CN105557487A - 一种研究小麦高温胁迫的试验方法 - Google Patents

Abstract

一种研究小麦高温胁迫的试验方法，属于植物幼苗高温胁迫试验领域，包括幼苗培养、品种选择、硫氢化钠溶液配制、硫氢化钠溶液喷施、硫氢化钠溶液浓度优化、硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化等步骤；幼苗培养包括选种、清水浸种、浸种灭菌、恒温浸种、催芽、二次选种、摆种、催苗、剔苗、育苗；育苗时自浸种至移苗期间的多次幼苗优化筛选，保证初始试验材料的一致性。对培养20天的小麦幼苗叶施不同浓度的硫氢化钠溶液用于高温胁迫的缓解试验，对硫氢化钠溶液进行了浓度、喷施时间及喷施次数的优化，结合试验取材时取样方法的优化创新，能更好的从试验的设计、流程及结果上保证最终试验数据准确定性，对最终揭示试验处理的生理生化变化大有助益。

Description

一种研究小麦高温胁迫的试验方法

技术领域

本发明涉及植物幼苗高温胁迫试验技术领域，具体地说是一种研究小麦高温胁迫的试验方法。

背景技术

在目前的小麦幼苗高温胁迫试验中，幼苗生长的一致性关系试验的成败，受到现有幼苗培育手段的限制，固体培养基培育幼苗时，仅能够在选种过程中进行把关，即选用大小、色泽、饱满度完全一致的种子，希望以此培育出的差异较小的小麦幼苗材料，尽量保证试验材料选取的统一性和准确性。而使用固体培养基培育幼苗时，往往会出现缺苗以及畸形苗偏多的现象，无法保证用于试验处理的试验材料的统一性，给后续高温胁迫的试验操作带来困难与不便。

发明内容

本发明提供了一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其通过对小麦幼苗采取液体培养的方法，在育苗过程中进行多次筛选，能避免出现缺苗及畸形苗偏多的现象，保证移苗时试验材料的均一性，使之符合高温胁迫试验的控制单一变量原则。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种研究小麦高温胁迫的试验方法，包括的操作步骤有：幼苗培养、品种选择、硫氢化钠溶液配制、硫氢化钠溶液喷施、硫氢化钠溶液浓度优化、硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化；其中，

幼苗培养的方法为：

(1)选种：去除破损、霉烂、干瘪的种粒，数取一定数目的小麦种子。

(2)清水浸种：将数取的小麦种子置于容器中，且保证小麦种占容器容积不超过1/2，加水浸没种子3至5厘米，然后在负压条件下使种子在水中相对晃动，直至种子的表面完全浸水不再存有气泡，最后用清水清洗小麦种子2至5次。

负压条件下能促进种子表面与水充分接触。经该负压处理，能够较快地使种子表面完全被水浸润，防止浸润不彻底出现种子表面仍然存在部分气泡，尤其小麦种子的腹沟处。

(3)浸种灭菌：将清洗过的种子倒入三角瓶中，加入1％的次氯酸钠溶液，使之浸没种子0.6至1.5厘米，浸种灭菌时长为8至12分钟。

(4)恒温浸种：用清水冲洗掉种子表面的次氯酸钠溶液后将种子放置在培养箱的白盒中，并向白盒内加入清水至浸没种子0.6至1.5厘米，调节培养箱调至25摄氏度恒温后，黑暗条件下浸种6小时。

(5)催芽；恒温浸种结束后，倒掉培养箱白盒中的水，取出种子，并将种子平铺在条状湿毛巾的中间位置，使两侧毛巾翻过来包盖住种子，然后将包有种子的湿毛巾放入培养箱的白盒里，调节培养箱至30摄氏度恒温，并于黑暗环境中放置18个小时，进行催芽，期间需保证毛巾始终处于湿润状态。

(6)二次选种：催芽结束后，在湿毛巾上直接剔除未露白及外表颜色不一致的小麦种子。

(7)摆种：二次选种后得到的小麦种子，用尖头镊子将其整齐摆放在浮筏上，所述浮筏包括塑料浮漂制成的围框以及缝合在围框内的硬质尼龙纱网，使小麦种子的腹沟向下接触尼龙纱网，粒间距控制在2.5至3.5毫米，行间距控制在0.8至1.2厘米。

(8)催苗：摆种完毕后，将浮筏移至培养箱的发芽盒中，用注射器将60毫升的清水顺着发芽盒的侧边缓慢注入，并覆盖子，培养箱调节至25摄氏度恒温，全光照培养24小时。

然后去掉发芽盒上的盖子后，调节培养箱程序为：

25摄氏度，全光照培养14小时；20摄氏度，全光照培养10小时；

当种子出芽0.8至1.3厘米时，向发芽盒中补充已经经过通气处理的清水1至1.5升，并每两天更换一次清水。

(9)剔苗：自种子出芽1厘米后一直到第8天育苗的期间内，根据麦苗的胚芽鞘颜色、长度，叶片颜色、卷曲程度、有无干叶尖现象，麦苗在群体中的株高状况以及苗的粗细等因素进行综合判断，剔除疑似杂株、畸形苗、过高、过矮及弱苗。

(10)育苗：至第8天后，挑选整齐一致的壮苗，去掉根部残余的种子后，用清水冲洗干净根部残余淀粉后作如下处理：

随机拿取幼苗，将其转移到提前准备好的已经按照试验需求打孔的泡沫板上，每孔1-2株，并用海绵块包裹麦苗的胚芽鞘部位后固定在泡沫板的孔中；随后将带苗的泡沫板转移至外表面涂黑漆的大盒中，用1/2Hoagland营养液培养；

泡沫板在1/2Hoagland营养液中培养1天之后改用Hoagland营养液培养，培养条件为：以24小时为周期，22摄氏度，全光照14小时，15摄氏度，黑暗条件下10小时；

品种选择：

按上述方法顺序，在室内培养出多个品种的20天幼苗后，分别在培养箱中经38摄氏度高温胁迫24小时后，再于适温条件下恢复生长一周，所谓适温条件即24小时内按照22摄氏度光照14小时与15摄氏度黑暗条件下10小时的循环培育处理；在对各品种进行高温胁迫时，均需留有相应的对照组，不进行高温胁迫处理；

恢复生长一周后测定苗干重及苗干重抗逆系数，综合选取苗干重降低明显的品种作进一步试验处理，此处将得到的该品种命名为“品种A”；

硫氢化钠溶液配制：

用去离子水分别配制0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35毫摩尔每升的硫氢化钠溶液，配制的硫氢化钠溶液含0.2％Tween20，且各种硫氢化钠溶液均应现用现配；

硫氢化钠溶液喷施：

先将泡沫板上最左和最右各一列视为保护列，不计入任何试验；随后按照试验中的具体设计，将泡沫板纵向截成几部分，分别用于外源硫氢化钠溶液的喷施处理；喷施处理过程中，用小喷壶对准叶片区域均匀喷雾处理，以叶片密布液滴为准，各种浓度的硫氢化钠溶液对应的喷施面积相同，且喷施量一致；喷施完毕后，用清水缓慢冲洗掉透过叶片沾染到泡沫板上的硫氢化钠溶液；最后将泡沫板按照顺序重新放回原位，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，营养液已经提前预热到38度；

硫氢化钠溶液浓度优化：

按照上述幼苗培养的方法培养出“品种A”的幼苗后，在第20天时按照上述硫氢化钠溶液喷施方式，分别喷施上述所述各种浓度的硫氢化钠溶液后，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后进行适温条件下恢复生长一周，以0浓度的硫氢化钠溶液喷施株为对照，以苗干重的变化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠溶液浓度；

硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化：

对按照上述幼苗培养的方法培养出的“品种A”幼苗，选用上述方式得到的最佳的硫氢化钠浓度，分别以以下6种方式进行喷施处理：

(1)喷水对照；

(2)第20天喷施1次；

(3)第19、20天各喷施1次；

(4)第18、19、20天各喷施1次；

(5)第18、20天各喷施1次；

(6)第16、18、20天各喷施1次；

在第20天的喷施后均立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后再进行适温恢复生长一周，以喷水株为对照，以苗干重的变化优化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠喷施时间及次数。

进一步，在上述的清水浸种步骤中，所使用的容器为负压管，所述负压管包括负压管体、螺纹套筒、拉杆及盖帽；所述负压管体的一端开口，另一端连通注水管；所述螺纹套筒与所述负压管体螺纹配合；所述拉杆的一端设置橡胶活塞且使橡胶活塞的外径与负压管体的内径一致，所述拉杆的另一端设置环形凸缘，使环形凸缘的外径不小于所述螺纹套筒的内径；所述盖帽螺纹连接在所述注水管的端口处且在盖帽的中心设置与所述注水管内腔配合的橡胶塞。

将选取的小麦种子置于倒入负压管体的容腔后，将拉杆设置橡胶活塞的一端插入负压管体内并使橡胶活塞下端与小麦种子上部之间保持3至5厘米的垂直间距，然后使注水管管口朝上并通过注水管向负压管体的容腔加水。

加水完毕后，将所述盖帽连接在所述注水管上，然后旋转所述螺纹套筒使螺纹套筒将拉杆向外顶出，使负压管体内形成负压，来对负压管体内的种子和清水进行负压处理，在负压处理期间不断轻轻上下翻转负压管体，以此保证种子表面完全被水浸润，无死角。

进一步，在上述的浸种灭菌步骤中，在用1％的次氯酸钠溶液浸种灭菌的8至12分钟期间，用注射器反复吸打次氯酸钠溶液。

进一步，在上述的育苗步骤中，宜使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度。

进一步，在上述的浸种灭菌步骤中，Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。

本发明所涉及的一种研究小麦高温胁迫的试验方法还包括，小麦高温抗性机理的研究试验，其中包括小麦叶片取样过程，具体为：

直接将泡沫板上的整株幼苗取下，剪取所需部位叶片样品，用电子天平称称量并记录质量后，折成约3-3.5厘米长度，并用镊子将其塞入已编号的2毫升或5毫升离心管中后立即用液氮速冻，采用的离心管的管底部需用尖头镊子扎一小孔；待进行小麦高温抗性机理的试验研究时，根据所需样品的质量，挑出对应编号的离心管，直接进行研磨分析，无需再次称量，既保证了即测样品的完整性，也不会导致剩余样品的融化，能最大限度的保证本次试验结果的准确性及剩余样品的再次可用性。

本发明的有益效果是：

幼苗培养的方法中，自浸种至移苗的过程中，存在多次筛选行为，即选种--浸种几个小时后，用湿毛巾包裹十几小时，再剔除未露白及表皮颜色不一致的种子，其可能为杂种或死种子，浮筏摆种后，按照胚芽鞘颜色及长度剔除杂株及畸形苗，按照叶片卷曲程度及生长角度剔除畸形苗，按照胚芽鞘顶端处的苗粗细剔除弱苗，剔除干叶尖的幼苗(可能为杂株)，根据群体的平均株高剔除过高株和过矮株，最后准备移苗去掉残余种子时，剔除根条数明显减少的幼苗，用于移苗的健壮幼苗已经完成其本阶段的形态建成，之后的培养期间再出现畸形苗的概率极低。

幼苗培养时每天对营养液作通气处理，保证麦苗根部充足的溶氧供应，可促进根对营养物质的吸收，使幼苗生长更加壮且旺盛，保证后期足够的样品量。

此试验方法将目前固体基质培养的过程，改为营养液培养，其利用麦粒本身胚乳中的营养物质供应其生长，能避免固体基质培养时出现的缺苗及畸形苗偏多问题，在移苗时能保证试验材料的均一性。

经催苗，可一次性获得足量的生长一致的高纯度幼苗用于后续试验，以此高纯度的7天小麦幼苗为生长起点，根据试验要求，培养若干天后再进行试验材料的处理跟取样，可消除直接播种小麦种子带来的试验材料长势不统一、畸形苗过多、苗长势偏弱的难题。

在对种子表面灭菌前的负压处理，可保证种子表面完全与清水和次氯酸钠溶液的充分接触，有利于种子表面灭菌的彻底性。加之在同等情况下，吸水速率与接触面积成正比，便于种子快速整齐的吸胀吸水；浸种灭菌过程中，通过用注射器不断吸打次氯酸钠溶液，能够促进种子与次氯酸钠溶液之间的对流，保证种子表面完全接触次氯酸钠溶液，使灭菌更彻底；育苗步骤中使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度，避免麦苗的根伸入海绵中，给清理带来困难。

根据近来的研究报告指出的，含硫化合物可以作为植物生长调节剂参与植物的生物及非生物胁迫的逆境应答，如可通过硫氢化钠溶液浸种、浸根处理，缓解植物的离子与非离子、干旱、盐、重金属、高温胁迫。在本专利中首次采用叶施硫氢化钠溶液用于小麦幼苗的高温胁迫试验的研究。

在叶片取样过程中，利用先前取好的样品进行试验时，只需按照试验所需的样品质量挑选编号即可，无需再次称量，目标明确且迅速，可极大的避免样品浪费及提高试验结果的准确性。

离心管底部扎孔是为了防离心管炸裂：试验中进行指标测定，需将所取样品从液氮中取出时，由于液氮中温度与空气温度的短时间的巨大变化，造成管内气体快速膨胀，炸裂离心管，造成样品浪费，而底部扎孔可快速平衡管内外气压，防止炸管现象的发生。

附图说明

图1为本发明中负压浸种过程使用到的负压管的结构示意图；

图2为本发明中负压管处于负压状态时的结构示意图；

图中：1负压管体，11注水管，2螺纹套筒，3拉杆，31橡胶活塞，4盖帽，41橡胶塞，5小麦种子。

具体实施方式

为便于理解本发明的技术内容，下面便对其具体过程作详细陈述。

一种研究小麦高温胁迫的试验方法，包括的操作步骤有：幼苗培养、品种选择、硫氢化钠溶液配制、硫氢化钠溶液喷施、硫氢化钠溶液浓度优化、硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化。

其中幼苗培养的方法顺序为：

(1)选种：在供给的麦种中去除破损、霉烂、干瘪的种粒后，数取一定数目的小麦种子。

(2)清水浸种：第一天，将上述步骤中数取的小麦种子置于容器中，且保证小麦种占容器容积不超过1/2，加水浸没种子4厘米，然后在负压条件下使种子在水中震荡，来保证种子的表面完全浸水，至种子表面完全没有气泡，尤其是小麦种子的腹沟处。最后用清水清洗小麦种子2至5次。即将盛装有种子和水的容器腔抽成负压后，搅动种子使其在水中晃动。

如图1、图2所示，所使用的容器为负压管，所述负压管包括负压管体1、螺纹套筒2、拉杆3及盖帽4。所述负压管体1的一端开口，另一端连通注水管11，使注水管11的外径为负压管体1外径的1/4且使注水管11的内径小于小麦种子5的外径。所述螺纹套筒2与所述负压管体1螺纹配合。所述拉杆3的一端设置橡胶活塞31且使橡胶活塞31的外径与负压管体1的内径一致。所述拉杆3的另一端设置环形凸缘，使环形凸缘的外径不小于所述螺纹套筒2的内径，最好与螺纹套筒2的外径一致大小。所述盖帽4螺纹连接在所述注水管11的端口处且在盖帽4的中心设置与所述注水管11内腔配合的橡胶塞41，这样在盖帽4拧在注水管11上后，橡胶塞41被挤压至注水管11内，向外拉动拉杆3时，为负压管体1内形成负压提供密封条件。

负压管体1的容腔为50至80毫升，优选60毫升，如果选取容腔过大或者过小，会导致(清水)浸种困难或者花费的时间较长，影响处理效率。将选取的小麦种子5置于倒入负压管体1的容腔(小麦种子5的体积应少于负压管体1容腔的一半)后，将拉杆3设置橡胶活塞31的一端插入负压管体1内并使橡胶活塞31下端与小麦种子5上部之间保持3至5厘米的垂直间距，然后使注水管11管口朝上并通过注水管11向负压管体1的容腔加水，直至注水管11的内端端口位置。

加水完毕后，将所述盖帽4连接在所述注水管11上，然后旋转所述螺纹套筒2，用螺纹套筒2将拉杆3向外顶出并定位拉杆3，使负压管体1内形成负压，来对负压管体1内的小麦种子5和清水进行负压处理。在负压处理期间不断轻轻上下翻转负压管体1，以此保证小麦种子5表面完全被水浸润，无死角。经该负压处理，能够较快地促使小麦种子5表面完全被水浸润，防止浸润不彻底出现种子表面仍然存在部分气泡，尤其小麦种子5的腹沟处。

(3)浸种灭菌：将清洗过的种子倒入三角瓶中，加入1％的次氯酸钠溶液，使浸没种子1厘米，浸种灭菌时长为10分钟。在浸种灭菌的10分钟期间，用注射器反复吸打次氯酸钠溶液，存进种子表面与次氯酸钠溶液的接触，促进次氯酸钠溶液的对流，保证灭菌效果。

(4)恒温浸种：用清水冲洗掉种子表面的次氯酸钠溶液后将种子放置在培养箱的白盒中，然后向白盒内加入清水至浸没种子1厘米，调节培养箱调至25摄氏度恒温后，黑暗条件下浸种6小时。

(5)催芽；恒温浸种结束后，倒掉培养箱白盒中的水，取出种子，并将种子平铺在条状湿毛巾的中间位置，使两侧毛巾翻过来包盖住种子，然后将包有种子的湿毛巾放入培养箱的白盒里，调节培养箱至30摄氏度恒温，并于黑暗环境中放置18个小时，进行催芽，期间需保证毛巾始终处于湿润状态。

(6)二次选种：催芽结束后，在湿毛巾上直接剔除未露白及外表颜色不一致的小麦种子。

(7)摆种：二次选种后得到的小麦种子，用尖头镊子将其整齐摆放在浮筏上，所述浮筏包括塑料浮漂制成的围框以及缝合在围框内的硬质尼龙纱网，使小麦种子的腹沟向下接触尼龙纱网，粒间距控制在3毫米，行间距控制在1厘米。

(8)催苗：摆种完毕后，将浮筏移至培养箱的发芽盒中，用注射器将60毫升的清水顺着发芽盒的侧边缓慢注入，并覆盖子，培养箱调节至25摄氏度恒温，并置于光照环境中，全光照培养24小时；

然后去掉发芽盒上的盖子，24小时内循环(24小时为一循环)调节培养箱温度分别为：

25摄氏度，全光照培养14小时；20摄氏度，全光照培养10小时；

当种子出芽0.8至1.3厘米时，向发芽盒中补充已经经过通气(灭菌空气)处理的清水1至1.5升，保证氧气供应，并每2天更换一次清水。

(9)剔苗：自种子出芽1厘米后一直到第8天(开始挑选籽粒并进行负压处理时记为第1天)育苗的期间内，根据麦苗的胚芽鞘颜色、长度，叶片颜色、卷曲程度、有无干叶尖现象，麦苗在群体中的株高状况以及苗的粗细等因素进行综合判断，剔除疑似杂株、畸形苗、过高、过矮及弱苗。此剔苗过程，完全依靠试验人员的经验，进行操作。

(10)育苗：至第8天后，挑选整齐一致的壮苗，去掉根部残余的种子，并用清水冲洗干净根部残余淀粉后作如下处理：

随机拿取幼苗，将其转移到提前准备好的已经按照试验需求打孔的泡沫板上，每孔1-2株，并用海绵块包裹麦苗的胚芽鞘部位后固定在泡沫板的孔中，宜使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度。随后将带苗的泡沫板转移至外表面涂黑漆的大盒中，用8升1/2Hoagland营养液(即原溶液浓度的一半)培养；

泡沫板在1/2Hoagland营养液中培养1天之后改用Hoagland营养液培养，培养条件为：以24小时为周期，22摄氏度，全光照14小时，15摄氏度黑暗条件下10小时(1天为一循环)；Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。

其中品种选择过程为：

按上述幼苗培养的方法顺序，在室内培养出八个小麦品种(如样品1-7和济麦22，共八个)的20天幼苗后，分别在培养箱中经38摄氏度高温胁迫24小时后，再于适温条件下恢复生长一周。在对各品种进行高温胁迫时，均需留有相应的对照组，不进行高温胁迫处理。

所谓适温条件即24小时内按照22摄氏度光照14小时与15摄氏度黑暗条件下10小时的循环培育处理，下同。

恢复生长一周后测定苗干重及苗干重抗逆系数(苗干重抗逆系数＝胁迫株干重/对照株干重)，综合选取热敏感的品种作进一步试验处理。从而选取出热敏感的济麦22作为进一步试验(硫氢化钠溶液缓解高温胁迫研究)的材料。

试验过程中，使用到的硫氢化钠溶液的配制要求及浓度为：

用去离子水分别配制0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35毫摩尔每升的硫氢化钠溶液(含0.2％Tween20)，且各种硫氢化钠溶液均应现用现配。

去离子水是指除去了呈离子形式杂质后的纯水。国际标准化组织ISO/TC147规定的“去离子”定义为：“去离子水完全或不完全地去除离子物质。

试验过程中，硫氢化钠溶液的喷施方式及处理：

先将泡沫板(育苗用到的泡沫板)上最左和最右各一列视为保护列，不计入任何试验；随后按照试验中的具体设计，将泡沫板纵向截成几部分，分别用于外源硫氢化钠溶液的喷施处理；喷施处理过程中，用小喷壶对准叶片区域均匀喷雾处理，以叶片密布液滴为准，各种浓度的硫氢化钠溶液对应的喷施面积相同，且喷施量一致；喷施完毕后，用清水缓慢冲洗掉透过叶片沾染到泡沫板上的硫氢化钠溶液；最后将泡沫板按照顺序重新放回原位，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时。

试验过程中，硫氢化钠溶液浓度优化：

按照上述幼苗培养的方法培养出济麦22的幼苗后，在第22天时按照上述硫氢化钠溶液喷施方式，分别喷施上述所述各种浓度的硫氢化钠溶液后，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后进行适温条件下恢复生长一周，以0浓度的硫氢化钠溶液喷施株为对照，以苗干重的变化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠溶液浓度；

试验过程中，硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化：

对按照上述幼苗培养的方法培养出的济麦22幼苗，选用上述方式得到的最佳的硫氢化钠浓度，分别以以下6种方式进行喷施处理：

(1)喷水对照；

(2)第20天喷施1次；

(3)第19、20天各喷施1次；

(4)第18、19、20天各喷施1次；

(5)第18、20天各喷施1次；

(6)第16、18、20天各喷施1次；

第20天喷施后均立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后再进行适温恢复生长一周，以喷水喷施株为对照，以苗干重的变化优化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠喷施时间及次数。

得到最终硫氢化钠最优化高温缓解作用的喷施结果：在济麦22幼苗生长的第16、18、20天各喷施1次0.15毫摩尔每升的硫氢化钠工作液，可显著缓解随后的高温胁迫。

本发明设计的，可获得足量长势均一的小麦幼苗的培养方法，保证了获取的试验材料长势的统一性。近来的研究表明，用含硫化合物可作为植物生长调节剂参与植物的生物及非生物胁迫的逆境应答，如可通过硫氢化钠溶液浸种、浸根处理可缓解植物离子与非离子、干旱、盐、重金属、高温胁迫。在本专利中首次采用了叶施硫氢化钠溶液用于小麦幼苗的高温胁迫试验。

如需要继续进行小麦高温抗性机理研究的试验，则需要对小麦叶片进行取样。

传统取样方法是：按照预先设定好的取样时间梯度，随机选取几株麦苗，将其叶片剪下，装入自封袋，液氮速冻后放入-80冰柜，甚至不经液氮速冻直接放入-80冰柜。这种做法的弊端是：待进行试验相关指标测定时，样品称量过程需将样品从-80冰柜短暂的转移至空气中，完成称量后再放回-80冰柜储存，由于自封袋根本没有保持低温的功能，大量样品会在很短时间内升至0度附近甚至0度以上，如果先后要测定多个指标，则样品可能经过反复冻融的过程，直接导致待测样品中待测物质的非生理性变化，致使数据错误，即使取样时已经按照单次使用量进行小包包装，有时也会由于称重操作过程的不麻利导致已称取好的样品发生冻融现象，可能导致整个试验的失败，影响科研积极性。

在本发明中，小麦叶片的取样过程具体为：

直接将泡沫板上的整株幼苗取下，剪取所需部位叶片样品，用电子天平称称量并记录质量后，卷成约3-3.5厘米长度，并用镊子将其塞入已编号的2毫升或5毫升离心管中后立即用液氮速冻，采用的离心管的管底部需用尖头镊子扎一小孔；待进行小麦高温抗性机理的试验研究时，根据所需样品的质量，挑出对应编号的离心管，直接进行研磨分析，无需再次称量，既保证了即测样品的完整性，也不会导致剩余样品的融化，能最大限度的保证本次试验结果的准确性及剩余样品的再次可用性。

离心管底部扎孔是为了防离心管炸裂：试验中进行指标测定，需将所取样品从液氮中取出时，由于液氮中温度与空气温度的短时间的巨大变化，造成管内气体快速膨胀，炸裂离心管，造成样品浪费，而底部扎孔可快速平衡管内外气压，防止炸管现象的发生。

除说明书所述的技术特征外，均为本专业技术人员的已知技术。

Claims (10)

1.一种研究小麦高温胁迫的试验方法，包括的操作步骤有：幼苗培养、品种选择、硫氢化钠溶液配制、硫氢化钠溶液喷施、硫氢化钠溶液浓度优化、硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化；其中，

幼苗培养的方法为：

(1)选种：去除破损、霉烂、干瘪的种粒，数取一定数目的小麦种子；

(2)清水浸种：将数取的小麦种子置于容器中，且保证小麦种占容器容积不超过1/2，加水浸没种子3至5厘米，然后在负压条件下使种子在水中相对晃动，直至种子的表面完全浸水不再存有气泡，最后用清水清洗小麦种子2至5次；

(3)浸种灭菌：将清洗过的种子倒入三角瓶中，加入1％的次氯酸钠溶液，使之浸没种子0.6至1.5厘米，浸种灭菌时长为8至12分钟；

(4)恒温浸种：用清水冲洗掉种子表面的次氯酸钠溶液后将种子放置在培养箱的白盒中，并向白盒内加入清水至浸没种子0.6至1.5厘米，调节培养箱调至25摄氏度恒温后，黑暗条件下浸种6小时；

(5)催芽；恒温浸种结束后，倒掉培养箱白盒中的水，取出种子，并将种子平铺在条状湿毛巾的中间位置，使两侧毛巾翻过来包盖住种子，然后将包有种子的湿毛巾放入培养箱的白盒里，调节培养箱至30摄氏度恒温，并于黑暗环境中放置18个小时，进行催芽，期间需保证毛巾始终处于湿润状态；

(6)二次选种：催芽结束后，在湿毛巾上直接剔除未露白及外表颜色不一致的小麦种子；

(7)摆种：二次选种后得到的小麦种子，用尖头镊子将其整齐摆放在浮筏上，所述浮筏包括塑料浮漂制成的围框以及缝合在围框内的硬质尼龙纱网，使小麦种子的腹沟向下接触尼龙纱网，粒间距控制在2.5至3.5毫米，行间距控制在0.8至1.2厘米；

(8)催苗：摆种完毕后，将浮筏移至培养箱的发芽盒中，用注射器将60毫升的清水顺着发芽盒的侧边缓慢注入，并覆盖子，培养箱调节至25摄氏度恒温，并置于光照环境中，全光照培养24小时；

然后去掉发芽盒上的盖子后，调节培养箱程序为：

25摄氏度，全光照培养14小时；20摄氏度，全光照培养10小时；

当种子出芽0.8至1.3厘米时，向发芽盒中补充已经经过通气处理的清水1至1.5升，并每两天更换一次清水；

(9)剔苗：自种子出芽1厘米后一直到第8天育苗的期间内，根据麦苗的胚芽鞘颜色、长度，叶片颜色、卷曲程度、有无干叶尖现象，麦苗在群体中的株高状况以及苗的粗细进行综合判断，剔除疑似杂株、畸形苗、过高、过矮及弱苗；

(10)育苗：至第8天后，挑选整齐一致的壮苗，去掉根部残余的种子后，用清水冲洗干净根部残余淀粉后作如下处理：

随机拿取幼苗，将其转移到提前准备好的已经按照试验需求打孔的泡沫板上，每孔1-2株，并用海绵块包裹麦苗的胚芽鞘部位后固定在泡沫板的孔中；随后将带苗的泡沫板转移至外表面涂黑漆的大盒中，用1/2Hoagland营养液培养；

泡沫板在1/2Hoagland营养液中培养1天之后改用Hoagland营养液培养，培养条件为：以24小时为周期，22摄氏度，全光照14小时，15摄氏度，黑暗条件下10小时；

品种选择：

按上述方法顺序，在室内培养出多个品种的20天幼苗后，分别在培养箱中经38摄氏度高温胁迫24小时后，再于适温条件下恢复生长一周，所谓适温条件即24小时内按照22摄氏度光照14小时与15摄氏度黑暗条件下10小时的循环培育处理；在对各品种进行高温胁迫时，均需留有相应的对照组，不进行高温胁迫处理；

恢复生长一周后测定苗干重及苗干重抗逆系数，综合选取苗干重降低明显的品种作进一步试验处理，将此处将得到的该品种命名为“品种A”；

硫氢化钠溶液配制：

用去离子水分别配制0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35毫摩尔每升的硫氢化钠溶液，配制的硫氢化钠溶液含0.2％Tween20，且各种硫氢化钠溶液均应现用现配；

硫氢化钠溶液喷施：

先将泡沫板上最左和最右各一列视为保护列，不计入任何试验；随后按照试验中的具体设计，将泡沫板纵向截成几部分，分别用于外源硫氢化钠溶液的喷施处理；喷施处理过程中，用小喷壶对准叶片区域均匀喷雾处理，以叶片密布液滴为准，各种浓度的硫氢化钠溶液对应的喷施面积相同，且喷施量一致；喷施完毕后，用清水缓慢冲洗掉透过叶片沾染到泡沫板上的硫氢化钠溶液；最后将泡沫板按照顺序重新放回原位，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时；

硫氢化钠溶液浓度优化：

按照上述幼苗培养的方法培养出“品种A”的幼苗后，在第20天时按照上述硫氢化钠溶液喷施方式，分别喷施上述所述各种浓度的硫氢化钠溶液后，立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后进行适温条件下恢复生长一周，以0浓度的硫氢化钠溶液喷施株为对照，以苗干重的变化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠溶液浓度；

硫氢化钠溶液喷施时间及次数优化：

对按照上述幼苗培养的方法培养出的“品种A”幼苗，选用上述方式得到的最佳的硫氢化钠浓度，分别以以下6种方式进行喷施处理：

(1)喷水对照；

(2)第20天喷施1次；

(3)第19、20天各喷施1次；

(4)第18、19、20天各喷施1次；

(5)第18、20天各喷施1次；

(6)第16、18、20天各喷施1次；

第20天的喷施后均立即进行38摄氏度高温胁迫处理24小时，随后再进行适温恢复生长一周，以喷水喷施株为对照，以苗干重的变化优化选择具有缓解作用的最佳硫氢化钠喷施时间及次数。

2.根据权利要求1所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：

在所述幼苗培养方法的清水浸种步骤中，所使用的容器为负压管；

所述负压管包括负压管体、螺纹套筒、拉杆及盖帽；

所述负压管体的一端开口，另一端连通注水管；所述螺纹套筒与所述负压管体螺纹配合；

所述拉杆的一端设置橡胶活塞且使橡胶活塞的外径与负压管体的内径一致，所述拉杆的另一端设置环形凸缘，使环形凸缘的外径不小于所述螺纹套筒的内径；

所述盖帽螺纹连接在所述注水管的端口处且在盖帽的中心设置与所述注水管内腔配合的橡胶塞；

将选取的小麦种子置于倒入负压管体的容腔后，将拉杆设置橡胶活塞的一端插入负压管体内并使橡胶活塞下端与小麦种子上部之间保持3至5厘米的垂直间距，然后使注水管管口朝上并通过注水管向负压管体的容腔加水；

加水完毕后，将所述盖帽连接在所述注水管上，然后旋转所述螺纹套筒使螺纹套筒将拉杆向外顶出，使负压管体内形成负压，来对负压管体内的种子和清水进行负压处理，在负压处理期间不断轻轻上下翻转负压管体。

3.根据权利要求1或2所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，在用1％的次氯酸钠溶液浸种灭菌的8至12分钟期间，用注射器反复吸打次氯酸钠溶液。

4.根据权利要求3所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的育苗步骤中，宜使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度。

5.根据权利要求3所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。

6.根据权利要求1或2所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的育苗步骤中，宜使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度。

7.根据权利要求6所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。

8.根据权利要求1或2所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。

9.根据权利要求1或2所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：还包括小麦高温抗性机理试验，其中小麦高温抗性机理试验包括小麦叶片取样过程，具体为：

直接将泡沫板上的整株幼苗取下，剪取所需部位叶片样品，用电子天平称称量并记录质量后，折成约3-3.5厘米长度，并用镊子将其塞入已编号的2毫升或5毫升离心管中后立即用液氮速冻，采用的离心管的管底部需用尖头镊子扎一小孔。

10.根据权利要求9所述的一种研究小麦高温胁迫的试验方法，其特征是：在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，在用1％的次氯酸钠溶液浸种灭菌的8至12分钟期间，用注射器反复吸打次氯酸钠溶液；

在所述幼苗培养方法的育苗步骤中，宜使海绵块的宽度小于胚芽鞘的长度；

在所述幼苗培养方法的浸种灭菌步骤中，Hoagland营养液每2天一换，每天早晚分别通入空气2小时。