CN105541966B - 一种四肽的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四肽的制备方法及应用。该四肽的制备方法包括以下步骤：1）硝基精氨酸的制备；2）硝基精氨酸甲酯的制备；3）BocPro的制备；4）BocPro‑NO2ArgOMe的制备；5）Pro‑NO2ArgOMe的制备；6）BocGly的制备；7）BocGly‑Gln的制备；8）BocGly‑Gln‑Pro‑NO2ArgOMe的制备；9）BocGly‑Gln‑Pro‑NO2Arg的制备；10）Gly‑Gln‑Pro‑NO2Arg的制备；11）四肽Gly‑Gln‑Pro‑Arg的制备。本发明的四肽可用于制备祛皱、抗炎、美容护肤品。本发明的合成路线具有路线短、产率高、节省时间的特点，合成过程中涉及到的所有原料均已商品化，价格廉价，技术难度小，工业化操作简单，具有良好的产业化前景。

Description

一种四肽的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种四肽的制备方法及应用，该四肽具有Gly-Gln-Pro-Arg的氨基酸序列。
背景技术
白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子，两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化等方面起到重要作用。然而，若白细胞介素分泌过量，则会触发急性炎症反应。
皮肤是人体最大的器官，承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等多重功能。人出生后皮肤组织日益发达，功能逐渐活跃。然而，当到达一定年龄皮肤就会开始退化，皮肤变得疏松，脸上出现皱纹、鱼尾纹、色斑等。随着人们生活水平的日益提高，人们越来越关注皮肤问题，尤其是女性，都很重视自身皮肤的保养。
四肽Gly-Gln-Pro-Arg(GQPR)可以用作护肤品，具有以下作用：1)延缓和抑制过量白细胞介素的生成，从而抑制由它触发的急性炎症反应；2)保湿、改善淋巴循环、阻止弹力蛋白流失；3)提高皮肤的紧致和弹力，可用于眼霜，起到祛除眼袋的效果；4)紧致、调节皮肤、平滑皱纹。
本发明开发了一种四肽GQPR合成的新工艺，该工艺具有合成路线短、产率高、节省时间等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种四肽的制备方法及应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种四肽的制备方法，包括以下步骤：
1)硝基精氨酸的制备：将发烟硝酸和浓硫酸混合均匀，置于冰盐浴中，边搅拌边缓慢加入L-精氨酸(L-Arg)，搅拌反应2～3h，再加入浓氨水调节pH值至8～9，然后用冰醋酸调节pH值到6，将反应液置于冰箱中0～4℃保存4～6h，收集沉淀物，沉淀分别经水洗1～2h、95％的乙醇洗1～2h、抽滤、干燥，得到结构式如(1)所示的硝基精氨酸，
其中，所述L-精氨酸、发烟硝酸的质量体积比为1g：(1.25～2)mL；所述发烟硝酸、浓硫酸的体积比为1：(0.4～1)。
2)硝基精氨酸甲酯的制备：将步骤1)的硝基精氨酸溶于甲醇，加入DMF，置于冰盐浴中，滴加SOCl2，滴加完后反应30～50min，然后慢慢升温至75～85℃，回流反应6～8h，反应液经减压蒸馏除去溶剂、乙醇结晶，得到结构式如(2)所示的硝基精氨酸甲酯，
其中，所述硝基精氨酸、甲醇的质量体积比为1g：(3～15)mL；所述硝基精氨酸、DMF的摩尔比为1：(0.01～0.05)；所述硝基精氨酸、SOCl2的摩尔比为1：(1～1.6)。
3)BocPro的制备：将脯氨酸(Pro)溶于水，置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，再加入THF，再滴加含(Boc)2O的THF溶液，滴加完后室温搅拌至反应完全，减压蒸馏除去THF，用石油醚萃取除去未反应的(Boc)2O，再置于冰盐浴中用柠檬酸溶液调节pH值至2～3，析出沉淀，抽滤，得白色固体，滤液用乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液经饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到结构式如(3)所示的BocPro，
其中，所述脯氨酸、水的质量体积比为1g：(50～80)mL；所述水、NaOH溶液、THF、含(Boc)2O的THF溶液的体积比为6：(3～4)：(3～4)：(3～4)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～3mol/L；所述脯氨酸、(Boc)2O的摩尔比为1：(1.1～1.5)。
4)BocPro-NO2ArgOMe的制备：将含BocPro、缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应3～5h，将生成的沉淀过滤得滤液，再将含硝基精氨酸甲酯、三乙胺的DMF溶液慢慢加入到上述反应体系中，于室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去DMF和THF，加入碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取5～6次，萃取液经饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥、减压蒸馏，得到结构式如(4)所示的BocPro-NO2ArgOMe，
其中，所述BocPro、缩合剂、脱水剂、硝基精氨酸甲酯、三乙胺的摩尔比为1：(1.1～1.4)：(1.1～1.3)：(1～1.2)：(1～1.2)；所述THF溶液、DMF溶液的体积比为(2～3)：1；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类。5)Pro-NO2ArgOMe的制备：将BocPro-NO2ArgOMe溶于盐酸乙酸乙酯溶液，40～50℃反
应过夜，过滤，干燥，得到结构式如(5)所示的Pro-NO2ArgOMe，
其中，所述BocPro-NO2ArgOMe、盐酸乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g：(10～40)mL；所述盐酸乙酸乙酯溶液的物质的量浓度为2～4mol/L。
6)BocGly的制备：将甘氨酸(Gly)水溶液置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，加入THF，滴加(Boc)2O的THF溶液，维持pH值为8～10，滴完后室温搅拌反应2～4h，减压蒸馏除去THF，再置于冰盐浴中用柠檬酸溶液调节pH至1～3，再用乙酸乙酯萃取3～4次，萃取液经饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏，得到结构式如(6)所示的BocGly，
其中，所述甘氨酸水溶液中甘氨酸、水的质量体积比为1g：(15～30)mL；所述甘氨酸水溶液、NaOH溶液、THF、(Boc)2O的THF溶液的体积比为20：(5～8)：(5～8)：(3～5)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～3mol/L。
7)BocGly-Gln的制备：将含BocGly和缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应5～7h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到含谷氨酰胺(Gln)和NaHCO3的水溶液中，室温搅拌反应过夜，调节pH值到6，减压蒸馏除去THF，用乙酸乙酯萃取除去小极性杂质，再调节pH值到3～4，将反应液置于冰箱中0～4℃过夜，结晶析出白色沉淀，沉淀经过滤、干燥，得到结构式如(7)所示的BocGly-Gln，
其中，所述含BocGly和缩合剂的THF溶液、含Gln和NaHCO3的水溶液的体积比为3：(2～4)；所述BocGly、缩合剂、脱水剂、谷氨酰胺、NaHCO3的摩尔比为1：(1～1.3)：(1～1.3)：(1～1.2)：(1.3～1.6)；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类。
8)BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的制备：将含BocGly-Gln和缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应5～7h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到含Pro-NO2ArgOMe和三乙胺的DMF溶液中，滴加完后室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去THF，用碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液经碳酸氢钠洗涤、5％的乙酸溶液洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥、减压蒸馏、二氯甲烷重结晶，得到结构式如(8)所示的Boc-Gly-Gln-Pro-NO2ArgOMe，
其中，所述BocGly-GlnOH、缩合剂、脱水剂、Pro-NO2ArgOMe、三乙胺的摩尔比为1：(1.1～1.3)：(1～1.3)：(1.0～1.2)：(1.0～1.5)；所述THF溶液、DMF溶液的体积比为1：(0.2～0.4)；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类。
9)BocGly-Gln-Pro-NO2Arg的制备：将BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的乙醇溶液置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，滴加完后恒温反应1～2h，减压蒸馏，用乙醇溶解打浆，过滤除去固体杂质，减压蒸馏，得到结构式如(9)所示的BocGly-Gln-Pro-NO2Arg，
其中，所述BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的乙醇溶液中BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe、乙醇的质量体积比为1g：(5～10)mL；所述乙醇溶液、NaOH溶液的体积比为20：(3～6)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～2mol/L。
10)Gly-Gln-Pro-NO2Arg的制备：将BocGly-Gln-Pro-NO2Arg溶于盐酸乙酸乙酯溶液，室温下搅拌反应，析出固体，过滤，得到结构式如(10)所示的Gly-Gln-Pro-NO2Arg，
其中，所述BocGly-Gln-Pro-NO2Arg、盐酸乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g：(10～25)mL；所述盐酸乙酸乙酯溶液的物质的量浓度为2～4mol/L。
11)终产物四肽Gly-Gln-Pro-Arg的制备：将Gly-Gln-Pro-NO2Arg溶于乙醇和水的混合溶液，加入钯碳(10％)，充入氢气，25～40℃搅拌过夜，过滤除去滤渣，减压蒸馏，再加入乙醇，析出白色沉淀，过滤，干燥，得到本发明的结构式如(10)所示的四肽，
其中，所述Gly-Gln-Pro-NO2Arg、乙醇和水的混合溶液的质量体积比为1g：(10～25)mL；所述乙醇和水的混合溶液中乙醇、水的体积比为1：(1～2)；所述Gly-Gln-Pro-NO2Arg、钯碳的质量比为1：(0.06～0.125)。
本发明的四肽可用于制备祛皱、抗炎、美容护肤品。
一种祛皱、抗炎、美容护肤品组合物，包括四肽Gly-Gln-Pro-Arg、角鲨烷、异硬脂醇异硬脂酸酯、氢化椰油、肉豆蔻醇、肉豆蔻酸酯、硬脂醇聚醚-21、硬脂醇聚醚-2、鲸蜡硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、霍霍巴籽油、木糖醇、羟基乙酸、黄原胶、胆甾醇、水解胶原、可溶性弹性蛋白、三色堇提取物、植物氨基酸类、香精和纯水，其中四肽Gly-Gln-Pro-Arg的含量为0.001％～20％(质量分数)。
本发明的四肽的完整合成工艺路线如下所示：
本发明的有益效果是：本发明合成了一种水溶性的四肽，该四肽具有Gly-Gln-Pro-Arg的氨基酸序列。本发明的四肽可用于制备祛皱、抗炎、美容护肤品。本发明的合成工艺具有路线短、产率高、节省时间的特点，合成过程中涉及到的所有原料均已商品化，价格廉价，技术难度小，工业化操作简单，具有良好的产业化前景。
附图说明
图1为中间产物BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的1H NMR图谱。
图2为中间产物BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的质谱图。
图3为终产物四肽Gly-Gln-Pro-Arg的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例：
1)化合物1——硝基精氨酸的合成：
将40mL发烟硝酸和25mL 98％的浓硫酸混合，置于冰盐浴中，边搅拌边缓慢加入30g L-精氨酸，滴加完后恒温搅拌2h，待体系基本呈透明，用浓氨水调节溶液pH值到8～9，然后用冰醋酸调节pH值到6，在冰箱中0～4℃保存4h，收集沉淀物，沉淀经水洗1h、95％的乙醇洗1h、抽滤、干燥，得到26g硝基精氨酸(白色固体，产率70.1％，Rf＝0.5(甲醇：乙酸＝2:1))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
2)化合物2——硝基精氨酸甲酯(NO2ArgOMe)的合成：
将30g硝基精氨酸溶于100mL甲醇，加入0.1mL DMF，置于冰盐浴中，用注射器缓慢滴加11mL氯化亚砜，滴加完后恒温反应30min，然后慢慢升温至80℃回流反应6h，减压蒸馏除去甲醇，得到黏稠液体，用乙醇结晶，得到31.9g硝基精氨酸甲酯(产率95％，Rf＝0.4(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝3:1:0.2))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
3)化合物3——BocPro的合成：
将5g脯氨酸溶于30mL水，置于冰盐浴中，滴加15mL 2mol/L的NaOH溶液，加入15mLTHF，再滴加15mL含11mL(Boc)2O的THF溶液，滴完后在室温下搅拌至反应完全，减压蒸馏除去THF，反应液用石油醚萃取除去未反应的(Boc)2O，再置于冰盐浴中用柠檬酸调节pH值至2～3，析出沉淀，抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液经饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯、干燥，得到8.6g BocPro(白色固体，产率92％，Rf＝0.4(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.1))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
4)化合物4——BocPro-NO2ArgOMe的合成：
将10g BocPro、8.4g HOBt溶于150mL THF，置于冰盐浴中，分批加入11.3g DCC，恒温反应4h，将生成的沉淀过滤得滤液，最后将70mL含12g(NO2)ArgOMe和6.5mL三乙胺的DMF/DMF(THF/DMF体积比为2:1)混合溶液慢慢加入上述滤液中，室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去DMF和THF，加入碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取5次，萃取液用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，减压蒸馏，得到14g BocPro-NO2ArgOMe(膏状液体，产率71％，Rf＝0.5(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.5))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
5)化合物5——Pro-NO2ArgOMe的合成：
将0.59g BocPro-NO2ArgOMe溶于20mL 4mol/L的盐酸乙酸乙酯溶液，40℃反应过夜，过滤除去溶剂，得到0.42g Pro-NO2ArgOMe(白色固体，产率94％)。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
6)化合物6——BocGly的合成：
将10g甘氨酸溶于200mL水，置于冰盐浴中，滴加70mL 2mol/L的NaOH溶液，加入50mL THF，滴加30mL含25g(Boc)2O的THF溶液，保持pH值为9～10，滴加完后室温搅拌反应3h，减压蒸馏除去THF，置于冰盐浴中用柠檬酸溶液调节pH值至2～3，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液用饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯、干燥，得到21g BocGly(白色固体，产率91％，Rf＝0.5(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.5))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
7)化合物7——BocGly-Gln的合成：
将10g BocGly、7.8g HOSu溶于150mL THF，置于冰盐浴中，分批加入14g DCC，恒温反应6h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到150mL含9.5g Gln和7g NaHCO3的水溶液中，滴加完后室温搅拌反应过夜，调节pH值到6，减压蒸馏除去THF，用乙酸乙酯萃取除去小极性杂质，继续调节pH值至3～4，在冰箱中0～4℃过夜，结晶析出沉淀，过滤，干燥，得到10.8g BocGly-Gln(白色固体，产率63％，Rf＝0.5(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.5))。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
8)化合物8——BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的合成：
将1.75g BocGly-Gln、0.98g HOBt溶于20mL THF，置于冰盐浴中，分批加入1.3gDCC，恒温反应6h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到5mL含1.9g Pro-(NO2)ArgOMe和1mLEt3N的DMF溶液中，室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去THF和DMF，加碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取3次，萃取液依次用碳酸氢钠、5％的乙酸溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，减压蒸馏，用二氯甲烷重结晶，得到2.1g BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe(产率62％，Rf＝0.6(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝8:1:0.5))。
BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的1H NMR图谱如图1所示。
BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的质谱图如图2所示(M+Na)。
由图1可知：δ＝8.90(d，J＝6.8Hz，1H)，8.86(d，J＝7.0Hz，2H)，8.76(s，2H)，7.36(s，2H)，4.28(d，J＝7.2Hz，2H)，4.14(d，J＝6.3Hz，4H)，3.24-3.10(m，7H)，1.39(s，5H)，1.31(d，J＝7.3Hz，7H)，1.10(s，9H)。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
9)化合物9——BocGly-Gln-Pro-NO2Arg的合成：
将3g BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe溶于20mL乙醇，置于冰盐浴中，滴加5mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，滴加完后恒温反应1h，蒸干溶剂，用乙醇溶解打浆，过滤，减压蒸馏，得到2.5g BocGly-Gln-Pro-NO2Arg(黄色固体，产率91％)。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
10)化合物10——Gly-Gln-Pro-NO2Arg的合成：
将1g BocGly-Gln-Pro-(NO2)Arg溶于20mL 2mol/L的盐酸乙酸乙酯溶液，室温下搅拌反应4h，析出固体，过滤，得到0.7g Gly-Gln-Pro-NO2Arg(黄色固体，产率89％)。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
11)化合物11——Gly-Gln-Pro-Arg的合成：
将1g Gly-Gln-Pro-NO2Arg溶于10mL乙醇和10mL水所组成的混合溶液中，加入0.1g钯碳(10％)，充入氢气置换3次，25℃搅拌过夜，过滤，减压蒸馏，加入乙醇析出沉淀，沉淀经过滤、干燥，得到0.66g水溶性四胜肽Gly-Gln-Pro-Arg(缩写为GQPR，白色固体，产率78％)。
Gly-Gln-Pro-Arg的质谱图如图3所示(M+1正离子模式)。
本步骤涉及的反应方程式如下所示：
本发明的四肽可用于制备祛皱、抗炎、美容护肤品。
一种祛皱、抗炎、美容护肤品组合物，包括四肽Gly-Gln-Pro-Arg、角鲨烷、异硬脂醇异硬脂酸酯、氢化椰油、肉豆蔻醇、肉豆蔻酸酯、硬脂醇聚醚-21、硬脂醇聚醚-2、鲸蜡硬脂醇、聚二甲基硅氧烷、霍霍巴籽油、木糖醇、羟基乙酸、黄原胶、胆甾醇、水解胶原、可溶性弹性蛋白、三色堇提取物、植物氨基酸类、香精和纯水，其中四肽Gly-Gln-Pro-Arg的含量为0.001％～20％(质量分数)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种四肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)硝基精氨酸的制备：将发烟硝酸和浓硫酸混合均匀，置于冰盐浴中，边搅拌边缓慢加入L-精氨酸，搅拌反应2～3h，再加入浓氨水调节pH值至8～9，然后用冰醋酸调节pH值到6，将反应液置于冰箱中0～4℃保存4～6h，收集沉淀物，沉淀分别经水洗1～2h、95％的乙醇洗1～2h、抽滤、干燥，得到结构式如(1)所示的硝基精氨酸，所述L-精氨酸、发烟硝酸的质量体积比为1g：(1.25～2)mL；所述发烟硝酸、浓硫酸的体积比为1：(0.4～1)；
2)硝基精氨酸甲酯的制备：将步骤1)的硝基精氨酸溶于甲醇，加入DMF，置于冰盐浴中，滴加SOCl2，滴加完后反应30～50min，然后慢慢升温至75～85℃，回流反应6～8h，反应液经减压蒸馏除去溶剂、乙醇结晶，得到结构式如(2)所示的硝基精氨酸甲酯，所述硝基精氨酸、甲醇的质量体积比为1g：(3～15)mL；所述硝基精氨酸、DMF的摩尔比为1：(0.01～0.05)；所述硝基精氨酸、SOCl2的摩尔比为1：(1～1.6)；
3)BocPro的制备：将脯氨酸溶于水，置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，再加入THF，再滴加含(Boc)2O的THF溶液，滴加完后室温搅拌至反应完全，减压蒸馏除去THF，用石油醚萃取除去未反应的(Boc)2O，再置于冰盐浴中用柠檬酸溶液调节pH值至2～3，析出沉淀，抽滤，得白色固体，滤液用乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液经饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏除去乙酸乙酯，得到结构式如(3)所示的BocPro，所述脯氨酸、水的质量体积比为1g：(50～80)mL；所述水、NaOH溶液、THF、含(Boc)2O的THF溶液的体积比为6：(3～4)：(3～4)：(3～4)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～3mol/L；所述脯氨酸、(Boc)2O的摩尔比为1：(1.1～1.5)；
4)BocPro-NO2ArgOMe的制备：将含BocPro、缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应3～5h，将生成的沉淀过滤得滤液，再将含硝基精氨酸甲酯、三乙胺的DMF溶液慢慢加入到上述反应体系中，于室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去DMF和THF，加入碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取5～6次，萃取液经饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥、减压蒸馏，得到结构式如(4)所示的BocPro-NO2ArgOMe，所述BocPro、缩合剂、脱水剂、硝基精氨酸甲酯、三乙胺的摩尔比为1：(1.1～1.4)：(1.1～1.3)：(1～1.2)：(1～1.2)；所述THF溶液、DMF溶液的体积比为(2～3)：1；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类；
5)Pro-NO2ArgOMe的制备：将BocPro-NO2ArgOMe溶于盐酸乙酸乙酯溶液，40～50℃反应过夜，过滤，干燥，得到结构式如(5)所示的Pro-NO2ArgOMe，所述BocPro-NO2ArgOMe、盐酸乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g：(10～40)mL；所述盐酸乙酸乙酯溶液的物质的量浓度为2～4mol/L；
6)BocGly的制备：将甘氨酸水溶液置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，加入THF，滴加(Boc)2O的THF溶液，维持pH值为8～10，滴完后室温搅拌反应2～4h，减压蒸馏除去THF，再置于冰盐浴中用柠檬酸溶液调节pH至1～3，再用乙酸乙酯萃取3～4次，萃取液经饱和氯化钠洗涤、无水Na2SO4干燥、减压蒸馏，得到结构式如(6)所示的BocGly，所述甘氨酸水溶液中甘氨酸、水的质量体积比为1g：(15～30)mL；所述甘氨酸水溶液、NaOH溶液、THF、(Boc)2O的THF溶液的体积比为20：(5～8)：(5～8)：(3～5)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～3mol/L；
7)BocGly-Gln的制备：将含BocGly和缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应5～7h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到含谷氨酰胺和NaHCO3的水溶液中，室温搅拌反应过夜，调节pH值到6，减压蒸馏除去THF，用乙酸乙酯萃取除去小极性杂质，再调节pH值到3～4，将反应液置于冰箱中0～4℃过夜，结晶析出白色沉淀，沉淀经过滤、干燥，得到结构式如(7)所示的BocGly-Gln，所述含BocGly和缩合剂的THF溶液、含Gln和NaHCO3的水溶液的体积比为3：(2～4)；所述BocGly、缩合剂、脱水剂、谷氨酰胺、NaHCO3的摩尔比为1：(1～1.3)：(1～1.3)：(1～1.2)：(1.3～1.6)；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类；
8)BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的制备：将含BocGly-Gln和缩合剂的THF溶液置于冰盐浴中，加入脱水剂，恒温反应5～7h，将生成的沉淀过滤得滤液，将滤液滴加到含Pro-NO2ArgOMe和三乙胺的DMF溶液中，滴加完后室温搅拌反应过夜，减压蒸馏除去THF，用碳酸氢钠溶液和乙酸乙酯萃取3～5次，萃取液经碳酸氢钠洗涤、5％的乙酸溶液洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤、硫酸钠干燥、减压蒸馏、二氯甲烷重结晶，得到结构式如(8)所示的BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe，所述BocGly-Gln、缩合剂、脱水剂、Pro-NO2ArgOMe、三乙胺的摩尔比为1：(1.1～1.3)：(1～1.3)：(1.0～1.2)：(1.0～1.5)；所述THF溶液、DMF溶液的体积比为1：(0.2～0.4)；所述缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑中的一种；所述脱水剂为碳化二亚胺类；
9)BocGly-Gln-Pro-NO2Arg的制备：将BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的乙醇溶液置于冰盐浴中，滴加NaOH溶液，滴加完后恒温反应1～2h，减压蒸馏，用乙醇溶解打浆，过滤除去固体杂质，减压蒸馏，得到结构式如(9)所示的BocGly-Gln-Pro-NO2Arg，所述BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe的乙醇溶液中BocGly-Gln-Pro-NO2ArgOMe、乙醇的质量体积比为1g：(5～10)mL；所述乙醇溶液、NaOH溶液的体积比为20：(3～6)；所述NaOH溶液的物质的量浓度为1～2mol/L；
10)Gly-Gln-Pro-NO2Arg的制备：将BocGly-Gln-Pro-NO2Arg溶于盐酸乙酸乙酯溶液，室温下搅拌反应，析出固体，过滤，得到结构式如(10)所示的Gly-Gln-Pro-NO2Arg，所述BocGly-Gln-Pro-NO2Arg、盐酸乙酸乙酯溶液的质量体积比为1g：(10～25)mL；所述盐酸乙酸乙酯溶液的物质的量浓度为2～4mol/L；
11)终产物四肽Gly-Gln-Pro-Arg的制备：将Gly-Gln-Pro-NO2Arg溶于乙醇和水的混合溶液，加入钯碳，充入氢气，25～40℃搅拌过夜，过滤除去滤渣，减压蒸馏，再加入乙醇，析出白色沉淀，过滤，干燥，得到结构式如(11)所示的四肽Gly-Gln-Pro-Arg，所述Gly-Gln-Pro-NO2Arg、乙醇和水的混合溶液的质量体积比为1g：(10～25)mL；所述乙醇和水的混合溶液中乙醇、水的体积比为1：(1～2)；所述Gly-Gln-Pro-NO2Arg、钯碳的质量比为1：(0.06～0.125)。
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