CN105555294A - 可溶性Fc受体的高度浓缩制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可溶性Fc受体的新型制剂，特别涉及包含高浓度的可溶性FcγRIIB受体的制剂。本发明进一步涉及所述制剂作为药物配混物在治疗自身免疫性疾病、感染和其它涉及免疫系统的病症中的用途。

Description

可溶性Fc受体的高度浓缩制剂

技术领域

本发明涉及可溶性Fc受体的新型制剂，特别涉及包含高浓度的可溶性FcγRIIB受体的制剂。本发明进一步涉及所述制剂作为药物组合物在治疗自身免疫性疾病、感染、肿瘤和其它与免疫系统相关的病症中的用途。

背景技术

人可溶性FcγRIIB是一种在治疗特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮和其它自身免疫性疾病中具有前途的候选物质。人可溶性FcγRIIB是在过去10至15年中已经开发的多种可溶性抗体受体中的一种。

WO00/32767记载了可溶性Fc受体(sFcR)，其仅由受体的细胞外部分组成并且没有被糖基化。由于这些蛋白没有跨膜结构域和信号肽，它们以可溶性形式存在并且不与细胞结合，这往往是Fc受体(FcR)的情况。此外，WO00/32767中记载了sFcR可以被重组产生，由于它们能够与抗体的Fc部分相结合而不干扰免疫系统的其它组分，因此sFcR已被提议用于治疗自身免疫性疾病。WO00/32767还记载了某些sFcR的晶体结构，并记载了发现下述物质的可能性：所述物质借助于这些晶体结构而抑制IgG与sFcR的相互作用。所述晶体结构的阐明使得能够通过使用如可得到的计算机程序筛选数据库或计算机辅助药物设计，寻找出这种抑制剂。

WO03/043648中所限定的发明进一步阐述了WO00/32767的发现，并提供了特别针对疾病(例如多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA))以及具有升高水平的自然杀伤(NK)细胞的疾病的治疗方法。虽然所述受体在原核生物中重组产生并因此未被糖基化，WO03/043648的发明人意外地发现，尽管预期非糖基化的蛋白的溶解度不高，但所述受体可以以可溶性形式的sFcγR的高达50mg/ml的相对高的浓度被纯化。

WO00/32767、WO03/043648和其它出版物提出了FcR在免疫系统的防御反应中起重要作用。当病原体进入血液循环后，它们被免疫球蛋白(也称为抗体)结合。由于对病原体的免疫反应是多克隆的，大量抗体产生并与病原体结合，导致免疫复合物(IC)的形成。随后IC被免疫系统专门的效应细胞(如吞噬细胞或巨噬细胞)吞噬，从而自血液循环中移除。胞吞是由抗体的Fc-部分与在前述效应细胞上FcR的结合介导的，其中所述抗体的Fc-部分与病原体一起形成IC。免疫系统的其它效应细胞，如自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞在其细胞表面也携带FcR，基于IC的结合，所述FcR释放支持免疫反应的储存介质如生长因子或毒素。

这些效应细胞的FcR也作为信号转导分子发挥作用，所述信号转导分子在体液免疫反应过程中特异性地结合至多种同种型的免疫球蛋白。此外，在天然杀伤细胞上表达的FcR在抗体包被的靶细胞的破坏中发挥基础性作用(“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”，ADCC)。

然而，在病原体防御中，除FcR的正面效应外，也会发生由于患者自身抗体的存在而引起的过度反应，这种过度反应会导致免疫系统的不希望有的的刺激，这种刺激特别体现为炎性疾病或自身免疫性疾病。这种针对机体自身物质的免疫反应仍是一个主要的医学难题，并且尽管有许多治疗自身免疫反应的方法，但是这些方法在每一个患者中并非等效的。

FcγR家族的所有成员(即对IgG型抗体具有特异性的FcR)都为完整的膜糖蛋白，其具有与免疫球蛋白有关结构域的C2-组相关的胞外结构域，具有单一跨膜结构域和长度可变的胞质内结构域。已知三种Fcγ受体形式，称为FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在本发明的优选实施方案中特别关注FcγRII(CD32)。

FcγRII蛋白是仅结合IC中复合IgG的40KDa完整的膜糖蛋白。这些受体是最广泛表达的FcγR，它们存在于所有造血细胞包括单核细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和血小板上。存在三种人FcγRII基因(FcγRII-a、FcγRII-b、FcγRII-c)，这三种基因结合聚集体或免疫复合物中的IgG。

炎症是一个自体白细胞对外源物质如细菌和病毒的感染进行反应的过程。炎症通常表现为受影响的组织的疼痛、肿胀、发热和发红。被称为细胞因子的效应物和前列腺素控制这一过程，且它们以有序且自限制的级联被释放至血液或受影响的组织。所述效应物的释放增加了损伤或感染区的血流量。一些效应物会导致体液向组织中泄露，进而引发肿胀。这一保护过程可能刺激神经并引起疼痛。当这些变化在相关区域中发生一段有限的时间，其对身体是有益的。

在自身免疫性疾病中，患者的免疫系统已经失去了识别自体(“自身”)和外源蛋白的能力。因此，由于“自身”蛋白是持久产生并被识别为外源的，会产生这样的抗体：所述抗体识别“自身”蛋白并形成免疫复合物，该免疫复合物持续激活免疫系统。这种慢性病症可持续数年最终导致严重的器官损伤，且有可能导致患者的死亡。存在许多以多种方式影响机体的不同的自身免疫性障碍。例如，患有多发性硬化症的个体的大脑受到影响、患有克罗恩病(Crohn'sdisease)的个体的肠道受到影响，而患有类风湿性关节炎的个体的滑膜、骨和各种关节软骨均受到影响。随着自身性免疫障碍发展，将会导致一种或多种类型的自身组织损毁、器官的异常生长或器官功能的改变。自身免疫性障碍可能影响单一器官或组织类型，或可能影响多个器官和组织。通常受到自身免疫性障碍影响的组织和器官包括红细胞、血管、结缔组织、内分泌腺(如甲状腺或胰腺)、肌肉、关节和皮肤。

炎性障碍和/或自身免疫性障碍的实例包括但不限于，原发性免疫性血小板减少症(ITP)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、糖尿病、寻常天疱疮(Pemphigusvulgaris)、桥本甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、自身免疫性内耳病、重症肌无力、恶性贫血、阿狄森氏病(Addison'sdisease)、皮肌炎、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、皮肌炎、多发性硬化症、莱特尔氏综合征(Reiter'ssyndrome)、格雷夫斯病(Gravesdisease)、自身免疫性肝炎、家族性腺瘤息肉病和溃疡性结肠炎。

根据FcγR的功能是活化还是抑制可将其分为两大类。活化受体与具有共有序列Y-X₂-L/I-X_6-12-Y-X₂-I/L的细胞质的16个氨基酸的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)有关(Barrow和Trowsdale,EuJI,2006,36:1646-1653)。例如，可在FcγRIIA中发现该基序。另一类FcR是抑制受体，该类受体在受体细胞质部分中含有具有共有序列S/I/V/L-X-Y-X₂-I/V/L的6个氨基酸的抑制基序(ITIM)(Barrow和Trowsdale,EuJI,2006,36:1646-1653)。这类抑制FcR的一个实例是FcγRIIB。

FcγRIIB(FcγRIIB)具有两个抑制活性。FcγRIIB的一个抑制活性是基于ITIM-基序的，该活性在FcγRIIB连接至ITAM携带受体(即FcγRIIA)时发生，从而导致对ITAM触发的钙动员及细胞增殖的抑制。FcγRIIB的第二个抑制作用涉及受体的同源聚合(FcγRIIB成簇)，该同源聚合将促凋亡信号传递至细胞质内。该促凋亡信号仅在B细胞中有报道，并且可被FcγRIIB与B细胞受体(BCR)的连接所阻断(JVRavetch,S.Bolland,AnnuRev.Immunol.2001；19:275-90)。

如上所述，在WO03/043648中已经公开了sFcγRIIB在药物制剂中的用途，其中如注射至患者体内的合理体积的治疗溶液中可包含相对大量的Fcγ受体。由于可溶性Fcγ受体可结合至抗体而不影响免疫系统的其它组成部分，因此可溶性Fcγ受体，尤其是FcγRIIB已经被建议用于自身免疫性疾病的治疗。因此，可溶性Fc受体能够中和血流中的抗体，这尤其对自身免疫过程具有衰减作用。已经在WO03/043648中提及的可能的启示包括用于治疗多发性硬化症(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)以及用于具有升高水平的NK细胞的疾病的可溶性Fcγ受体，以避免之前对于所述疾病采用的疗法的副作用。

WO03/043648的教导的重点在于所发现的这样的事实：可溶性Fc受体可用于形成含有浓度高达50mg/ml的可溶性受体的水性溶液。对于某些用途而言，上述活性试剂的浓度可满足需求。然而，近期的研究证明显著大于1mg/kg患者体重的治疗剂量的sFcR(如sFcγRIIB)对成功治疗自身免疫性疾病是有益的，甚至是必需的。

药物的皮下给药被认为是一种有效的、相对简单且不繁杂的向患者递送活性试剂的方法。与需要更复杂医疗设备且多数情况下需要在医生办公室或诊所给药的静脉输注相比，皮下给药可以简单地施用，甚至由患者本人完成。皮下给药还会导致延迟起效，即增长的半衰期及达到最大浓度的时间。同时还发现，经皮下给药降低了最大血药浓度。上述这些作用基于患者的皮下给药，活性试剂从该皮下位置转运至血流。通常认为大于约16-20kDa的蛋白质主要被淋巴系统摄取，这对FcγR来说可能是一个优势，因为靶标B细胞群也在淋巴系统中成熟并驻留(Porter,C.J.H.和Charman,S.A.(2000),J.PharmSci.89,297-310)。

然而，皮下给药途径每次施用的注射体积优选地限制为1.0ml至约1.5ml(Gatlin,L.A.和Gatlin,C.A.B,(1999),Gapta,P.K.&Brazeau,G.A.,eds.,InterpharmPress,Denver,pp.401-425)。因此认为WO03/043648中的水性sFcγR溶液不能用于皮下给药。相反，根据这一文献的教导不得不预期，对于足够高浓度的受体，水性溶液中的受体会沉淀且所述受体的不被希望大的晶体会形成，这相应会引起针的堵塞和/或在注射部位的疼痛。因此，除去所有的预期的优点，皮下给药似乎不是一个有前途的治疗途径，而相反地，静脉注射或输液似乎是唯一可行的递送方法。

发明内容

因此，本发明的一个目的是向患者提供复杂程度和负担较小的Fc受体的给药方法和条件，以及提供可溶性Fc受体、尤其是可溶性FcγRIIB的水性制剂，该水性制剂含有足够高浓度的受体从而使皮下治疗方案可用于自身免疫性疾病。

本发明的进一步目的是提供高度浓缩的可溶性Fc受体的此类水性制剂，该制剂为随时可用(ready-to-use)的形式，其在常规药物储存条件下稳定超过24个月，或者，该制剂为允许长期储存且在皮下施用之前允许简便、直接地调节和重构的形式。

根据本发明包含在水性缓冲溶液中的可溶性Fc受体(sFcR)的制剂可以达到上述目的，其中所述Fc受体的浓度大于50mg/ml，且所述制剂包含生理上可接受的缓冲物质。

在本发明的研究过程中，惊奇地发现，与之前的预期相反，可提供具有甚至高于70mg/ml、优选地超过150mg/ml浓度的溶解于适宜缓冲溶液中的可溶性Fc受体，这也是第一次可以采用上述浓度提供用于皮下给药的药物组合物形式的sFcR。作为肠胃外的给药形式，皮下给药比静脉给药形式更简便且更易操作。如上文所述，即使患者本人也可实施皮下给药。

皮下给药需要一个短且通常细的套管。本发明的高度浓缩的制剂提供完全溶解的且均质形式的sFcR，并且所述sFcR处于允许使用所述细套管的可接受的粘度，或者作为包含足以通过所述细套管的小晶体的晶体悬浮液。因此，既显著增加患者的便利性又能实现通过皮下途径的受体给药。

如下文所述的本发明的制剂使提供可溶性FcR，尤其是提供浓度高至最大值的可溶性FcγRIIB成为可能，该最大值主要受由于Fc受体的高浓度而使溶液粘度增加的限制。当选择合适的缓冲物质并调节适宜的渗透压(osmolality)时，在生理pH下的稳定的220mg/ml或更高的sFcγRIIB可包含在本发明的框架内。

根据本发明所采用的生理上可接受的缓冲物质是适宜溶液的医药用途的常用缓冲剂。然而，在本发明的框架内，发现基于使用的缓冲物质，溶液的pH值对Fc受体的溶解度有很大影响。根据选择的缓冲剂，不得不将pH值调节在一个确定的范围内，特别是将pH值调节至一个对于获得所需Fc受体溶解度的特定的最佳值，尤其是当目的为提供一种不含任何晶体sFcR的制剂时。

进一步发现，由于蛋白质中带正电荷和负电荷的氨基酸的存在，因此蛋白质本身能够充分地作为缓冲剂。因此，例如通过根据蛋白质氨基酸侧链的pK-值选择合适的pH值，只要适宜量的蛋白质在溶液中存在从而作为生理可接受的缓冲物质，就可以无需添加单独的缓冲物质。

在本发明的优选的实施方案中，本发明的制剂包含组氨酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂或磷酸缓冲剂中的一种作为缓冲物质。然而，特别优选地，采用组氨酸或柠檬酸缓冲剂来制备所述制剂。在这两种情况下发现，在这些缓冲溶液中pH值的调节允许Fc受体的溶解度进行调节(adaption)，从而可以溶解高浓度的Fc受体，但是根据使用的缓冲物质，通过增加或降低pH值也会引起结晶。这种仅通过pH值的调节在sFcR的可溶和晶体形式之间变化的可能性表明，鉴于调节性在药物组合物的适用性、保存和贮藏稳定性方面具有相当大的优势。

例如，在上市许可程序中，需要证明药物具有足够的贮藏稳定性。在这种情况下，请求上市许可的一方包括在5℃的温度下至少12个月的贮藏稳定性数据是必需的。然而，在相应的条件下达到超过24个月的贮藏稳定性是可取的且有利的，同时在所提及的贮藏条件下，时间期满后仍需大量的、优选90％的药物试剂以活性形式存在。

在这种背景下，本发明的制剂显示出特别的优点。例如，本发明的制剂可提供液体形式的高度浓缩的sFcR制剂，该制剂中仅包含溶解的Fc受体并显示出高的贮藏稳定性。

此外，可将本发明的制剂进行冷冻干燥从而提供固体贮藏形式。与液体制剂相比，该种固体形式甚至可能显示提高的贮藏稳定性。因此，该种制剂是本发明的又一主题。

可以采用本领域技术人员已知的用于冻干蛋白质的任何适宜的方式来进行冷冻干燥。优选地，采用尽可能温和的条件从而避免蛋白质的降解。

对于固体形式，可以通过添加注射用水、盐水或缓冲水性溶液简单地恢复为随时可用的液体制剂，从而再次提供完全溶解形式的Fc受体，或者可选择中间步骤，在所述中间步骤中根据需要调节溶解度。

本发明的另一主题是本发明制剂的浓缩形式。该种浓缩形式可例如通过以下方式获得：除去部分液体至溶解度限值以下，这导致制剂包含至少一些结晶的受体。同样，由这种制剂，通过加入注射用水、盐水或缓冲水性溶液至活性sFcR的所需浓度，特别是至其中sFcR以完全溶解形式存在的浓度，sFcR可被重构为随时可用的液体制剂。

由于根据本发明制剂中的Fc受体溶解度的pH依赖性，所述制剂提供如下另外的优点：可以完全通过调节pH可实际引起Fc受体的结晶并(如沉淀或离心后)可以获得Fc受体的浓缩的晶体混悬液。由此可得到的晶体，特别是根据结晶条件可得到的晶体，可以非常小(微晶)。结晶越快，得到的晶体越小。与现有技术不同，本发明实现了溶解的sFcR向蛋白质微晶的快速且几乎定量地转化，且反之亦然，因此，本发明允许调整相应溶液和制剂的溶解性质。这进一步可以确保活性剂的优异的贮藏稳定性，特别是确保该活性剂仅需很少的贮藏空间，然后所述活性剂可以通过溶解在具有合适pH值的适宜缓冲水性溶液中转换为全部或主要可溶的形式。例如，这可以在马上作为药物应用之前通过将浓缩晶体混悬液与合适的缓冲剂混合来实现。或者，由于本发明提供了将受体转化为微晶(即小至足以通过套管或细针的晶体)的方法，因此，微晶混悬液或制剂可直接通过皮下应用施用。与高度浓缩的液体制剂相比，该种微晶混悬液的粘度要低很多且其不随蛋白质浓度的增加呈现指数增长。

基于本发明的目的及以上描述本发明的上下文中所用，当晶体直径的平均尺寸大于500μm，Fc受体被认为是“晶体”，而微晶形式包含直径尺寸等于或小于500μm的微晶。

本发明能够以一种前所未有的方式提供不同形式的、高浓度的适于立刻或未来医药应用的可溶性Fc受体。如上文所示，这可以以随时可用的溶解形式或固体形式(例如自该种溶液获得的冷冻干燥的形式)或通过pH值调节沉淀的微晶形式实现，所述微晶形式之后可通过复溶来重构，从而得到其中在所需pH值的合适缓冲溶液中以高浓度包含Fc受体的制剂。

在本发明的优选实施方案中，本发明的制剂包含作为Fc受体的sFcγ受体。对于治疗自身免疫性疾病的可能性，需考虑sFcγRII受体，特别是sFcγRIIB。因此，一个特别优选的本发明的制剂包含在具有适宜缓冲物质的药学上可接受溶液中的可溶性FcγRIIB受体。

基于本发明的目的，FcγRIIB受体具有如现有技术中所述的序列，所示现有技术特别是WO00/32767和WO03/043648或特别提及FcγRIIB、尤其是sFcγRIIB的其它文献。此外，该术语意在涵盖可能不同的受体形式，特别是N-末端部分不同的受体形式。一种特别优选的sFcγRIIB蛋白示于SEQIDNO:1。该序列在N-端包含甲硫氨酸残基，该残基是例如原核生物表达所必需的，但稍后通过细菌机制从产生的蛋白质的主要部分中切除。因此，根据SEQIDNO:1的缺乏N-末端甲硫氨酸的蛋白以及具有和不具有N-末端甲硫氨酸的蛋白混合物都涵盖在本发明中。此外，根据细菌产生菌株的生产过程和条件，在N-末端的五个氨基酸中可发生其它改变。如，除了甲硫氨酸外，其之后的残基也可被切除，或者甲硫氨酸可被替换为其它氨基酸如正亮氨酸。因此，所有这些在N-末端不同的和源自使用编码SEQIDNO:1氨基酸序列的DNA序列的生产过程的蛋白质的混合物都被sFcγRIIB的当前定义、特别是被术语husFcγRIIB所涵盖。

在进一步优选的实施方案中，只要FcγRIIB蛋白与SEQIDNO:1的蛋白具有至少90％的同一性，则认为该种FcγRIIB蛋白涵盖在本发明中。为了测定序列的同一性，通过以提供氨基酸的最大限度对应的方式比对序列进行比较。特别优选地是，所要求保护的蛋白质中的区别仅存在于前10个氨基酸中，最优选地，存在于前5个氨基酸中。尤其优选的是，所述蛋白质具有至少95％的同一性，其区别存在于SEQIDNO:1的前5个氨基酸中，其中所述氨基酸中的区别基于删除、置换和添加中的至少一者。

在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的制剂包含sFc受体，特别是包含sFcγRIIB受体，所述受体的浓度大于60mg/ml，更优选地大于60-80mg/ml，进一步优选地大于80mg/ml，甚至更优选地大于100mg/ml，特别优选地大于150mg/ml，和最优选地甚至大于200mg/ml。

本发明的制剂可选地进一步包含药学上可接受的物质，如用于溶液离子强度的调节和/或促进其中所含受体蛋白质的溶解性和稳定性。该种物质是本领域技术人员已知的。对于离子强度的调节，本发明的制剂可选地包含盐，优选地包含NaCl。对于蛋白质的稳定，可采用多元醇，特别是糖和糖醇如蔗糖或甘露醇。此外，本发明的制剂优选地包含适用于药学应用的去污剂，如聚山梨酯。

优选地，本发明的制剂包含0.1μM至300mM的量的缓冲物质。在更优选的实施方案中，生理上可接受的缓冲剂以0.1至150mM、特别是1至50mM的量存在。

对于渗透压(等渗性)的调节，至少只要制剂意在用于向患者直接给药，盐如氯化钠的量为调节优选的生理渗透压时是适宜的。溶液的渗透压可以在很宽的范围内调节，其可被设定为10mOsm/kg至大于600mOsm/kg而不会对Fc受体的溶解度产生显著影响。

盐，优选NaCl，以约0至250mM、优选5至200mM和最优选10至50mM的浓度存在于制剂中。

多元醇如蔗糖不必须包含在本发明的制剂中，但是，在优选的实施方案中，其以至少1.0％、更优选地以至少2.0％的量存在。优选的多元醇的量的上限为约25％，更优选地为15％，和最优选地为8％。糖在溶液中稳定蛋白质是已知的。

盐和糖需要平衡来调节制剂的渗透压，优选地调节为等渗。制剂中包含的糖越多，可添加的盐就越少，反之亦然。

本发明上下文中优选采用的去污剂的适宜量为0.001-0.1％，特别是0.005-0.05％。

如上文提到的，在本发明的框架内获得的研究结果允许以下述方式来调节可溶性Fc受体、尤其是sFcγRIIB的溶解条件：对于大于50mg/ml的Fc受体含量，所述方式使得向患者以完全溶解形式或微晶形式给药的受体的预定供给成为可能。上文还提及，对于向患者给药，提供完全溶解形式或至少可转化为溶解形式的尽可能高的浓度通常是有利的。

对于包含微晶sFcR的制剂，其向患者给药也是可能的，其中该微晶在给药后完全溶解并且得到的活性物质具有其生理作用。对于其它的施用和贮藏，保持受体的结晶形式可更具有优势，其中该种形式的受体针对降解和由降解引起的失活特别稳定。

因此，本发明优选的实施方案是完全液体的制剂，该制剂中的受体以溶解形式或适宜的微晶形式存在。

本发明的一个特别优选的制剂包含在柠檬酸缓冲溶液中的可溶性FcγRIIB受体，且该制剂具有等于或大于6的pH值。优选地，在6.0-7.5的范围内调节pH值。在上述具有生理pH值的柠檬酸缓冲溶液中，FcγRIIB受体以大于140mg/ml的浓度可溶。由于该制剂具有生理pH值，其还具有如下优势：该制剂可直接施用于患者而不会引起副作用，如在给药部位的疼痛。

在另一个优选的实施方案中，在具有5.2-5.9的pH值的组氨酸缓冲溶液中包含可溶性FcγRIIB受体。当采用组氨酸缓冲剂时，sFcγRIIB以超过100mg/ml的浓度可溶。

当pH约为6.0时，受体的溶解度仍相对较高，但是此时晶体沉淀开始形成，而在更高pH时，仅观察到受体的显著降低的溶解度。

上述两种制剂都能实现溶解性sFcγRIIB受体的高浓度，这对于提及的柠檬酸缓冲制剂和组氨酸缓冲制剂都可显示能达到高达约220mg/ml的粘度限制方案(参见所附实施例)。

本发明的制剂进一步具有良好的冷冻/解冻稳定性，并且在2℃-8℃的降低的温度下还具有良好的稳定性。甚至在室温下这些溶液的稳定性也是良好的。

这两种溶液的可用性体现在直接向患者施用和在冷冻干燥或高度浓缩的制剂的生产中，所述制剂可包含晶体并便于可由患者直接重构的注射溶液的贮藏或生成。

如上文所提及的，对于直接给药，具有生理pH值的柠檬酸缓冲溶液是特别优选的。

本发明的一个特别优选的进一步主题是包含晶体形式的受体的制剂。优选地，该种制剂体现为具有pH值5.2-5.9的柠檬酸缓冲悬浮液或者体现为具有pH值6.0-7.5的组氨酸缓冲悬浮液。例如，优选地所述悬浮液可用作贮藏-稳定形式，当向患者给药时，通过pH的调节可将所述悬浮液转化为包含高浓度溶解的受体的制剂。此外，为了获得高度浓缩的晶体悬浮液，还可将所述混悬液浓缩或通过溶液的分离从所述混悬液中获得受体。通过在合适的缓冲液中在适宜的pH下重构，所述受体可以恢复为完全溶解的形式。

所述的本发明的制剂和发现(采用某些缓冲物质，根据pH值可以实现Fc受体的不同的溶解度水平)一方面使能够提供随时可用的向患者皮下给药的注射剂，或另一方面提供包含晶体Fc受体的特别的贮藏-稳定的变体。还提供了所述受体的甚至冻干的或其它的固体形式，通过简单地添加适宜的溶液，所述固体形式可转化为包含高浓度可溶性受体的随时可用的形式。

因此本发明的另一主题是一种药物组合物，该药物组合物包含根据如上所述的本发明的制剂且其中还可存在药学上可接受的赋形剂和/或佐剂和/或载体。在特别优选的实施方案中，这些药物组合物可直接用于可溶性Fc受体的有效量的皮下注射，特别是用于自身免疫性疾病的治疗。

在一个优选的实施方案中，优选地，该药物组合物包含在适宜缓冲物质中和在生理pH值下的足够量的完全溶解的sFc受体。该药物组合物是一种随时可用的药剂并可直接用于患者。所述溶解的可溶性受体可以如容易地被吸收至患者的淋巴循环中并在其中直接起效，或者经血液或体液循环在患者体内转运后起效。

或者，本发明的药物组合物可包含高度浓缩形式的和至少部分为微晶或晶体形式的受体。采用适宜缓冲溶液根据需要稀释该药物组合物，其会再次特别适用于皮下注射有效量的Fc受体。

在以上描述本发明的上下文中已经说明，当晶体直径的平均尺寸超过500μm时，Fc受体称为“晶体”，而微晶形式包含直径尺寸等于或小于500μm的晶体。当考虑向患者直接施用时，不仅可以采用包含完全溶解的Fc受体的药物组合物，包含具有完全或部分微晶形式Fc受体的制剂的药物组合物也具有医药应用价值。这些微晶足够小从而不会堵塞用于皮下给药的针。包含微晶的溶液的应用可以有利于如，活性sFc受体向患者体系中的延迟或持续释放，并且在某些情况下，这种微晶形式甚至可被视为优选的药物组合物。

例如采用常规的浓缩技术如超滤，通过浓缩sFc超出其溶解度来获得包含微晶或晶体形式的Fc受体的本发明的药物组合物。将药物保持为包含一定量的晶体或微晶的液体形式是可能的。代替采用机械浓缩法来获得晶体或微晶，本发明的一个优选实施方案还可以通过将pH调节至所述受体具有显著较低的溶解度的值来使受体结晶。析出的晶体或微晶可自溶液中分离并用于贮藏和随后的重构或直接给药。固体形式的受体制剂贮藏特别稳定，并且保持至少超过24个月的有效性。

在这种情况下，可以以药物试剂盒的形式方便地提供所述药物组合物，所述试剂盒中除了固体或高度浓缩的sFcR外，还包括用于可注射溶液的重构的适宜液体。因此，本发明的另一个主题是一种药物试剂盒，该药物试剂盒包含结晶的或冻干的可溶性Fc受体和在适宜的单独的贮藏单元中用于重构注射溶液的适宜的药学上可接受的液体，如缓冲溶液或简单的水。

若在用于简单混合并很好防止污染的合适装置中提供所述用于重构注射溶液的缓冲溶液和sFcR受体，本发明的药物试剂盒是特别优选的。优选地，该试剂盒包含基于磷酸缓冲剂、组氨酸缓冲剂或柠檬酸缓冲剂的缓冲溶液。对于所述缓冲溶液进一步优选的是调节pH从而为Fc受体提供最佳溶解度。在本发明的一个特别优选的实施方案中，所述缓冲溶液是pH在6以上、特别是pH为6.1至7.5的柠檬酸缓冲溶液；或者是pH在6.0以下、特别是pH为5.2至5.9的组氨酸缓冲溶液。根据本发明的药物试剂盒中最优选地包含柠檬酸缓冲溶液。

包含在药物试剂盒中的缓冲溶液的量根据试剂盒中固体的或浓缩的sFcR的量进行调整。根据sFc受体是需要完全溶解还是需要保留一定量的微晶来选择合适量的液体的相应缓冲剂，并且还需根据本文所提供的关于sFcR溶解度的教导来调整溶液的pH。

本发明的又一主题是本发明的制剂、药物组合物和药物试剂盒在预防或治疗自身免疫性疾病中的用途。更具体而言，本发明旨在用于多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性免疫性血小板减少症和自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的预防或治疗的框架中。此外，所述制剂、药物试剂和药物试剂盒可用于炎性障碍的治疗。本发明的主题使得Fc受体在本文已经描述的或在将来认为合适的那些的所有适应症中的应用成为可能。本发明的制剂和药物组合物及试剂盒特别允许皮下施用，这对患者给药或由患者操作而言是高效且容易实施的。本发明的一个特别优点是实现了特别大量且高浓度的Fc受体给药。

具体实施方式

以下的实施例将进一步阐明本发明及其有益的效果和实施方案。

实施例：适于皮下递送的高浓缩的液体husFcyRIIb制剂的制备

1.材料

下述husFcγRIIB(具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的可溶性人FcγRIIB受体)溶液作为所有实验的初始材料(parentmaterial)：

a)用于输注溶液的husFcγRIIB5mg/ml浓缩物

pH为6.5的5.3mM的NaH₂PO₄、1.94mM的KH₂PO₄、150mM的NaCl、2％(w/v)的甘露醇、0.005％的聚山梨酯20中含5mg/ml的husFcγRIIB。

b)用于输注溶液的husFcγRIIB20mg/ml浓缩物

pH为6.5的20mM的组氨酸、150mM的NaCl、2％(w/v)的蔗糖、1％(w/v)的甘露醇、0.005％的聚山梨酯20中含20mg/ml的husFcγRIIB。

至少使用了以下指明品牌的化学试剂：

2.方法

a)通过紫外/可见光谱测定husFcγRIIB的含量

将样品转移至一个紫外微量比色皿(紫外微量比色皿，Plastibrand,Brand)中并采用相应缓冲剂作为空白用分光光度计(Cary100,Varian)测定吸光度。采用如下公式计算husFcγRIIB的浓度：

husFcγRIIB浓度[mg/mL]＝(A₂₈₀-A₃₂₀)×DF×0.64

DF≡稀释因子

b)通过阳离子交换色谱的husFcγRIIB缓冲剂交换

用pH6.5的10mM柠檬酸/NaOH准确稀释1000-1800mg的husFcγRIIB(用于输注溶液的husFcγRIIB5mg/ml浓缩物)至电导率达到5.0±0.1mS/cm。将稀释的蛋白质过滤(0.2μm的Durapore亲水PVDF膜，47mm，Millipore)后以5.5mL/min装载至以pH6.5的10mM柠檬酸/NaOH、20mMNaCl平衡的57mLSP琼脂糖凝胶HP阳离子交换(CEX)树脂(26×107mm，GEHealthcare；相当于17.5-31.6mg的husFcγRIIB/mL树脂)。结合的蛋白质用200mLpH6.5的10mM柠檬酸/NaOH、20mMNaCl以5.5mL/min洗涤，并用300mLpH6.5的10mM柠檬酸/NaOH中20mM至600mM的NaCl线性梯度洗脱。当OD₂₈₀超过250mAU(AU：吸光度单位)时开始收集洗脱液并在OD₂₈₀降低到200mAU以下时停止收集(光程为1cm，Explorer100,GEHealthcare)。将色谱柱用100mL的1MNaCl再生并用150mL的MilliQH₂O洗涤(超纯水，Millipore公司)，然后在20％乙醇中保存直至再次使用。通过紫外/可见光谱测定husFcγRIIB的含量后，将洗脱液过滤(Millex33mm,0.2μM的Durapore亲水PVDF(聚偏二氟乙烯)，都来自Millipore公司)，分装，在液氮中快速冷冻并贮藏在≤-70℃下直至使用。

通过洗脱液的平均电导率与10mM柠檬酸/NaOH、20mMNaCl中和在10mM柠檬酸/NaOH、600mMNaCl中测得的电导率之间的相关性计算NaCl含量。

类似地，采用10mM组氨酸/HCl作为缓冲物制备组氨酸缓冲的husFcγRIIB。

c)pH稳定性筛选

采用适宜的储备液(stocksolution)将pH6.5的20mM组氨酸、324mMNaCl中的浓缩的husFcγRIIB溶液调节至0.5mg/mLhusFcγRIIB、20mM组氨酸、150mMNaCl、2.5X宝石橙(DMSO中5000X，MolecularProbes^TM,Invitrogen)。根据使用0.2MHCl或0.2MNaOH的实验滴定曲线将所述溶液的pH调节到pH4至pH12。将40μL的所述溶液在密封的96孔半区域孔板(μclear，黑色，中度结合；GreinerBioOne)中于25℃下培养3h，然后用于宝石橙荧光(激发波长485nm，发射波长590nm，增益60，滞后时间0μs，积分时间40μs；TECANspectrofluorplus)分析。

d)高浓缩制剂的制备

通过用合适的缓冲剂(pH6.5的10mM柠檬酸或10mM组氨酸)的稀释来调节组氨酸或柠檬酸缓冲的husFcγRIIB中所需的NaCl含量(初始浓度约为200-300mMNaCl)，随后超滤(Vivaspin20,5kDaMWCO,Sartorius)。为了保证经处理的体积小，所述过程总共重复3次。经最后稀释后，测定pH(pH-计HI8314，pH-电极HI1217，Hannainstruments)，用合适的缓冲剂中的0.2MNaOH或0.2MHCl调节pH，从而浓缩蛋白质溶液。一式三份，采用紫外/可见光谱测定husFcγRIIB的含量，用合适的缓冲剂调节husFcγRIIB的浓度并过滤溶液(UltrafreeMC,0.2μmDurapore亲水PVDF，Millipore)。

e)384孔板中husFcγRIIB溶解度筛选

采用30μL每孔，在384孔板(μclear，白色，无结合，GreinerBioOne)中评估高浓缩的husFcγRIIB溶液的溶解度与缓冲物、pH、盐浓度和糖/多元醇浓度之间的关系。通过向每个孔中直接添加过滤的储备溶液来制备最终制剂。可采用以下储备溶液：在pH7.0的10mM的柠檬酸或pH5.5的10mM组氨酸中含100–195mg/mL的husFcγRIIB、1.5MNaCl和30％(w/v)蔗糖+15％(w/v)甘露醇。向每一溶液提供0.01％(w/w)聚山梨酯20和根据上述筛选提供10-50mM的NaCl。

用0.5M-0.75MHCl或NaOH调节每一孔的pH。假定husFcγRIIB(pKa＝6.00)的所有九个组氨酸残基都提供额外的缓冲能力，根据理论滴定曲线计算所需的酸或碱的量。将板离心(500·g,1min)，然后用胶带密封(微量胶带，permacel,neo-lab)并贮藏在5±3℃下的黑暗中。

采用光学显微镜(Axiovert25f,CarlZeiss)对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度(arbitraryscale)排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的不完整层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的完整层(孔被完全覆盖))。

考虑到溶解的盐、糖和蛋白质，根据如下公式计算每一制剂的渗透压：

${\mathrm{\ξ}}_m=\underset{i}{\Σ}{v}_i{m}_i{F}_{m,i}$

其中，ν_i是第i个溶质的一个分子解离所形成的颗粒数，m_i是第i个溶质的摩尔浓度。为了简化，每一溶质的摩尔渗透系数F_m,i设定为等于1。

f)husFcγRIIB的小规模结晶

在1.5mL的聚丙烯反应管中，将10μL-450μLpH5.5的10mM组氨酸、10mMNaCl、0.01％聚山梨酯20中含50-140mg/mLhusFcγRIIB用合适的稀释剂稀释至10mM组氨酸、10mMNaCl、0.01％聚山梨酯20中含40mg/mLhusFcγRIIB。通过添加4.38-6.23Vol％(添加稀释剂后的最终体积)的0.3MNaOH调节pH至6.5-7.2。假定husFcγRIIB(pKa＝6.00)的所有九个组氨酸残基都提供额外的缓冲能力，根据理论滴定曲线计算所需的酸或碱的量。

g)差示扫描荧光法

类似于上文2.e)中所述的程序，在1.5mL的试管中制备包含0.5mg/mLhusFcγRIIB的各制剂120μL。采用合适缓冲液中的200X储备溶液，添加宝石橙(DMSO中5000X，MolecularProbes^TM,Invitrogen)至终浓度为2.5X。各制剂的30μL一式三份被转移至孔板(MicroAmp96孔光反应板，AppliedBiosystems)中，然后将板用胶带密封(MicroAmp光学胶膜，AppliedBiosystems)。将板以1℃/min的斜率进行自19℃至90℃的升温，并记录在610nm处的荧光发射(7300实时PCR系统，AppliedBiosystems)。荧光随时间而被差异化，计算样条曲线(spline)，并且第一次测得的最大温度记为husFcγRIIB的熔解温度(meltingtemperature)(Origin8.0,OriginLab)。

h)384孔板中的浊度筛选

类似于上文2.3)中所述的程序，在1.5mL的试管中制备husFcγRIIB制剂。30μL的各制剂一式两份被转移至384孔板(μclear，白色，无结合，Greiner)中，然后将该板用胶带(微量胶带，permacel,neo-lab)密封后置于恒温箱中。作为对照，制备相应的安慰剂溶液。在360nm处测定浊度(Spectrafluor，带通滤片360/35nm，3次闪光，Tecan)。为了避免由于水凝结而损坏测量，将读板器预加热至检测温度。

i)通过压降测定的动态粘度

通过测定随着液体流经流道的压降来确定包含husFcγRIIB的制剂的动态粘度(m-Vroc，Rheosense)。对于每次测定，用200μL的移液管将100μL的制剂加于100μL的气密注射器(Hamilton)的筒中。将注射器安装到流变仪上并在20℃下以50μL/min的流量注射80μL。

j)定量的聚山梨酯20的测定

采用基于Brown和Hayes,(1955)Analyst80,755-767首次描述的比色法改进的方法测定聚山梨酯的含量。在1.5mL的聚丙烯管(VWR)中用500μL的乙酸乙酯萃取500μL的待分析溶液3次。为了加速相分离，将管离心(20′000·g,5min,25℃)。将有机的上清液收集在HPLC小瓶(ND9，螺纹，锥形底和PTFE螺帽，VWR)中并将溶剂蒸发(25℃,10mbar,0.5h-1h)。将残留的固体悬浮于800μL的试剂溶液(水中含100mMCo(NO₃)₂、2.63MNH₄SCN)中，并用150μL的CHCl₃萃取。将100μL的CHCl₃萃取物转移至石英紫外微量比色皿(Hellma)中，测定200-800nm的光谱(8453二极管阵列分光光度仪，Agilent)并记录由530nm处的吸光度校正的620nm处的吸光度。采用不含聚山梨酯20的等量溶液的萃取物作为空白。每一样品都一式两份制备。基于在相应缓冲液中自0至0.006％(w/w)聚山梨酯20的标准曲线确定聚山梨酯20的含量。

k)冷冻干燥

制备59个含在5mM柠檬酸、10-25mMNaCl、2-8％(w/v)蔗糖、海藻糖或甘露醇及0.005-0.01％(w/v)聚山梨酯20中的15-120mg/mL的husFcγRIIB的制剂，并将400μL装入1.5mL干净的HPLC小瓶(32×11.6mm，宽口，VWR)中。采用冷冻干燥器Epsilon2-12DFD02(MartinChrist,Osterrode,Germany)对小瓶进行保守的冷冻干燥循环。冷冻干燥过程中的真空度采用MKS电容压力计(MKSCapacitanceManometer)控制。在-45℃下冷冻样品，首次干燥在45℃至15℃、0.12mbar下进行10h，第二次干燥在15℃至20℃、0.12mbar下进行10h。在100-400μL的注射用水中重构冻干产物。通过目视检查、浊度测定和荧光显微术就颗粒形成来分析溶液。简言之，对于荧光显微镜检查，将50μL含husFcγRIIB的溶液置于384孔板(μclear，白色，无结合，Greiner)中，并与5μL的在pH6.7的5mM柠檬酸和10mMNaCl中的2.5X宝石橙(DMSO中5000X，MolecularProbes^TM,Invitrogen)混合。该板在25℃下培养10min，离心(1′000·g,3min)，并用荧光显微镜(Axiovert25f，激发滤光片470/20nm，二色性493nm，发射滤光片503-530nm，CarlZeiss)评估每个制剂的外观。

3.结果

a)高浓缩的husFcγRIIB溶液的pH值范围和缓冲物的限定

采用宝石橙作为展开蛋白存在的指示剂来测定husFcγRIIB的变性pH范围。宝石橙是一种环境敏感染料，当该染料与疏水性结构结合后，其荧光发射显著增强(Layton&Hellinga,2010,Biochemistry49(51),10831-10841)。图1示出了测定变性pH范围的实验结果。因此，在相应的pH下，将20mM组氨酸、150mMNaCl(o)和空白缓冲液(+)中的0.5mg/mL的husFcγRIIB在室温下培养3h。宝石橙荧光的增加表明变性的husFcγRIIB的存在。如图1所示，自pH5.2至至少pH11，husFcγRIIB未展开。

为了预防皮下给药过程中的疼痛，所施用的溶液应当具有在生理范围内的pH。在该范围内缓冲且通常被认为是安全的典型缓冲物包括组氨酸(pka～6.0)、柠檬酸(pKa₃～6.4)和磷酸(pKa₂～7.2)。由于磷酸在冷冻/解冻过程中有促进pH变化的趋势(MacKenzie,1977)，因此其不包括在随后的溶解度筛选中。

在测定蛋白质沉淀的限制性husFcγRIIB浓度的最初尝试中，在10mM组氨酸或10mM柠檬酸及10mMNaCl存在下通过超滤将husFcγRIIB浓缩直至可见的沉淀形成。如表1中所示，组氨酸缓冲的husFcγRIIB在pH5.5至6.0的微酸性范围内显示了增加的溶解度，而柠檬酸作为缓冲物提供的溶解度在围绕pH6.5的近中性pH范围内。综上，在不同的pH下，husFcγRIIB的溶解度很大程度上依赖于所采用的缓冲物。通过显微镜显示沉淀由针状结晶组成。

表1：在低离子强度下，pH为5.5至7.5时，在10mM组氨酸或10mM柠檬酸中的husFcγRIIB溶解度限值(以mg/mL计)。通过超滤将husFcγRIIB浓缩直至溶液变浑浊。在pH为6.0、6.5和7.0时，组氨酸缓冲的husFcγRIIB沉淀，而在pH为5.5和6.0时，柠檬酸缓冲的husFcγRIIB沉淀。沉淀物确定为husFcγRIIB蛋白晶体。

b)husFcγRIIB的结晶

在pH5.5时，组氨酸缓冲的husFcγRIIB保持在100mg/mL以上可溶，并且在低离子强度下通过中和可将其结晶；相反在中性pH时，柠檬酸缓冲的husFcγRIIB保持在100mg/mL以上可溶，并且在低离子强度下通过轻度酸化可将其结晶(表1)。在进一步的试验中，研究了husFcγRIIB的结晶与缓冲液中糖和NaCl的存在及量的关系。在pH6.7的10mM组氨酸(图2a)或在pH5.5的10mM柠檬酸(图2b)中随NaCl和糖(蔗糖:甘露醇为2:1)浓度变化进行husFcγRIIB的结晶。通过超滤将在pH5.5的10mM组氨酸、10mMNaCl中或pH7.0的10mM柠檬酸、10mMNaCl中的husFcγRIIB浓缩至140mg/mL，然后用合适的储备溶液将其稀释至40mg/mL。在组氨酸缓冲的husFcγRIIB的情况下，通过测定在2-8℃下3天后上清液中husFcγRIIB的浓度来测定晶体的产量。在柠檬酸缓冲的husFcγRIIB的情况下，直至第10天也未检测到晶体生长。因此测定了在2-8℃下14天后晶体的产量。每个溶液包含0.01％的聚山梨酯20。

图2显示，与在pH5.5的10mM柠檬酸、10mMNaCl存在下相比，在pH6.7的10mM组氨酸、10mMNaCl存在选husFcγRIIB结晶更容易且晶体产量更高。此外，采用组氨酸作为缓冲物时，氯化钠的浓度由10mM降至5mM使得结晶产量略微增加，但是当采用柠檬酸缓冲剂时，所述浓度降低则显示强的影响。在柠檬酸的存在下，盐浓度下降至5mM以下和/或pH的下降可能会进一步激发结晶过程。NaCl浓度的增加或5％以上的多元醇(如蔗糖或甘露醇)的添加抑制了结晶过程。

图3示出了在10mM组氨酸、10mMNaCl中进行husFcγRIIB结晶随pH改变的实验。通过超滤将在pH5.5的10mM组氨酸、10mMNaCl中的husFcγRIIB浓缩至140mg/mL，然后用合适的储备溶液将其稀释至40mg/mL。在2-8℃下3天后，通过测定上清液中husFcγRIIB的浓度来测定晶体的产量。每个溶液包含0.01％的聚山梨酯20。

在至少0.5个单位的pH值范围内，超过93％的组氨酸缓冲的husFcγRIIB可结晶。在总husFcγRIIB浓度为40mg/mL的情况下，在pH6.7-7.2的10mM组氨酸，10mMNaCl中的husFcγRIIB的溶解度限值在2.8mg/mL以下。在pH6.9时，25℃下所述结晶在小于1小时内完成。

c)husFcγRIIB溶解度筛选

为了定义所谓的溶解度最佳点(sweetspot)，即husFcγRIIB保持100mg/mL以上可溶且不结晶的条件，在384孔微量滴定板中制备不同的husFcγRIIB制剂，然后在2-8℃下培养至少4周。包括在筛选中的参数为husFcγRIIB浓度(70、100、120和150mg/mL)，缓冲物(组氨酸或柠檬酸)，pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)，NaCl浓度(10-225mM)和糖含量(0-7.5％)。用两个糖水平(1％或3％)和4个不同NaCl浓度(10、50、225mM)进行70mg/mL(表2和表5)和100mg/mL的husFcγRIIB(表3和表6)的最初筛选。

基本上，这些预筛重现了已经在上述浓度筛选(实施例2a)和结晶筛选(实施例2b)中获得的结果。组氨酸缓冲的husFcγRIIB在pH为5.5以上时结晶，而柠檬酸缓冲的husFcγRIIB在pH为5.5-6.0时结晶。在这两种情况下，增加NaCl浓度或糖浓度降低了结晶过程。

在随后的所有120mg/mL和150mg/mL的husFcγRIIB筛选中，仅包括与血液等渗的制剂，即计算得到的渗透压约为308mOsmol/kg。因此，高糖浓度与低NaCl浓度匹配，反之亦然。在中性pH和高离子强度下，具有120mg/mLhusFcγRIIB的基于组氨酸的制剂能够阻止husFcγRIIB结晶，但是有一个例外，即在2-8℃下4周后，具有150mg/mLhusFcγRIIB的基于组氨酸的所有制剂显示出了强的晶体增长(表4)。另一方面，在pH自6.5至7.5和在试验的所有糖/盐浓度下，达150mg/mLhusFcγRIIB的基于柠檬酸的制剂是稳定的(表7)。

因此，柠檬酸缓冲的husFcγRIIB代表了制备用于开发适于皮下给药(即具有生理pH和渗透压)的高浓缩制剂的最好基础。

表2：在70mg/mLhusFcγRIIB和2-8℃下，基于组氨酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

表3：在100mg/mL的husFcγRIIB和2-8℃下，基于组氨酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

表4：在120mg/mL/150mg/mL的husFcγRIIB和2-8℃下，基于组氨酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

表5：在70mg/mL的husFcγRIIB和2-8℃下，基于柠檬酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

表6：在100mg/mL的husFcγRIIB和2-8℃下，基于柠檬酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

表7：在120mg/mL/150mg/mL的husFcγRIIB和2-8℃下，基于柠檬酸的溶解度筛选。采用光学显微镜对每一制剂的外观进行评估，并根据议定标度排名(0＝无晶体；1＝有一些晶体，但很难看见；2＝可清晰看见一些晶体；3＝每个孔中可清晰看见超过30个晶体；4＝许多晶体的层(孔未被完全覆盖)；5＝许多晶体的层(孔被完全覆盖))。

d)高浓缩的husFcγRIIB制剂的热稳定性

非天然蛋白质聚合物及颗粒物的形成可成为高浓缩的蛋白质制剂发展的主要阻碍(Shire等,2010,第15章.High-concentrationantibodyformulations.InFormulationandProcessDevelopmentStrategiesforManufacturingBiopharmaceuticals.Jameel,F.&Hershenson,S.,eds.,JohnWiley,Hoboken,NJ)。基于上述原因，根据候选制剂(参见实施例2c)在热应力存在下维持husFcγRIIB的天然结构从而阻止其非天然聚集的能力将它们排序。

首先，通过差示扫描荧光法测定柠檬酸缓冲的husFcγRIIB制剂的熔解温度T_m。图4示出了采用下列方案获得的相应结果：在所指示的pH的10mM柠檬酸、4.5％糖(蔗糖:甘露醇为2:1(w/w))、75mMNaCl中含0.5mg/mL的husFcγRIIB(图4(a)和(c))，或在pH为7的补充有所指示量的糖(蔗糖:甘露醇为2:1(w/w))和盐的10mM柠檬酸中含0.5mg/mL的husFcγRIIB(图4(b)和(d))。在宝石橙存在下以1℃/min在96孔微量滴定板中加热husFcγRIIB制剂，并记录610nm处的荧光发射。图(a)和(b)示出了荧光相对温度的曲线，图(c)和(d)示出了荧光相对温度的曲线的一阶导数。将dF/dT曲线中的第一个最大值定义为husFcγRIIB熔解温度。

根据相应候选制剂的组成，测得了自50.8℃至55.5℃的T_m值。对熔解温度影响最大的是pH，当pH自7.5降低至6.5时，T_m增加约3.5℃。7.5％糖的添加使T_m增加约1℃(图5显示了husFcγRIIB熔解温度随10mM柠檬酸中pH、糖和盐浓度变化的改变。显示了源自三个独立的孔的平均值和标准偏差)。如先前实验(数据未给出)所示并根据优先排除理论(theoryofpreferentialexclusion)(Timasheff,1992,第9章.StabilizationofProteinStructure.InStabilityofProteinPharmaceuticals,PartB:Invivopathwaysofdegradationandstrategiesforproteinstabilization.Ahern,T.J.&Manning,M.C.,eds.,PlenumPress,NewYork,pp.265-285)，尽管NaCl的浓度平行下降，但是增加的热稳定性明显是增加的糖浓度的函数，而不是降低的盐含量的函数。这也通过将糖浓度自7.5％提高至40％(导致T_m增加6.2℃)而被证明。

接下来，确定何种程度的husFcγRIIB的二级和三级结构(如高熔解温度所示)的稳定性将抑制未溶蛋白质聚集物的形成。因此，将柠檬酸缓冲的husFcγRIIB制剂在37℃(该温度远低于所测得的T_m)下培养后测定其浊度。为此，在37℃下测定柠檬酸缓冲的husFcγRIIB制剂的加速稳定性。在1h(a)、12h(b)和7d(c)后，测定360nm处的光密度随husFcγRIIB浓度和蔗糖浓度的变化。所有制剂都包含pH7.0的10mM柠檬酸和25mMNaCl。减去缓冲剂对照的光密度。当蔗糖为40％时，最高的浓缩制剂仅包含60mg/mL的husFcγRIIB，而不是80mg/mL的husFcγRIIB。

结果示于图6。随着蔗糖浓度增加(如图6中所有小图的z-轴所示，自后向前，浓度增加)，即蛋白质的熔解温度增加，浊度的增加是延迟的。若不添加蔗糖，在37℃下1小时后，强度≥10mg/mL的husFcγRIIB的所有制剂已经变得浑浊，而在40％蔗糖时，甚至在37℃下7天后，高达60mg/mL的husFcγRIIB也仍未观察到显著的浊度增加。在某一蛋白质浓度以上时，绝对浊度随husFcγRIIB浓度的增加而线性增加，但是在该阈值以下时，未溶蛋白质聚合物的形成是极其缓慢的，甚至是被抑制的。随着蔗糖浓度的增加，该阈值向更高的husFcγRIIB浓度移动，然而，从生理角度而言，在37℃下和浓度超过60mg/mL时，将需要不可接受的高蔗糖浓度来稳定husFcγRIIB。

在40℃下，对柠檬酸缓冲的husFcγRIIB制剂的加速稳定性进行了进一步试验。结果示于图7。在补充有10％/292mM蔗糖(a,Δ)、10％/292mM海藻糖(a,□)、5％/274mM甘露醇(a,○)，30％/876mM蔗糖(b,Δ)、30％/876mM海藻糖(b,□)、15％/822mM甘露醇(b,○)的pH7.0的10mM柠檬酸、150mMNaCl中的10mg/mLhusFcγRIIB时，测定在360nm处光密度的增加。图中还示出了补充20％蔗糖的缓冲液对照(●)。

根据上述的观察结果，将不同的糖和糖醇依据其抑制未溶蛋白聚合物形成的能力将它们排名。如图7所示，最有效的稳定剂是蔗糖。

e)所需去污剂浓度的限定

浊度实验(数据未给出)与所公开的增加去污剂浓度使husFcγRIIB不稳定的数据(Timasheff,1992,第9章.StabilizationofProteinStructure.InStabilityofProteinPharmaceuticals,PartB:Invivopathwaysofdegradationandstrategiesforproteinstabilization.Ahern,T.J.&Manning,M.C.,eds.,PlenumPress,NewYork,pp.265-285)一致。还推测，使用高去污剂浓度可导致增加的免疫原性(Hermeling等,2003,Pharm.Res.20,1903-1907)。基于上述原因，在不影响去污剂对表面应力的稳定作用的前提下，保持尽可能低的去污剂浓度将是强制性的。

理想地，应将聚山梨酯20的浓度设定为0.005％，该浓度用于已经建立的包含5-20mg/mLhusFcγRIIB的液体husFcγRIIB制剂中。但是，由于新制备的制剂的强度将在50mg/mL以上，且聚山梨酯20可结合至蛋白质，则质疑去污剂的浓度是否一定要升至0.005％以上。

为了试验蛋白质与去污剂的非特异性结合的假设，将浓度递增的husFcγRIIB提供给包含0.005％聚山梨酯20的柠檬酸缓冲的候选制剂，并将溶液分别在室温和60℃(该温度远高于所确定的husFcγRIIB的T_m)下培养1小时。在通过阳离子交换色谱将蛋白质和假设结合的聚山梨酯20移除后，测定游离聚山梨酯的量。图8显示了在husFcγRIIB存在下测定游离聚山梨酯20的实验。将在pH6.7的10mM柠檬酸、25mMNaCl、3％蔗糖、1.5％甘露醇、0.005％聚山梨酯20中的husFcγRIIB在25℃(天然husFcγRIIB)下和60℃(变性husFcγRIIB)下培养1小时。通过阳离子交换色谱(CEX)移除husFcγRIIB后，测定了聚山梨酯20的量(a)。空白代表未添加husFcγRIIB或去污剂的缓冲剂。系统适用性实验(SST)代表具有0.005％聚山梨酯20的缓冲剂，其中SST2为经CEX处理而SST1未经CEX处理。根据聚山梨酯浓度相对于对数的husFcγRIIB浓度的线性回归(R²>0.998)，将在0.08-0.72mg/mL的husFcγRIIB时测得的聚山梨酯含量外推至husFcγRIIB浓度为10mg/mL以上时(b)。

如图8所示，建立了游离聚山梨酯含量与对数的husFcγRIIB浓度之间的线性关系。因此，预期当制剂的强度自20mg/mL增长至100mg/mL时，游离聚山梨酯的浓度仅以约0.0001-0.0002％小幅度地改变。与0.005％的对照相比，样品中显著较低的聚山梨酯浓度主要是由于在色谱柱装载时样品被CEX平衡缓冲液稀释这一事实，该平衡缓冲液的制备不含聚山梨酯20(参见图8SST1相对于SST2)。

f)高浓缩的husFcγRIIB制剂的粘度

高度浓缩的蛋白质制剂的特点是高粘度(Shire等，2010，上文)。因此，由于通过切向流过滤的浓缩过程可变得不可接受得慢，高度浓缩的蛋白质制剂的制造可能被其粘度阻碍。在进一步的实验中，在20℃下测定pH为7的10mM柠檬酸、25mMNaCl中husFcγRIIB的溶液粘度。如图9(○)所示，所得实验数据拟合为一个指数增长的函数(-,R²>0.992)，并发现直至至少210mg/mL，制剂的溶液粘度都足够低来进行经济的TFF过程。

g)含husFcγRIIB的制剂的冷冻干燥

对59个具有不同husFcγRIIB、糖、盐和去污剂含量的制剂进行保守的冷冻干燥循环。用一定体积的注射用水重构所得固体，所述一定体积等于或小于冷冻干燥过程前的原体积。通过这一操作，重构后的husFcγRIIB含量被调整至60-180mg/mL的标称含量。根据重构时间及重构后的颗粒污染物来评估不同制剂的冷冻干燥的适用性。若干制剂被鉴定为可以在少于2min内重构且在可视及亚可视范围内既未显示出增加的浊度也未有颗粒的形成。基于上述的冷冻干燥筛选表明，理想的制剂在冷冻干燥之前包含少量的husFcγRIIB(如15-60mg/mL)，用低体积的注射用水重构该制剂，由此增加最终的去污剂浓度。采用荧光显微术测定的所选制剂的颗粒负载示于图10。所有的制剂都包含pH为6.7的5mM柠檬酸和图中所示量的盐、糖和去污剂。将制剂冻干并重构为所示的husFcγRIIB含量。

Claims (15)

1.包含在水性缓冲溶液中的可溶性Fc受体(sFcR)的制剂，其中所述Fc受体的浓度大于50mg/ml并且其中所述制剂包含生理上可接受的缓冲物质。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述缓冲物质选自组氨酸、柠檬酸、磷酸或它们的任意组合。

3.根据权利要求1或2所述的制剂，其中所述Fc受体为Fcγ受体。

4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述受体为FcγRII受体，优选地为FcγRIIB。

5.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述Fc受体的浓度大于60mg/ml，优选地大于80mg/ml，更优选地大于100mg/ml，进一步优选地大于150mg/ml，和最优选地大于200mg/ml。

6.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂进一步包含选自糖、盐和去污剂的物质。

7.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述受体以溶解形式存在或所述制剂包含微晶形式的受体。

8.根据权利要求6或7所述的制剂，其中所述制剂为柠檬酸缓冲溶液，并且所述制剂的pH被调节为6.0至7.5。

9.根据权利要求6或7所述的制剂，其中所述制剂为组氨酸缓冲溶液，并且所述制剂的pH被调节为5.2至5.9。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含晶体形式的受体。

11.根据权利要求7和10中任一项所述的制剂，其中所述制剂为柠檬酸缓冲溶液，并且所述制剂的pH被调节为5.2至5.9。

12.根据权利要求7和10中任一项所述的制剂，其中所述制剂为组氨酸缓冲溶液，并且所述制剂的pH被调节为6.0至7.5。

13.包含权利要求1至12中任一项所述的制剂的药物组合物，可选地，所述制剂与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂和/或载体组合。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于Fc受体的有效量的皮下注射来预防或治疗自身免疫性疾病或炎性疾病。

15.根据权利要求1至12中任一项所述的制剂或根据权利要求13或14所述的药物组合物在治疗或预防自身免疫性疾病中的用途，特别是在治疗或预防多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性免疫性血小板减少症或自身免疫性溶血性贫血中的用途。