CN105567781B - 细胞黏附力的检测方法及细胞探针固定支架 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种细胞黏附力的检测方法，包括以下步骤：a、制备多细菌探针和/或单细菌细胞探针样本；b、采用接触模式对多细菌探针和/或单细菌细胞探针样本进行AFM测量，获取随时间变化的力‑距曲线；c、根据细菌细胞荧光染色、电镜图片及力‑距曲线形态判断细菌探针质量，去除无效曲线后读取粘附峰的最大值，即为样本表面与细胞的粘附力。本发明还公开了一种细胞探针固定装置。本发明采用原子力显微镜在近生理条件下定量检测多细菌及单细菌的黏附力，分析细菌黏附行为，可用于材料的抗菌性评价，为菌斑生物膜的形成机制研究提供新的方法和思路；本发明同时公开了一种适用于本检测方法的细胞探针固定支架。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种细胞黏附力的检测方法及细胞探针固定支架。
背景技术
口腔菌斑生物膜是龋病和牙周病的始动因素，细菌黏附到固体表面的过程是生物膜形成的关键，是微生物研究的关键问题之一。目前细菌黏附的机制还未完全明确，在整个细菌黏附和牙菌斑生物膜形成的发生、发展过程中，细菌黏附力具有重要的作用，它决定了细菌生长及脱落的动态平衡。为控制牙菌斑生物膜的形成，国内外科学工作者已关注对口腔细菌黏附力及生物膜力学的深入探讨。
发明内容
本发明旨在提供一种细胞黏附力的检测方法,采用原子力显微镜在近生理条件下定量检测多细菌及单细菌的黏附力，分析细菌黏附行为，可用于材料的抗菌性评价，为菌斑生物膜的形成机制研究提供新的方法和思路；本发明同时公开了一种适用于本检测方法的细胞探针固定支架。
为达到上述目的，本发明是采用以下技术方案实现的：
本发明公开的细胞黏附力的检测方法，包括以下步骤：
a、制备多细菌探针和/或单细菌细胞探针样本；
b、采用接触模式对多细菌探针和/或单细菌细胞探针样本进行AFM测量，获取随时间变化的力-距曲线；
c、根据细菌细胞荧光染色、电镜图片及力-距曲线形态判断细菌探针质量，去除无效曲线后读取粘附峰的最大值，即为该样本表面与细胞的粘附力。
进一步的，在步骤a中，所述多细菌探针的制备方法包括：将探针在紫外光下消毒，在显微镜下通过固定支架将探针浸入多聚-L-赖氨酸溶液中，取出后在层流通风橱中晾干，再将探针浸入细菌悬液吸收。
优选的，在步骤a中，所述单细菌细胞探针的制备方法包括：所述单细菌细胞探针采用无尖探针，采用UV固化的胶水将直径4～6.1um的Scilica球固定于无尖探针上，在细菌悬液中固定单细菌于Scilica球的顶端。
优选的，所述无尖探针为采用多巴胺对胶体探针进行表面生物改性得到；固定Scilica球、单细菌时均采用原子力显微镜控制探针。
优选的，在步骤b中，原子力显微镜的参数设定为扫描频率0.5Hz，扫描距离1.5um；每个多细菌探针和/或单细菌细胞探针在样本表面随机选取3个点进行扫描，每点重复测量10次，每个样本共获得30个力-距离曲线。
进一步的，步骤c中还包括：根据泊松分布分解为非特异性力和特异性力，得到不同黏附时间点的力的分布。
进一步的，步骤c中还包括：根据单细菌细胞探针样本的力-距曲线，获得细胞表面的弹性模量，结合探针与细胞的粘附力，获得生物膜的力分布图。
本发明还公开了一种适用于所述细胞黏附力的检测方法的细胞探针固定支架，包括悬臂，所述悬臂一端与安装座连接，悬臂自由端的端面开设V型开口，所述悬臂自由端的顶面设有龙门，所述龙门跨设在V型开口上方，龙门的一个支撑柱与悬臂自由端的顶面固连，龙门的另一个支撑柱与悬臂自由端的顶面之间留有间隙。
进一步的，所述安装座包括底座、支撑板、压板和垫板，所述支撑板的底面连接底座的顶面，所述垫板的底面连接支撑板的顶面，所述压板的底面连接垫板的顶面，支撑板、压板的一端均超过垫板，支撑板、压板超过垫板部分均设有螺纹孔，支撑板、压板上的螺纹孔上下正对，所述悬臂设有条形孔，所述条形孔的长边方向与悬臂的轴线方向相同。
进一步的，所述悬臂分为前后两段，前后两段之间通过阻力铰链连接，所述龙门为弹性材质。
本发明在近生理条件下检测细菌对口腔材料的黏附力，通过对力-距曲线的统计学分析，研究不同细菌对口腔材料初期黏附、黏附强化及细菌集聚的机制；分析生物膜形成早期到成熟阶段的形貌及细菌细胞的黏附力，获得生物膜表面的力分布图，讨论影响生物膜形成及处理的因素；综合菌斑生物膜的黏附能，探讨口腔材料表面菌斑生物膜形成的机制。本课题有助于口腔材料种类和表面设计优化，减少细菌黏附，控制牙菌斑的形成，降低龋病与牙周病的发病率；通过分析黏附力及黏附能研究细菌黏附过程，为菌斑生物膜的形成机制研究提供新的思路。
附图说明
图1为细胞探针固定支架的结构示意图；
图2为图1的俯视图；
图中：1-探针头部、2-探针尾部、3-V型开口、4-悬臂、5-条形孔、6-压板、7-龙门、8-支撑板、9-螺纹孔、10-挡板、11-底座、12-螺栓、71-龙门的一个支撑柱、72-龙门的另一个支撑柱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。
本发明公开的细胞黏附力的检测方法，包括以下步骤：
1、多细菌探针的制备：细菌固定于探针的方法步骤包括细胞培养、离心、超声等，获得细胞悬液。将细菌固定于无尖探针上，固定前探针在紫外光下消毒，在显微镜下通过自制的固定支架将探针浸入多聚-L-赖氨酸(PLL)溶液中，取出后在层流通风橱中晾干，再将探针浸入细菌悬液吸收，多细菌探针制备成功后立即用于AFM测量。
2、建立了单细菌细胞力学测试平台(single-cell force spectroscopy SCFS)：单细菌细胞力学测试的关键在于细菌细胞的固定，需采用特定的原子力显微镜探针，如胶体探针。通过原子力显微镜的辅助，采用UV固化的胶水将直径4-6.1um的Scilica球固定于无尖探针上，自制胶体探针，采用多巴胺对胶体探针进行表面生物改性，采用原子力显微镜控制探针，在细菌悬液中固定单细菌于胶体球的顶端，制得单细菌细胞探针。
3、力-距曲线的测量：在接触模式下测量，将制备好的细胞探针加载于AFM的探针架，将待测材料固定于液体池底部，调整AFM参数，在黏附缓冲液中完成力-距曲线的测量，并通过软件控制细菌探针在材料表面停留的时间获得不同黏附时间的力-距曲线。
具体的，采用SPM-9600岛津扫描探针显微镜在接触模式下测量，将制备好的细胞探针加载于AFM的探针架上并放入原子力显微镜中。将材料试件固定于液体池底部中间，并放于原子力显微镜载样台上。调整激光强度后使探针靠近样品表面，往液体池内注入粘附缓冲液，浸没过显微镜探针支架及样本表面，调整显微镜各项参数后进行粘附力的测量。测量条件：室温，粘附缓冲液中，接触模式，扫描频率0.5Hz，扫描距离1.5um。每个样本表面随机选取3个点，每点重复测量10次，每个样本共获得30个力-距离曲线，根据根据细菌细胞荧光染色、电镜图片及力-距曲线形态判断细菌探针质量，去除无效曲线后读取粘附峰的最大值，即该组样本表面与细胞的粘附力。
在前进曲线上无细菌的悬臂梁在接触样本表面时有一个明显的跳跃，细菌悬臂梁为平缓的弧线，可判断细菌悬臂的完整性。
在后退曲线上，AFM控制细菌悬臂梁后退离开样本表面，由于细菌与样本表面的黏附力，悬臂梁发生向下的弹性形变，黏附力越大，形变越大。悬臂梁继续后退，直到两者间的黏附结合键断裂，悬臂梁回到初始位置。由于存在多个细菌的黏附结合键断裂，所以后退曲线末端为起伏的波浪曲线，表明表面有细菌存在。
通过上述曲线特征可判断曲线是否有效。黏附峰为后退曲线最低点与基准线的距离，通过虎克定理可以转换成力。
4、通过力-距曲线分析细菌的黏附行为：细菌与表面接近时，出现最大黏附力主峰值；随细菌远离材料表面，出现很多小的黏附力副峰，数目随细菌与材料表面接触的时间递增，根据Poisson分布可分解为非特异性力和特异性力，通过讨论不同黏附时间点的力的分布，探讨初期黏附及黏附强化的机制。单细菌的力距曲线分析可用于细菌黏附的生物分子机制研究。
如图1、图2所示，本发明公开的细胞探针固定支架，包括悬臂4，悬臂4分为前后两段，前后两段之间通过阻力铰链连接，悬臂4一端与安装座连接，悬臂4自由端的端面开设V型开口3，悬臂4自由端的顶面设有龙门7，龙门7采用弹性材质，龙门7跨设在V型开口3上方，龙门7的一个支撑柱71与悬臂4自由端的顶面固连，龙门7的另一个支撑柱72与悬臂4自由端的顶面之间留有间隙；安装座包括底座11、支撑板8、压板6和垫板10，支撑板8的底面连接底座11的顶面，垫板10的底面连接支撑板8的顶面，压板6的底面连接垫板10的顶面，支撑板8、压板6的一端均超过垫板10，支撑板8、压板6超过垫板10部分均设有螺纹孔9，支撑板8、压板6上的螺纹孔9上下正对，悬臂4设有条形孔5，条形孔5的长边方向与悬臂4的轴线方向相同。
使用时，将细胞探针固定在悬臂4自由端，具体的，探针头部1悬空，探针尾部2卡在龙门的另一个支撑柱72和悬臂4自由端的顶面之间；使用螺栓12依次穿过压板6上的螺纹孔9、条形孔5和支撑板8上的螺纹孔将悬臂4固定在安装座上。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种细胞探针固定支架，其特征在于，包括悬臂，所述悬臂一端与安装座连接，悬臂自由端的端面开设V型开口，所述悬臂自由端的顶面设有龙门，所述龙门跨设在V型开口上方，龙门的一个支撑柱与悬臂自由端的顶面固连，龙门的另一个支撑柱与悬臂自由端的顶面之间留有间隙。
2.根据权利要求1所述的细胞探针固定支架，其特征在于，所述安装座包括底座、支撑板、压板和垫板，所述支撑板的底面连接底座的顶面，所述垫板的底面连接支撑板的顶面，所述压板的底面连接垫板的顶面，支撑板、压板的一端均超过垫板，支撑板、压板超过垫板部分均设有螺纹孔，支撑板、压板上的螺纹孔上下正对，所述悬臂设有条形孔，所述条形孔的长边方向与悬臂的轴线方向相同。
3.根据权利要求1所述的细胞探针固定支架，其特征在于，所述悬臂分为前后两段，前后两段之间通过阻力铰链连接，所述龙门为弹性材质。
4.一种使用权利要求1-3任一项所述的细胞探针固定支架制备多细菌探针的方法，其特征在于：包括将探针在紫外光下消毒，在显微镜下通过固定支架将探针浸入多聚-L-赖氨酸溶液中，取出后在层流通风橱中晾干，再将探针浸入细菌悬液吸收。
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