕色)，PBS2分钟3次；偏重亚硫酸钾(1.0％，PBS配制)和草酸(1.0％，PBS配制)的混合溶液处理切片直到棕色褪去(大致1-6分钟，待切片的棕色褪去再处理30秒即可)，PBS2分钟3次。

3.组化笔画圈，将血管肽2与FITC形成的缀合物对应的切片和ThioflavinS对应的切片分别进行染色，步骤分别如下：

血管肽2与FITC形成缀合物的染色：(上接第3步)

4.血管肽2与FITC形成缀合物的溶液(0.1mM)300ul滴染，37度湿盒中1h。

5.PBS洗10分钟2次。

6.70％甘油封片，4℃保存。

ThioflavinS染色的步骤：(上接第3步)

7.ThioflavinS(0.5g％溶解于PBS中),染色20分钟(滴染)。

8.70％乙醇分化10分钟,PBS5分钟。

9.80％甘油封片。

结果如图9所示，A图为血管肽2与FITC形成的缀合物染色图，B图为正对照ThioflavinS染色图。白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明血管肽2与FITC形成的缀合物能够与AD病人脑切片中的淀粉样蛋白沉积相结合。

实施例4：血管肽2与FITC形成的缀合物标记APP转基因小鼠脑切片的荧光染色方法

使用连续的APP转基因小鼠脑切片进行对比染色，步骤如下：

1.PBS(Ph7.4)洗5分钟2次。

2.高锰酸钾(0.25％，PBS配制)溶液处理20分钟(待切片出现棕色)，PBS2分钟3次；偏重亚硫酸钾(1.0％，PBS配制)和草酸(1.0％，PBS配制)的混合溶液处理切片直到棕色褪去(大致1-6分钟，待切片的棕色褪去再处理30秒即可)，PBS2分钟3次。

3.组化笔画圈，将血管肽2与FITC形成缀合物对应的切片和ThioflavinS对应的切片分别进行染色，步骤分别如下：

血管肽2与FITC形成缀合物的染色：(上接第3步)

4.血管肽2与FITC形成缀合物的溶液(0.1mM)300ul滴染，37℃湿盒中1h。

5.PBS洗10分钟2次。

6.70％甘油封片，4℃保存。

ThioflavinS染色的步骤：(上接第3步)

7.ThioflavinS(0.5g％溶解于PBS中),染色20分钟(滴染)。

8.70％乙醇分化10分钟,PBS5分钟。

9.80％甘油封片。

结果如图10所示，A图为血管肽2与FITC形成的缀合物染色图，B图为正对照ThioflavinS染色图。白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明血管肽2与FITC形成的缀合物能够与APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积相结合。

实施例5：血管肽2与FITC形成缀合物和Aβ1-42相互作用的实验方法

1.取Aβ1-42固体，溶解于PBS(PH7.4)中，浓度为0.25mg/ml，即55.38uM。37℃水浴摇床孵育42小时。

2.配制溶液(含10％DMF)，分别含有血管肽2与FITC形成的缀合物(10uM)以及Aβ1-42聚集物(0，5，10uM)或者BSA(45ug/mL),将混合溶液置于37℃孵育30分钟。

3.配置溶液(含10％DMF)，分别含有血管肽2与FITC形成的缀合物(0-3.75uM)以及Aβ1-42聚集物(2.2uM)或者BSA(10uM),将混合溶液置于37℃孵育30分钟。

4.将上步中的各种混合溶液分别用荧光分光光度计检测其发射光谱，发射波长为333nm，最大发射波长为531nm，范围500-600nm。

5.用GraphPadPrism5.0(GraphPadSoftware,Inc.,LaJolla,CA,USA)绘制曲线，计算其平衡解离常数。

结果如图11所示，血管肽2与FITC形成的缀合物与Aβ1-42呈饱和曲线式相互作用，经计算其平衡解离常数为676.3nM。说明其能够与Aβ1-42相互作用并呈饱和曲线式结合方式。

实施例6：血管肽2与FITC形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微观察实验方法

APP转基因小鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg)的麻醉剂麻醉，尾静脉注射血管肽2与FITC形成缀合物23mg/kg。30分钟后，小鼠被处死，大脑被小心地剥离出来用液氮冷冻。而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则分别取出进行荧光扫描(caliperlifesciences公司的活体光学成像系统，IVISimagingsystem)。其大脑用冰冻组织切片机(LeciaCM1950)切成约厚25m的切片，置于荧光显微镜(IX8，OLYMPUS)观察拍照。

结果如图12所示，图中白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明了血管肽2与FITC形成的缀合物能够与在体结合并标记APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积。

实施例7：血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后在体近红外成像实验方法

光学在体显像研究在caliperlifesciences公司的活体光学成像系统(IVISimagingsystem)上进行，设置感光滤光片为Cy5.5，而发射谱带通滤色片为640nm。成像前,小鼠用异氟烷与氧气混合气体麻醉，并且脸朝下放置在成像板上。白光摄影(曝光时间0.2秒)和近红外荧光显像(曝光时间5秒)分别在一样的大小的视野(FOV)下摄取(FOV＝12.5cm,f/stop＝1,Bin＝1),时间点包括注射前和静脉注射药物后的几个选定的时间点，每只小鼠注射量为13mg/kg。白光成像和近红外荧光成像叠加起来确定位于颅内部分的大小。最后，成像图像使用livingimagesoftware(caliperlifesciences)处理。

结果如图13所示，显示血管肽2与Cy5.5形成缀合物在APP小鼠脑中聚集并于20小时后清除。该图说明了血管肽2与FITC形成的缀合物能够穿过血脑屏障并在体聚集于APP转基因小鼠脑中。

实施例8：血管肽2与Cy5.5形成缀合物给予APP转基因小鼠静脉注射后脑切片的荧光显微观察实验方法

静脉给药(13mg/kg)30分钟后，小鼠被处死，大脑被小心地剥离出来用液氮冷冻。而主要的脏器包括心、肝、脾、肺、肾和肌肉则分别取出进行荧光扫描。其大脑用冰冻组织切片机(CM1950，Lecia)切成约厚25m的切片，置于荧光显微镜(IX8，OLYMPUS)观察拍照。

结果如图14所示，图中白色箭头所示为淀粉样蛋白沉积。该图说明了血管肽2与Cy5.5形成的缀合物能够与在体结合并标记APP转基因小鼠脑切片中的淀粉样蛋白沉积。

Claims (10)

1.一种式R-L-M的缀合物，其中R是血管肽2，L是接头或者化学键，M是光学显像基团、放射性同位素或者适用于MRI,CT检测的显像基团。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述血管肽2的序列为TFFYGGCRGKRNNFKTEEY。

3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述光学显像基团为FITC、Cy5.5、荧光蛋白。

4.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述放射性同位素为⁹⁹mTc、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、²²Na、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁷⁶Br、⁸²Rb。

5.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述MRI检测的显像基团为¹⁹F、¹³C、¹⁵N、Mn²⁺、Gd³⁺、Dy³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺元素或者纳米铁、Gd-DTPA、Gd-DOPA、Mn-DPDP、氧化铁颗粒、转铁蛋白、卟啉化合物或金属螯合物。

6.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述CT检测的显像基团为碘原子，纳米金颗粒。

7.一种药物或显像剂，所述药物或显像剂包含权利要求1-6任一项所述的缀合物，或者其药学可接受的盐。

8.一种靶向淀粉样蛋白沉积的方法，其中使用权利要求1-6任一项所述的缀合物或血管肽2作为靶向剂。

9.权利要求1-6任一项所述的缀合物用于制备显像与诊断淀粉样蛋白相关疾病、监控所述疾病发生发展过程、观测靶向于淀粉样蛋白沉积的药物治疗效果，淀粉样蛋白疾病动物模型的诊断、病程监测和疗效评估的药物或试剂盒的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述淀粉样蛋白相关疾病包括阿尔兹海默病、II型糖尿病、血管淀粉样蛋白沉积、具有淀粉样变的遗传性脑出血。