CN105567870A - 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法 - Google Patents

一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105567870A
CN105567870A CN201510869808.8A CN201510869808A CN105567870A CN 105567870 A CN105567870 A CN 105567870A CN 201510869808 A CN201510869808 A CN 201510869808A CN 105567870 A CN105567870 A CN 105567870A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nipah virus
vitro
virus detection
probe
nipah
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510869808.8A
Other languages
English (en)
Inventor
吕沁风
黄建可
蔡玉峰
吴忠华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER
Original Assignee
ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER filed Critical ZHEJIANG INTERNATIONAL TRAVEL HEALTHCARE CENTER
Priority to CN201510869808.8A priority Critical patent/CN105567870A/zh
Publication of CN105567870A publication Critical patent/CN105567870A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种适用体外检测尼帕病毒的试剂，包括特异性引物和探针，引物和探针序列如下：正向引物NIF：5’-GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3’<b>，</b>反向引物NIR：5’-CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3’，探针NIP：5’FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3’？。本发明还提供了运用上述试剂的体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。本发明建立的尼帕病毒荧光PCR检测方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需1小时左右即可完成，填补了国内检测尼帕病毒的空白。

Description

一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法
技术领域
本发明涉及一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法。
技术背景
尼帕病毒是一种新出现的人畜共患病毒（一种可由动物传播给人类的病毒）。尼帕病毒给感染者造成严重疾病，特征为脑部炎症（脑炎）或呼吸系统疾病。该病毒还可在猪等动物身上引起严重疾病，给养殖者造成重大经济损失。尼帕病毒属于RNA病毒，属亨德拉尼帕病毒属，这是副粘病毒科的一种新病毒类别。狐蝠科的果蝠是尼帕病毒的天然宿主。感染尼帕病毒的果蝠身上没有明显疾病，一旦感染人类，病死率极高，生物危害性极大，目前没有疫苗或者特效药物用于治疗尼帕病毒感染。
荧光PCR检测方法操作简便、检测时间短、结果判读不需要通过电泳、具有良好的特异性和灵敏度。目前荧光PCR检测方法是分子生物学检测领域中应用最广泛的检测方法。
尼帕病毒目前我国尚未传入，建立尼帕病毒荧光PCR检测方法对防控尼帕病毒具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用体外检测尼帕病毒的试剂，可以用于快速准确地检测尼帕病毒。为此，本发明采用以下技术方案：
所述试剂包括特异性引物和探针，包括根据选择尼帕病毒的G基因的保守序列，设计一对特异的引物及一条探针，引物和探针序列如下：
正向引物NIF：5’-GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3’
反向引物NIR：5’-CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3’
探针NIP：5’FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3’。
探针的5′和3′端分别用FAM（羧基荧光素）和TAMRA（羧基四甲基罗丹明）标记。
本发明第二个目的是提供运用上述试剂的体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。为此，本发明采用以下技术方案：
所述方法的反应体系为：
10×Buffer2.5μL，2.5mMdNTP1mL，Taq酶1μL，AMV酶0.5μL，25mMMg2SO41μL，10mM正向引物NIF和10mM反向引物NIR分别1μL，10mM探针NIP0.5μL，模板1μL，加入灭菌双蒸水补足25μL；
所述方法包括以下步骤：
取阴性对照、阳性对照和待测样本各1μL分别置于所述反应体系中进行反应，混匀，置于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水；95℃3min预变性后，95℃15s→60℃20s，40个循环；结果判断采用以下方式：
在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35者含有尼帕病毒，结果为阳性；未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结果为阴性；如Ct值大于35，且出现扩增曲线，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反应，并按上述方式判断。
本发明所提供的检测尼帕病毒试剂，其引物探针采用本发明所提供的体外荧光PCR检测方法中的方案，利用上述方案建立的尼帕病毒荧光PCR检测方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需1小时左右即可完成，填补了国内检测尼帕病毒的空白。
附图说明
图1为本发明尼帕病毒灵敏度试验实时荧光扩增曲线图。
1：2.932×109copies/μL,2：2.932×108copies/μL，3：2.932×107copies/μL，4：2.932×106copies/μL,5：2.932×105copies/μL，6：2.932×104copies/μL，7：2.932×103copies/μL,8：2.932×102copies/μL，9：2.932×101copies/μL，10：2.932×100copies/μL。
图2尼帕病毒荧光定量PCR标准曲线图。
具体实施方式
实施例1尼帕病毒的检测
1.仪器和材料
7500荧光定量PCR仪和全自动核酸提取仪购自Life公司。引物、探针和质粒由北京中美泰和生物技术有限公司合成，10×Buffer、2.5mMdNTP、Taq酶、AMV酶购自北京美莱博医学有限公司，1836核酸提取试剂盒购自Life公司。
引物和探针设计
根据genbank数据库中的48株尼帕病毒序列，选择尼帕病毒的主要致病性蛋白——G蛋白基因的保守序列做为目的基因，设计一对特异的引物（NIF和NIR）及一条探针(NIP)，引物和探针序列如下：
正向引物NIF：5’-GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3’
反向引物NIR：5’-CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3’
探针NIP：5’FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3’。
目的基因的构建
由于尼帕病毒未传入国内，采用人工合成目的片段的方法构建目的基因，尼帕病毒G蛋白基因保守序列为目的片段，长度为254bp，插入质粒中，质粒全长为3119bp，转入大肠杆菌培养，序列由北京中美泰和生物技术有限公司合成，序列如下：
TTTGCATATAGCCACCTGGAAAGAATCGGATCATGTTCAAGAGGGGTCTCCAAACAAAGAATAATAGGAGTTGGAGAGGTACTAGACAGAGGTGATGAAGTTCCTTCTTTATTTATGACCAATGTCTGGACCCCACCAAATCCAAACACCGTTTACCACTGTAGTGCTGTATACAACAATGAATTCTATTATGTACTTTGTGCAGTGTCAACTGTTGGAGACCCTATTCTGAATAGCACCTACTGGTCCGGATC
4.扩增的反应体系与反应条件
所述方法的反应体系为：10×Buffer2.5μL，dNTP（2.5mM）1mL，Taq酶1μL，AMV酶0.5μL，25mMMg2SO41μL，正向引物NIF和反向引物NIR（10mM）分别1μL，探针NIP（10mM）0.5μL，模板1μL，加入灭菌双蒸水补足25μL；混匀，置于荧光定量PCR仪中。95℃3min预变性后，95℃15s→60℃20s（荧光检测），40个循环。
灵敏度试验
提取的质粒浓度为100ng/μL，根据公式：6.02×1023×(质粒浓度ng/μL×10-9)/(DNA片段长度×660)=copies/μL计算出质粒的拷贝数原始值为2.932×1010copies/μL。10倍倍比稀释至2.932×100copies/μL，按照上述扩增反应体系和反应条件在荧光定量PCR仪上进行试验，记录实时荧光曲线，见图1。由此可见灵敏度在2.932×101copies/μL左右，具有较高的灵敏度。绘制标准曲线，Y=-0.2987X+12.21，r2=0.999，可作为定量检测参考依据。
特异性试验
提取乙脑病毒疫苗、黄热病毒疫苗、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、登革1型病毒等与尼帕病毒有类似症状的病毒核酸，采用上述反应体系及反应条件进行试验，采用荧光定量PCR仪进行观察结果，具体结果见表1。除含尼帕病毒目的基因片段的质粒外，其他病毒检测结果均为阴性。
表1尼帕病毒荧光PCR检测法特异性试验结果
7.样本检测
提取22份健康体检者血清核酸，采用上述尼帕病毒荧光PCR反应体系及反应条件进行检测，结果除阳性对照外，其余均为阴性。表明该方法在阴性样本的检测中准确可靠。
<110>浙江国际旅行卫生保健中心
<120>一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcaagagagtaatgttcaggctagag26
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ctgttctataggttcttccccttcat26
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgcaggaggtgtgctcattggaggtamra29
<210>4
<211>254
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tttgcatatagccacctggaaagaatcggatcatgttcaagaggggtctccaaacaaaga60
ataataggagttggagaggtactagacagaggtgatgaagttccttctttatttatgacc120
aatgtctggaccccaccaaatccaaacaccgtttaccactgtagtgctgtatacaacaat180
gaattctattatgtactttgtgcagtgtcaactgttggagaccctattctgaatagcacc240
tactggtccggatc254

Claims (2)

1.一种体外检测尼帕病毒的试剂，其特征在于所述试剂包括特异性引物和探针，其序列如下：
正向引物NIF：5’-GCAAGAGAGTAATGTTCAGGCTAGAG-3’
反向引物NIR：5’-CTGTTCTATAGGTTCTTCCCCTTCAT-3’
探针NIP：5’FAM-TGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-TAMRA3’。
2.一种体外荧光PCR检测尼帕病毒的方法，其特征在于，
所述方法的反应体系为：
10×Buffer2.5μL，2.5mMdNTP1mL，Taq酶1μL，AMV酶0.5μL，25mMMg2SO41μL，10mM正向引物NIF和10mM反向引物NIR分别1μL，10mM探针NIP0.5μL，模板1μL，加入灭菌双蒸水补足25μL；
所述方法包括以下步骤：
取阴性对照、阳性对照和待测样本各1μL分别置于所述反应体系中进行反应，混匀，置于荧光定量PCR仪中，其中阴性对照采用灭菌双蒸水；95℃3min预变性后，95℃15s→60℃20s，40个循环；结果判断采用以下方式：
在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现扩增曲线，且循环阈值Ct小于或者等于35者含有尼帕病毒，结果为阳性；未出现扩增曲线者，则为没有尼帕病毒，或Ct值大于35者，结果为阴性；如Ct值大于35，且出现扩增曲线，浓缩待测样本后再按照上述反应体系进行反应，并按上述方式判断。
CN201510869808.8A 2015-12-02 2015-12-02 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法 Pending CN105567870A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510869808.8A CN105567870A (zh) 2015-12-02 2015-12-02 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510869808.8A CN105567870A (zh) 2015-12-02 2015-12-02 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105567870A true CN105567870A (zh) 2016-05-11

Family

ID=55878486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510869808.8A Pending CN105567870A (zh) 2015-12-02 2015-12-02 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105567870A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2816271C1 (ru) * 2023-06-13 2024-03-28 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ выявления вируса Nipah методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1840701A (zh) * 2006-01-06 2006-10-04 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 尼帕病毒的荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法和应用
CN1882704A (zh) * 2003-09-22 2006-12-20 巴斯德研究院 尼帕病毒检测方法和提供抗汉尼巴病毒的免疫保护的方法
CN102559935A (zh) * 2012-02-23 2012-07-11 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种基于m基因的尼帕病毒荧光rt-pcr检测方法
CN104745578A (zh) * 2015-04-21 2015-07-01 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1882704A (zh) * 2003-09-22 2006-12-20 巴斯德研究院 尼帕病毒检测方法和提供抗汉尼巴病毒的免疫保护的方法
CN1840701A (zh) * 2006-01-06 2006-10-04 云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 尼帕病毒的荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法和应用
CN102559935A (zh) * 2012-02-23 2012-07-11 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种基于m基因的尼帕病毒荧光rt-pcr检测方法
CN104745578A (zh) * 2015-04-21 2015-07-01 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 尼帕病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒二重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUILLAUME V ET AL.: "Nipah virus: vaccination and passive protection studies in a hamster model", 《J VIROL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2816271C1 (ru) * 2023-06-13 2024-03-28 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Способ выявления вируса Nipah методом, основанным на применении дезоксирибозима 10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102146466B (zh) 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法
CN103710433B (zh) 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒
CN103757139B (zh) 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN101633964B (zh) 一种甲型h1n1流感病毒rna检测试剂盒
CN105695634A (zh) 检测非洲猪瘟病毒的pcr引物、试剂盒及其应用
CN103966358A (zh) 一种鳜传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
CN103045755A (zh) 一种检测埃博拉病毒的荧光定量pcr检测方法及其引物和试剂盒
CN101240351B (zh) 淋巴囊肿病毒的实时定量pcr检测方法
CN110964857A (zh) 排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用
CN1840703A (zh) 动物水泡性疾病多重rt－pcr鉴别检测试剂及制备方法和应用
CN102534051B (zh) 一种肠道病毒检测试剂盒
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
CN103045754A (zh) 一步法检测z/s亚型埃博拉病毒的实时荧光定量rt-pcr方法及其试剂盒
CN102206713B (zh) 三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及用途
CN103352088B (zh) 用于检测禽流感病毒h7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN103255232A (zh) 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN108048600A (zh) 一种牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量pcr检测方法
CN103820574B (zh) 人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒
CN112481416A (zh) 非洲猪瘟病毒和猪传染性胸膜放线杆菌双重荧光pcr检测试剂盒及使用方法
CN104593357A (zh) 用于检测肠道病毒的核酸及其应用
CN102952902B (zh) 对虾白斑综合症病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN1840701A (zh) 尼帕病毒的荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法和应用
CN102676697A (zh) 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒
CN110607394A (zh) 莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法
CN105567870A (zh) 一种体外检测尼帕病毒的试剂及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160511

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication