CN105572063B - 一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法 - Google Patents

一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)将随机ssDNA序列与含有水胺硫磷的样品混匀孵育，制备出待测样液；(2)将待检测样液与Hemin混匀孵育，之后加入极性有机溶剂混匀，通过测定混合溶液在B带处的吸光值变化来判断水胺硫磷的含量。

Description

一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法
技术领域
本发明涉及一种水胺硫磷的检测方法，特别涉及一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法。
背景技术
水胺硫磷作为有机磷农药的一种，对蛛形纲中的螨类，昆虫纲中的鳞翅目、同翅目昆虫具有较好的防治作用。但有机磷农药属于神经毒剂，可以经皮肤、食道，呼吸道进入人体，抑制体内的胆碱酯酶而引起神经生理紊乱甚至造成死亡。研究表明，长期接触有机磷农药易对身体造成多个部位的损伤，从而引发各种疾病，如癌症，老年痴呆，帕金森氏综合症和糖尿病等。因此，研究一种超灵敏快速检测水胺硫磷显然十分重要。
目前有机磷农药的检测方法主要有波谱法，薄层色谱法(TLC)，仪器检测法，仪器检测法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)以及常与色谱法联用的如GC-MS、GC-MS/MS、液相色谱-串联色谱(LC-MS/MS)。但波谱法一次只能测定一种或带相同基团的一类有机磷农药，灵敏度不高，且实验干扰因素多，易出现假阴性。薄层色谱法准确度和可重复性较低。仪器检测法设备昂贵，不方便携带且对样品的前处理比较繁琐，分析时间也较长。为了尽量解决这一问题，产生了一些快速检测技术，主要包括酶抑制法，免疫法和生物传感器法。酶抑制法缺陷在于酶结构复杂多样，同一批次的酶对不同的农药的灵敏度有较大差异且不同批次的同种酶对同种农药也会出现检测差异性，易出现假阳性或假阴性。免疫法主要包括酶联免疫吸附法、胶体金免疫吸附法、荧光免疫分析法，免疫法的缺陷在于易产生假阳性。生物传感器法主要包括酶生物传感器、免疫生物传感器，生物传感器法缺陷在于寿命短，稳定性较差。近年来也产生了一些其他检测方法，如噬菌体展示技术，分子印迹技术。噬菌体展示技术缺陷在于噬菌体展示系统依赖细胞内基因表达，一些对细胞有毒性的分子很难得到表达，所以需要开发更加可靠和便捷的有机磷农药检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种简单超灵敏快速检测水胺硫磷方法，以解决现有技术的不足。
本发明的技术方案是：一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，包含以下步骤：(1) 将随机ssDNA序列与含有水胺硫磷的样品混匀孵育，制备出待测样液；(2) 将待检测样液与Hemin混匀孵育，之后加入极性有机溶剂混匀，通过测定混合溶液在B带处的吸光值变化来判断水胺硫磷的含量。
上述步骤(1)中，随机ssDNA序列的使用浓度为7.5 nM。
所述步骤(2)中，Hemin的使用浓度为10 μM，加入的极性有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇或乙腈。
一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，
(1) 制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取14支1.5 mL刻度离心管，分别加入7.5μL浓度为500 nM随机ssDNA序列母液和不同浓度的水胺硫磷标准液，总体积≤10μL，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入5 μL浓度为1 mM的Hemin母液继续孵育30min；最后再加入极性有机溶剂至500 μL，充分混匀后留作以下测定用；
(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；
(3) 分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：在DMSO体系中吸收峰值测定波长为404nm，在甲醇体系中吸收峰值测定波长为397nm，在乙醇体系中吸收峰值测定波长为398nm，在乙腈体系中吸收峰值测定波长为398 nm；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的ΔA作图，绘制标准曲线，ΔA=空白样品的吸光值-待测样品的吸光值；
(5) 制备样品检测体系：取5μL实际样液，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸收峰值；
(6) 根据样品在不同有机溶剂中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。
本发明的有益效果：本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测灵敏度高、选择性好，且操作简单快速，借助手持型比色计就可以实现水胺硫磷残留现场检测，因而可以广泛应用于农产品等中有机磷农药残留的快速检测。
附图说明
图1为DMSO体系下验证检测水胺硫磷的可行性；
图2为水胺硫磷在ssDNA辅助下导致Hemin聚集；
图3为不同极性溶剂体系对检测水胺硫磷的影响；
图4为DMSO体系下加入不同浓度水胺硫磷后的吸收光谱；
图5为DMSO体系下不同浓度水胺硫磷与吸光值变化(ΔA)对应关系；
图6为其它有机磷农药对检测水胺硫磷的影响；
图7为DMSO体系下应用于实际样品中水胺硫磷的检测。
具体实施方式
实施方式一：
(1) 在DMSO体系制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取14支1.5mL刻度离心管，分别加入7.5μL浓度为500nM随机ssDNA序列母液和不同浓度的水胺硫磷标准液(总体积≤10μL)，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在0.2-500ppb，随机ssDNA序列组成为：5’-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACG C-3’(55-mer)。上述溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入5μL浓度为1mM的Hemin母液继续孵育30min；最后再加入极性有机溶剂至500μL，充分混匀后留作以下测定用；
(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；
(3) 分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：吸光度测定波长为404 nm，吸光值变化用ΔA (404 nm)表示；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的ΔA (404 nm)作图，绘制标准曲线，得到线性范围0.5~40ppb，其对应的回归方程为y = 6.92×10-3C+0.021，其中C指水胺硫磷浓度(ppb)；
(5) 制备样品检测体系：取5μL不同地点取的待测废水(分别命名为废水-1和废水-2)样本，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸光度变化；
(6) 根据样品测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得样品中水胺硫磷含量；
(7) 实际样本检测效果验证：用本发明方法测定2份同地点取得的废水-1和废水-2，分别往样品中加入40ppb和100ppb的水胺硫磷，得到的回收率为97%-101%，证明本方法可靠性；
(8) 本发明方法可以测定浓度范围为0.5-500ppb的水胺硫磷，其最低检测限为0.22ppb。
实施方式二：
(1) 在甲醇体系制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取14支1.5 mL刻度离心管，分别加入7.5μL浓度为500nM随机ssDNA序列母液和不同浓度的水胺硫磷标准液(总体积≤10μL)，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在0.2-500 ppb；随机ssDNA序列组成为：5’-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’ (55-mer)；上述溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入5μL浓度为1mM的Hemin母液继续孵育30min；最后再加入极性有机溶剂至500μL，充分混匀后留作以下测定用；
(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；
(3) 分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：吸光度测定波长为397nm，吸光值变化用ΔA (397 nm)表示；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的ΔA (397 nm)作图，绘制标准曲线，得到线性范围0.2~40ppb，其对应的回归方程为y=6.22×10-3 C+0.021，其中C指水胺硫磷浓度(ppb)；
(5) 本发明方法可以测定浓度范围为0.2-400ppb的水胺硫磷，其最低检测限为0.25ppb。
实施方式三：
(1) 在DMSO体系制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取14支1.5mL刻度离心管，分别加入7.5μL浓度为500nM随机ssDNA序列母液和不同浓度的水胺硫磷标准液(总体积≤10μL)，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在0.2-500ppb；随机ssDNA序列组成为：5’-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT-3’(35-mer)；上述溶液充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入10μL浓度为0.5mM的Hemin母液继续孵育30min；最后再加入极性有机溶剂至500 μL，充分混匀后留作以下测定用；
(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；
(3) 分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：吸光度测定波长为404 nm，吸光值变化用ΔA (404 nm)表示；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的ΔA (404 nm)作图，绘制标准曲线，得到线性范围1~40 ppb，其对应的回归方程为y = 6.7×10-3 C+0.017，其中C指水胺硫磷浓度(ppb)；
(5) 本发明方法可以测定浓度范围为1-400 ppb的水胺硫磷，其最低检测限为0.23ppb。

Claims (4)

1.一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，其特征在于：包含以下步骤：(1) 将随机ssDNA序列与含有水胺硫磷的样品混匀孵育，制备出待测样液；(2) 将待检测样液与氯化血红素混匀孵育，之后加入极性有机溶剂混匀，通过测定混合溶液在B带处的吸光值变化来判断水胺硫磷的含量；加入的极性有机溶剂为二甲基亚砜、甲醇、乙醇或乙腈；用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：在二甲基亚砜体系中吸收峰值测定波长为404nm，在甲醇体系中吸收峰值测定波长为397nm，在乙醇体系中吸收峰值测定波长为398nm，在乙腈体系中吸收峰值测定波长为398 nm；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；根据样品在不同有机溶剂中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，其特征在于：上述步骤(1)中，随机ssDNA序列的使用浓度为7.5 nM。
3.根据权利要求1所述的一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，氯化血红素的使用浓度为10 μM。
4.根据权利要求1所述的一种基于氯化血红素可控聚集的水胺硫磷便捷检测方法，其特征在于：
(1) 制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取14支1.5 mL刻度离心管，分别加入7.5 μL浓度为500 nM随机ssDNA序列母液和不同浓度的水胺硫磷标准液，总体积≤10μL，充分混匀后置于30℃条件下孵育30min，之后加入5 μL浓度为1 mM的氯化血红素母液继续孵育30min；最后再加入极性有机溶剂至500 μL，充分混匀后留作以下测定用；
(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；
(3) 分别取200μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪计进行扫描测定B带吸收峰；具体的扫描条件为：在二甲基亚砜体系中吸收峰值测定波长为404nm，在甲醇体系中吸收峰值测定波长为397nm，在乙醇体系中吸收峰值测定波长为398nm，在乙腈体系中吸收峰值测定波长为398 nm；全波长扫描范围为300-800nm，获得其吸收光谱；
(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的ΔA作图，绘制标准曲线，ΔA=空白样品的吸光值-待测样品的吸光值；
(5) 制备样品检测体系：取5μL实际样液，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸收峰值；
(6) 根据样品在不同有机溶剂中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。
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