CN105560228A - 抑制呼吸链复合物v在结直肠癌干细胞治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴定了呼吸链蛋白复合物V在结直肠癌干细胞中活性高于非干细胞，传统的观念认为结直肠癌细胞主要以糖酵解的方式获得其生长的能量来源，而本发明证实在结直肠癌干细胞中则主要以氧化磷酸化的方式获得其生长的能量来源。并证实氧化磷酸化呼吸链蛋白复合物V在结直肠癌干细胞的生长增殖过程中起着极其重要的作用，抑制复合物V的活性能有效的抑制复合物V的增殖。本发明为临床结直肠癌干细胞的干预提供了治疗性的分子靶标。
Description
技术领域
本发明涉及寡霉素A(OligomycinA，呼吸链复合物V功能抑制剂)对结直肠癌干细胞(ColonCancerStemCells，cCSCs)增殖的抑制作用，探讨复合物V在结直肠癌干细胞治疗中的应用。
背景技术
肿瘤干细胞(CancerStemCells，CSCs)属于癌细胞的亚细胞群，具有和成体干细胞相似的自我更新和多分化潜能。常见的肿瘤干细胞标记物包括CD133、CD44、CD2ni4、EpCAM、THY1、ATP-bindingcassetteB5和CD200。CD44是细胞粘附分子，调节细胞信号传导、迁移和归巢，广泛用于标记结直肠癌干细胞。正常成体干细胞能用泡体包裹化疗药物并将其泵出细胞外而表现出对化疗药物天然的耐受性。肿瘤干细胞对传统的化疗和放疗同样具有耐受性，主要是其自我更新能力和多分化潜能导致肿瘤复发和转移，是目前肿瘤治疗需要攻克的一个难题，因此肿瘤干细胞也是肿瘤治疗的重要靶点。
线粒体(mitochondrion)是一种存在于大多数细胞中由两层膜包被的细胞器，其直径在0.5到10微米左右，是细胞进行呼吸作用为生物体提供能量的主要场所。呼吸作用包括柠檬酸循环和氧化磷酸化两个过程，柠檬酸循环又称为三羧酸循环或Krebs循环，主要在线粒体基质(matrix)中完成。线粒体氧化磷酸化的电子传递链，又叫线粒体呼吸链，位于线粒体内膜上，是指电子经一系列膜结合的电子载体(即呼吸链)从NADH或FADH2到O2，同时产生线粒体内外膜质子电势差而驱动复合物V催化合成ATP的过程。呼吸电子传递链由四个分子量很大的跨膜蛋白复合体(线粒体呼吸链膜蛋白复合体I、II、III、和IV)、以及介于I/II与III之间的泛醌和介于III与Ⅳ之间的细胞色素C共同组成。复合物V(ATPsynthase,EC3.6.1.3,又称为F1Fo-ATP酶)主要是与呼吸链四个酶复合物偶联完成氧化磷酸化生成ATP，因此常又称为ATP合酶。
复合物V(ATP合成酶或者F1Fo-ATP酶)，主要是在细胞内催化能源物质ATP的合成，在呼吸过程中通过电子传递链释放的能量先转化为跨膜质子(H+)梯度，质子流顺质子梯度差通过复合物V的Fo部分使ADP和Pi合成ATP。ATP合成酶主要由F1和Fo两个部分组成，其中F1为起催化作用的水溶性球蛋白，从内膜突出于基质中，由3α、3β、1γ、1δ和1ε等9个亚基组成，3个α和3个β亚基交替排列在γ亚基的α螺旋结构的氨基和羧基末端。α和β亚基上均有核苷酸结合位点，其中β亚基的结合位点具有催化ATP合成或水解的活性，α3，β3共同旋转以调节三个β亚基催化位点的开放和关闭。γ与ε亚基具极强的亲和力，结合在一起形成“转子”，ε亚基还有抑制酶水解ATP的活性，还能堵塞氢离子通道以减少氢离子泄露的功能。ATP合成酶的Fo部分是嵌合在内膜上的疏水蛋白复合体，主要形成一个跨膜质子通道而起质子转移作用。其类型在不同物种中差别很大，在细菌中Fo由a，2b，9-12c三种亚基组成。多拷贝的c亚基形成一个环状结构，a亚基和b亚基二聚体排列在c亚基聚体环状外侧，a亚基，b亚基和F1部分的δ亚基共同组成“定子”。在F1和Fo之间还有寡霉素敏感蛋白(OligomycinSensitivity-ConferringProtein,OSCP)柄相连，寡霉素可与寡霉素敏感蛋白结合，阻止质子从Fo通道内流动而合成ATP。质子不能内流导致膜两侧电化学梯度增高，影响质子泵的功能，进而抑制电子传递。
复合物V的作用是在F1部位催化ADP和Pi形成ATP，在线粒体内膜上，呼吸链组分间氢与电子交替传递，使质子(H+)从内膜的内侧泵到外侧，而电子和O结合生成O2-，由于膜对H+的不通透性，从而形成跨膜的质子浓度梯度和电化学梯度，因此，氧化所释放的能量首先转换为跨膜质子梯度，当H+跨梯度内流到线粒体基质与O2-结合生成水，这种内流的驱动力促使ATP的生成。其释放的能量使Fo的c亚基环和与之相连的F1的γ、δ和ε亚基旋转，γ亚基的旋转为α3β3六聚体合成ATP提供能量。其具体机制为F1亚基上的3个β亚基对ATP和[ADP+Pi]结合具有不同的亲和性，分别具有紧密结合状态(tight，T态)，松散结合状态(loose，L态)和空置状态(open，O态)。在任何一个时刻，3个β亚基的构象总是互不相同的。在ATP的合成过程中，ADP和Pi首先结合在L位，质子流经过Fo回流到线粒体基质驱动F1亚基上的3个β亚基构象发生依次变化，即L位转变为T位，同时原T位转变为O位，原O位转变为L位，进入T位的ADP和Pi合成ATP，并随着进一步构象的改变释放出去，ADP和Pi再依次进入L位合成ATP。每一个β催化亚基经过几次伴随构象改变而发生的结合变化最后形成l个ATP分子，这样的过程反复进行以不断合成ATP。在ATP水解时，则使用相反的途径，这些构象的转变都是通过γ亚基的旋转实现的。可以简单概括为：通过内膜呼吸链的电子传递所释放的能量首先转变为跨膜的质子梯度差，然后质子浓度梯度驱动ATP合酶的Fo的c亚基发生转动，并继而带动F1亚基的γ亚基的转动而使3个β亚基的构象发生交替变化来合成ATP。也可以形象的描述为：当质子跨膜运输时，带动ATP合酶的类车轮结构和连杆转动，就像水流带动水轮机转动一样，然后再引起其他部分的转动，在这种转动下，ATP合酶上三个催化部位构象以抓住底物ADP和Pi合成ATP。寡霉素A与质子泵的Fo部分结合并特异地抑制质子的运输，从而抑制ATP的合成和分解。
发明内容
本发明研究了寡霉素A对结直肠癌干细胞线粒体呼吸链氧化磷酸化功能抑制而抑制结直肠癌干细胞生存和增殖。传统的观点认为，肿瘤细胞主要是以糖酵解为主对其生长提供能量，而本发明发现在肿瘤干细胞中，主要以线粒体的氧化磷酸化为主要供能方式为肿瘤干细胞的生长提供能量。我们用寡霉素A抑制呼吸链复合物V的ATP合成酶功能证明呼吸链对于维持结直肠癌干细胞生存和增殖的重要性，这为临床上治疗由肿瘤干细胞引起的肿瘤复发和肿瘤转移的治疗提供有效的药物作用靶点。
首先，检测不同结直肠癌细胞株中干细胞比例，并选择细胞生长状态良好和干细胞比例高的细胞株进行干细胞的分选和培养。最后选出HT29和HCT116这两株结直肠癌细胞株的肿瘤干细胞标记物CD44阳性比例分别为10.2%和7.7%，并通过磁珠分选出HT29和HCT116两株结直肠癌细胞中的肿瘤干细胞进行培养，裸鼠成瘤模型说明结直肠癌干细胞的成瘤性对CD44阳性细胞具有依赖性。
其次，以非干细胞为对照，分析结直肠癌干细胞线粒体形态差异和呼吸链复合物V功能。磁珠分选后的结直肠癌干细胞(CD44阳性)和非干细胞(CD44阴性)，用透射电子显微镜观察线粒体的形态，发现结直肠癌干细胞HT29和HCT116线粒体直径大于非干细胞，嵴结构之间没有显著的界限。线粒体内膜染色后用流式细胞技术检测同样证明两株结直肠癌干细胞(HT29/CD44+和HCT116/CD44+)的内膜面积显著大于非干细胞。ATP合成酶活性检测，即呼吸链复合物V活性检测的结果显示在两株干细胞中(HT29/CD44+和HCT116/CD44+)该酶的活性高于非干细胞。
最后，检测细胞增殖活性，证明结直肠癌干细胞对寡霉素A的敏感性。使用呼吸链复合物V酶活性抑制剂寡霉素A处理的结直肠癌干细胞(HT29/CD44+和HCT116/CD44+)并检测其增殖活性，结果显示在处理的第一天细胞增殖活性出现完全下降，对应的非干细胞的增殖活性并没有出现降低。上述结果说明结直肠癌干细胞呼吸链复合物V代谢功能活跃，抑制其功能能使结直肠癌干细胞的活性和增殖受到显著抑制，这对针对肿瘤干细胞的治疗具有重要的意义。
附图说明
图1.结直肠癌细胞HT29和HCT116用荧光标记的CD44抗体检测肿瘤干细胞标记物CD44的表达。细胞流式分析仪检测到HT29和HCT116细胞CD44阳性的比例分别为10.2%(见图1A)和7.7%(见图1B)。
图2.HT29和HCT116细胞经过磁珠分选法分离出CD44阳性和CD44阴性细胞，阳性细胞在干细胞培养基中培养，阴性细胞在正常细胞培养基进行培养。CD44阳性细胞在培养5天后长出干细胞球(见图2右)。
图3.将正常结直肠癌细胞HT29、HCT116和分选后的CD44阴性细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-以1×106个细胞在免疫缺陷鼠NU/NU皮下注射。50天后，皮下注射的正常HT29细胞形成肿瘤，CD44-阴性细胞没有形成肿瘤；正常HCT116细胞形成的肿瘤体积明显大于HCT116/CD44-细胞(见图3)。
图4.HT29和HCT116的CD44阴性细胞和CD44阳性细胞经过戊二醛固定，在透射电子显微镜下观察，放大倍数为10000倍(上行)和50000倍(下行)放大倍数下观察线粒体形态，其中箭头指示为线粒体(见图4)，发现结直肠癌干细胞线粒体直径大于非干细胞，嵴结构之间没有显著的界限。
图5.HT29和HCT116的CD44阴性和阳性细胞用线粒体膜染料Mito-TrackerGreen和Mito-TrackerRed进行标记，并用流式细胞仪进行分析。经过线粒体内膜染料Mito-TrackerGreen和Mito-TrackerRed标记的HT29CD44阳性细胞的荧光强度是395666和104667,显著高于CD44阴性细胞的两个荧光强度142000和58666(见图5A、B)。经过线粒体内膜染料Mito-TrackerGreen和Mito-TrackerRed标记的HCT116CD44阳性细胞的荧光强度为491666和102466，也同样高于CD44阴性细胞的137333和50100(见图5C、D)。
图6.HT29和HCT116的CD44阴性和阳性细胞用线粒体活性氧自由基染料Mito-SOX标记线粒体ROS，再用流式细胞仪进行分析。经过线粒体活性氧自由基染料Mito-SOX标记的HT29CD44阳性细胞的荧光强度是9326,显著高于CD44阴性细胞的荧光强度3390(见图6A)。经过线粒体活性氧自由基染料Mito-SOX标记的HCT116CD44阳性细胞的荧光强度为12475，也同样高于CD44阴性细胞6971(见图6B)。
图7.HT29和HCT116的CD44阴性和阳性细胞的ATP合成复合物酶与检测试剂盒的底物试剂反应，分光光度计检测光吸收的变化。HT29CD44阳性细胞ATP合成酶复合物酶活性的相对值为0.806667，高于CD44阴性细胞0.549316(见图7A)，HCT116CD44阳性细胞也得出相同的结果(见图7B)。
图8.用ATP合酶特异性抑制剂寡霉素A处理结直肠癌干细胞和非干细胞，检测其细胞增殖活性的变化。细胞增殖活性实验结果表明在寡霉素A(0.1、0.5、1.0μg/ml)处理后的第2、4、6、8天，HT29和HCT116的CD44阳性细胞的增殖活性显著降低(见图8A、C)，CD44阴性细胞的增殖活性没有出现下降(见图8B、D)。
具体实施方式
实施例1：肿瘤干细胞标记物CD44在结直肠癌细胞的表达和CD44阳性细胞的分离培养。
本发明中的结直肠癌细胞株HT29和HCT116均从中国科学院昆明动物研究所细胞库购买。本发明中的结直肠癌细胞HT29和HCT116在含有10%胎牛血清(BI公司,CodeNo.04-001-1A)和抗生素(Hyclone公司,CodeNo.SV30010)的DMEM(Gibco公司,CodeNo.10566-016)培养基中培养，在37℃培养箱(ThermoScientific公司,CodeNo.370)，CO2浓度为5%的条件下进行培养。
流式细胞术方法检测肿瘤干细胞标记物CD44的表达率。将两株结直肠癌细胞株经过胰酶(Gibico公司,CodeNo.25200-056)消化成单个细胞，转移到装满磷酸盐缓冲液的15ml离心管，在300g离心力下离心7分钟收集2×105个细胞，160微升的磷酸盐缓冲液重悬细胞，并将细胞分成两份，一份加入20微升FITC/CD44抗体(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-098-210)，一份加入20微升FITC/IgG(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-099-229)作为Isotype同型对照。加入后混匀后在4℃孵育10分钟，孵育后的细胞用15ml磷酸盐缓冲液清洗，在300g离心力下离心7分钟收集细胞，200微升的磷酸盐缓冲液重悬细胞。使用流式细胞分析仪(美国BD公司,CodeNo.C6)进行检测10000个事件数并进行分析，流式细胞术分析的结果见图1所示，两个结直肠癌细胞株HT29和HCT116的肿瘤干细胞标记物CD44的表达阳性率分别为10.2%和7.7%。
另外，运用磁珠分选方法分选CD44阳性的肿瘤干细胞，将培养的HT29和HCT116经过胰酶消化后用CD44磁珠抗体(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-095-194)在4℃孵育10分钟，用磁珠分选架对CD44阳性细胞进行分选。分选出的CD44阴性细胞使用和未分选的结直肠癌细胞一样的培养基，CD44阳性细胞用含有20ng/mlEGF(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-093-825)、10ng/mlFGF2(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-104-921)和B27(德国Miltenyi公司,CodeNo.130-097-263)的DMEM/F12培养基(Gibico公司,CodeNo.11039-021)进行培养，CD44阳性细胞在培养5天后长出干细胞球，见图2所示。
将正常培养的结直肠癌细胞株HT29、HCT116和磁珠分选后的CD44阴性结直肠癌细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-进行成瘤性检测。采用皮下注射的方法，在免疫缺陷鼠Nu/Nu(从北京维通利华有限公司购买)皮下注射1×106个细胞，50天后查看肿瘤生长的情况。从图3中可以看到，CD44阴性的HT29/CD44-和HCT116/CD44-细胞的成瘤性明显低于正常的HT29和HCT116细胞，由于CD44阴性细胞中不含有干细胞，正常细胞株含有干细胞，可以推测出结直肠癌干细胞对肿瘤的增殖有很重要的促进作用。
实施例2：结直肠癌干细胞(CD44阳性)和非干细胞(CD44阴性)中线粒体形态及功能的差异。
将培养的结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+和非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-用戊二醛固定，用透射电子显微镜观察线粒体(由昆明医科大学显微镜观察实验室协助完成)的显微结构，拍摄10000倍和50000倍图片，见图4箭头所示。结果发现结直肠癌干细胞HT29和HCT116线粒体直径大于非干细胞，而且线粒体内嵴结构之间也没有显著的界限。
另外，用线粒体内膜染料Mito-TrackerGreen(ThermoScientific公司,CodeNo.M-7514)和Mito-TrackerRed(ThermoScientific公司,CodeNo.M-7513)对结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+和非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-染色10分钟，然后进行流式细胞术分析。结果显示两种染料Mito-TrackerGreen和Mito-TrackerRed标记的结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44的荧光强度都显著大于非干细胞HT29/CD44-，见图5所示。同样也证明了结直肠癌干细胞和非干细胞线粒体的内膜结构有显著的差异。
用Mito-SOX(ThermoScientific公司,CodeNo.M36008)标记线粒体呼吸链副产物活性氧自由基ROS，并同样采用流式分析术进行分析，结果显示结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+的线粒体ROS产量明显大于非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-，说明结直肠癌干细胞的氧化磷酸化活性高于非干细胞，见图6所示。
最后，将结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+和非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-裂解后，用MitochondrialComplexVEnzymeKit试剂盒(Millopre公司,CodeNo.AAMT005-1KIT)检测结直肠干细胞和非干细胞呼吸链复合物V的酶活性。分析结果显示结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+的呼吸链复合物V酶活性大于非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-，见图7所示。
实施例3：复合物V抑制对结直肠癌干细胞(CD44阳性)增殖活性的影响。
将结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+和非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-按照1000个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板，第二天用三个不同浓度(0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml)的呼吸链复合物V抑制剂寡霉素A(TOCRIS公司,CodeNo.4110)对细胞进行处理，用细胞增殖活性检测试剂盒(Promega公司,CodeNo.G3581)检测细胞在第0、2、4、6、8天的活性。相比较于未用解偶联剂处理的细胞，寡霉素A处理后的结直肠癌干细胞HT29/CD44+、HCT116/CD44+在第2天的细胞增殖活性明显受到抑制，见图8A，C所示，而非干细胞HT29/CD44-、HCT116/CD44-的增殖活性出现了轻微的升高，见图8B，D所示，说明抑制呼吸链复合物V能够有效的抑制结直肠癌干细胞的增殖。
Claims (3)
1.抑制呼吸链复合物V(ATPsynthase，EC3.6.1.3，又称为F1Fo-ATP酶或者ATP合成酶)在结直肠癌干细胞治疗中的应用。
2.在结直肠癌干细胞治疗的应用中，以权利要求1中的蛋白质作为特异的分子作用靶点的应用。
3.如权利要求1-2所述的应用，其特征在于阻止复合物V中质子流从复合物V的Fo通道内流动而合成ATP。
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