CN105537264B - 一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂及其应用，属于土壤重金属污染修复技术领域。本发明的生物修复剂，按质量份计，由以下原料混合而成：微生物菌剂10～35份、纳米级贝壳粉5～25份、纳米活性硅肥2～10份、黑果腺肋花楸果渣粉40～55份。所述生物修复剂的应用方法为将修复剂施入重金属污染的酸性农田土壤中，所述重金属为铅、镉、锌，其中铅浓度为250～300mg/Kg，镉浓度0.3～0.4mg/Kg，锌浓度为200～230mg/Kg。本发明的生物修复剂原料价格低廉，应用操作简单，对农田土壤无二次污染，并能增强土壤肥力促进农作物生长，具有很好的推广应用价值。

Description

一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂及其应用

技术领域

本发明涉及土壤重金属污染修复技术领域，具体提供一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂及其应用。

背景技术

2014年4月18日，环境保护部和国土资源部发布的调查公报显示，全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出。由于农田重金属污染具有形成的复杂性、长期的累积性、发生的隐蔽性、毒性的缓效性、诊断的特殊性和恢复的长期性，导致重金属污染已经成为人体健康的“隐形杀手”。从整体而言，以镉-铜、砷-镉-铅、铅-镉-锌等为主的多种重金属元素复合污染，代表了我国主要的农田土壤重金属污染类型。

目前，可用于农田重金属污染修复的技术主要包括四种：工程治理技术；农艺调控措施；植物修复技术；钝化修复技术。

农田重金属污染工程治理技术主要包括客土法、翻耕混匀法、去表土法、表层洁净土壤覆盖法等，但是该方法涉及工程量大、费用高，只适宜用于小面积的、污染严重的土壤修复；对于大面积农田重金属污染修复，采用此方法不仅需要大量的人力、物力，导致成本升高，而且容易引起农田肥力减弱，耕层破坏。农艺调控措施主要指采取农艺方法，如水分管理、施肥调控、低累积品种替换、调节土壤pH值、调整种植结构等措施来控制农田重金属污染，直接或间接达到修复农田重金属污染的目的。但是该方法的缺点是修复效果有限，仅适应于农田重金属轻微和轻度污染的修复。其中，种植结构调整有可能带来农民难以接受的现象，并且会影响粮食质量安全。植物修复技术主要是筛选超富集重金属植物、耐受重金属植物在受污染的土地中种植，但是超积累植物通常矮小，生物量低，生长缓慢，修复效率低，不易于机械化作业，植物无害化处理难度大。此外，受不同地区气候等自然条件不同的影响，超积累植物在不同地区生长也受到影响。一般超富集植物修复中度污染，如镉、砷污染，农田至少需要十年以上，甚至长达几十年至上百年；对重金属轻度污染土壤，一般不易采用植物修复技术。植物修复技术比较适应于高重金属污染土壤，但随着修复年限的增加，修复效率也会逐渐下降，影响修复治理的效果，并且会增加治理费用。

钝化修复技术是针对受重金属污染的土壤，尤其是轻度、中度污染的农田，在常规的控制污染源排放、建立排放物监测制度的同时，确保受污染的土地性质不变的情况下，向受污染的土壤添加外源性的重金属钝化修复剂进行原位修复，通过调节土壤理化性质以及吸附、螯合、沉淀、离子交换、腐殖化、氧化-还原等一系列反应，将土壤中的有毒重金属固定起来，或者将重金属转化成化学性质不活泼的形态，降低其生物有效性，从而阻止重金属从土壤通过植物根部向农作物地上部的迁移累积，以达到治理污染土壤的一种修复技术。原位钝化修复技术具有修复速率快、稳定性好、费用低、操作简单等特点，同时不影响农业生产，可以实现边修复边生产，尤其适用于修复大面积中轻度重金属污染农田土壤。

专利号为CN103567219A的专利文献中，公开了一种用于治理镉污染土壤的多功能复合调理剂及土壤镉污染修复方法。该多功能复合调理剂包括无机钝化剂、有机钝化剂和镉拮抗剂，土壤镉污染修复方法采用复合的镉修复方式，能够降低植物体中镉的含量，为镉含量正常的农产品的种植提供有效、可行且经济的手段。但是该发明中的复合调理剂及修复方式对镉或与其性质相近的重金属固定效果很好，而对复合型重金属污染土壤修复不能达到标准要求。而现在土壤中多种重金属污染并存的现象严重存在，因此需要一种能对复合型重金属污染土壤进行有效修复的方法。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述存在的问题，提供一种原料价格低廉，对农田土壤无二次污染，不会破坏土壤结构，并能增强土壤肥力促进农作物生长的用于治理复合污染土壤的生物修复剂。

本发明进一步的技术任务是提供上述生物修复剂的应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂，按质量份计，该生物修复剂由以下原料混合而成：

微生物菌剂 10～35份；

纳米级贝壳粉 5～25份；

纳米活性硅肥 2～10份；

黑果腺肋花楸果渣粉 40～55份。

为了达到更好的技术效果，上述原料的质量配比优选为：

微生物菌剂 15～30份；

纳米级贝壳粉 10～20份；

纳米活性硅肥 5～10份；

黑果腺肋花楸果渣粉 45～50份。

最佳为由以下原料质量配比混合而成：

微生物菌剂 25份；

纳米级贝壳粉 18份；

纳米活性硅肥 8份；

黑果腺肋花楸果渣粉 49份。

作为优选，所述微生物菌剂为巨大芽孢杆菌、罗威登斯菌及土壤球菌的混合菌液，混合菌液中各微生物的含量为：巨大芽孢杆菌含量≥100×10⁸个/克，罗威登斯菌含量≥100×10⁸个/克，土壤球菌含量≥20×10⁸个/克。

所述生物修复剂的活菌总数为50×10⁸～200×10⁸个/克。

微生物菌剂中各菌种均可以在中国农业微生物菌种保藏管理中心购得，或通过其它商业途径获得；通过本领域常规使用的方法，经转接提纯后得到本发明所述微生物菌剂。

所述纳米级贝壳粉为干净的贝壳经过超细粉碎、晶层分离处理、液相插层处理、纳米化处理、干燥成分处理及其解聚处理、粉体表面钝化处理得到的产品。

所述纳米活性硅肥为使用硅酸四丁酯为原料制备纳米二氧化硅，再用物理研磨的方式加工硅藻土得到纳米活性硅肥，其中的硅酸根离子可以和重金属结合，形成硅酸盐沉淀。

所述黑果腺肋花楸果渣粉为黑果腺肋花楸果经榨汁后的副产品，它是皮籽混合物，富含带有大量的醇羟基、羰基、羧基等功能基团的多糖、酚类、有机酸等物质，能够有效的吸附、螯合重金属。

申请人经大量试验发现，由微生物菌剂、纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥、黑果腺肋花楸果渣粉混合而成的钝化剂既可以显著降低土壤（尤其是酸性土壤）中重金属有效态的含量，还能改善作物的品质、增强土壤肥力、杀死土壤中的病害菌和线虫、促进作物生长、保持土壤生态平衡、降低酸性土壤中氢离子浓度，改善作物的生长状况，即，本发明修复可以在酸性农田土壤重金属修复中应用，使受到重金属污染的酸性土壤可以正常种植作物。

究其原理，该修复剂中的微生物特有结构和胞外代谢产物如蛋白质、有机酸、多糖等可以导致细胞内累积吸附作用、生物性甲基化作用、沉降作用、螯合作用；纳米级贝壳粉对重金属的修复原理主要可使土壤中镉、铅、锌等重金属形成碳酸盐结合态沉淀，降低有毒金属元素的有效性，而且能将部分重金属离子牢牢地固定与晶格内；纳米活性硅肥中的硅酸根离子可以和重金属结合，形成硅酸盐沉淀，从而降低重金属的有效活性；黑果腺肋花楸果渣粉的添加，不仅作为微生物菌剂的吸附载体，而且能够最大程度的与微生物菌剂、纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥发挥协同作用，从而大幅度降低土壤中重金属有效态含量，将其转变为其他毒性降低、稳定性较强的形态，从根源上解决了土壤及环境污染问题，这可能与其含有的多糖物质、酚类物质、有机酸物质等带有大量的醇羟基、羰基、羧基等功能基团吸附、螯合重金属有关系。

因此，可以将本发明所述生物修复剂应用在酸性农田重金属污染土壤中进行原位钝化修复中。

所述污染土壤的重金属为铅、镉、锌时，修复效果最佳，其中，铅浓度为250～300mg/Kg，镉浓度0.3～0.4mg/Kg，锌浓度为200～230mg/Kg，土壤的pH值为6.0～7.0。

作为优选，本发明所述修复剂在对小麦、玉米、水稻、蔬菜种植土壤进行修复时，修复效果最佳，且作用生长品质可得到明显提升。

一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂的应用方法，将本发明所述修复剂施入酸性农田重金属污染的土壤中。所述修复剂可以单独使用，也可以与基肥和/或复合肥混合使用，每亩每季的使用量为50～100Kg。

本发明的用于治理复合污染土壤的生物修复剂优选通过以下方法得到：

（1）所述的巨大芽孢杆菌、罗威登斯菌、土壤球菌分别经过活化、摇瓶培养、种子罐培养，制备各自的种子液，然后按照（5-15）：（5-15）：5的体积比进行混合，制得混合后的菌液，混合液态菌种，活菌总数为200×10⁸～800×10⁸个/g；

（2）将固态混合发酵培养基粉料投入发酵罐体内，由发酵罐体进水口通入冷水后，利用罐体内的翻板和破碎器带动物料翻动、疏松、混合。蒸汽从蒸汽及灭菌空气进口直接进入罐体内，对固态物料进行灭菌，冷却降温后等待接种；

（3）将由（1）得到的液态菌种按照一定的接种量（质量比10—15%）喷入罐体内，随着发酵罐体转动，液态菌种和由（2）得到的灭菌后的物料均匀混合。无菌空气直接通入罐体内喷向物料，保证菌体生长所需的氧源，根据发酵的温度湿度要求，发酵过程中无菌水从发酵罐的接种分配管按需要喷入定量的无菌水，保证罐体内湿度均一（通过湿度传感器控制进水量）。经测定发酵达到要求指标后，固态发酵物由出料口卸料；

（4）将由（3）得到的固态发酵物输送至双轴桨叶式混合机，再将纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥、黑果腺肋花楸果渣粉，按照比例投入双轴桨叶式混合机，启动混合机进行混合，吸附混拌均匀后，进行粉碎、过筛、包装，即可得到生物修复剂。

本上述方法中，步骤(1)中的巨大芽孢杆菌、罗威登斯菌、土壤球菌分别经过活化、摇瓶培养、种子罐培养方法为本领域常规技术。

本上述方法中，步骤（3）所述固体发酵方法可采用本领域常规技术，但为了达到最佳效果优选以下固体发酵条件：

①调节固体培养基基质的营养成分和粒度，使基质中碳氮比为25:1～30:1，无机盐适当，粒度粗细适中；

②基质含水量控制在45％～55％之间；

③基质pH值控制在7.0～7.2之间；

④培养温度控制在30～35℃之间；

⑤转鼓发酵罐体内湿度为60％～70％；

⑥发酵时间为24～40小时。

以上述方法得到的生物修复剂，活菌总数为50×10⁸～200×10⁸个/g，其中各微生物的含量为：巨大芽孢杆菌含量≥25×10⁸个/克，罗威登斯菌含量≥25×10⁸个/克，土壤球菌含量≥5×10⁸个/克，细度≥120目，pH7.0～7.5，水分≤30%，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率不超过10%。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的有益效果：

（一）本发明采用混合型重金属修复剂对受重金属污染的土壤进行原位修复，即有高效重金属抑制微生物功能菌剂，又有和土壤改良微生物功能菌剂持续强化受污染土壤的化学修复剂，克服了传统的化学改良剂或微生物菌剂只针对单一或性质相近的重金属固定效果很好，而对复合型重金属污染土壤修复不能完全达标的缺陷，同时还兼顾了经济和环境效益，可以大规模应用于复合型重金属污染土壤的修复；

（二）该修复剂中的黑果腺肋花楸果渣粉中含有带有大量的酚基、羟基、醇羟基、羰基、羧基等基团的多糖、花青素、有机酸、酚酸、多酚等物质，具有良好的吸附、螯合等作用，可与微生物菌剂的特殊结构及胞外分泌物如蛋白质、氨基酸、多糖等以及修复剂中纳米贝壳粉、纳米硅肥等的吸附、螯合、沉淀等作用产生明显的协同作用，大幅度修复酸性土壤中铅、锌、镉等重金属污染，使受轻度、中度污染的酸性土壤在种植玉米、小麦、水稻、蔬菜时的铅、锌、镉全量和有效态含量分别降低50%以上；

（三）所述复合修复剂能够增强土壤肥力、杀死土壤中的病害菌和线虫、促进作物生长、保持土壤生态平衡、降低酸性土壤中氢离子浓度、提高pH，适宜于绿色可持续农业生产施用，具有重要的社会、经济效益和广泛的应用前景；

（四）所述微生物菌剂可采用液态发酵和固态发酵，发酵设备构造简单、易操作、投资少、能耗低、后期处理简便、污染少、基本无废水排放，具有良好的实用性。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明的一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂及其应用作进一步详细说明。

下述实施例中，巨大芽孢杆菌均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC01030，形态为冻干粉。土壤球菌均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC01035，形态为冻干粉。罗威登斯菌均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号为ACCC11825，形态为斜面培养物。

双轴桨叶式混合机型号为SSHJ-4，全体积为4m³。

纳米级贝壳粉由天津鸿雁天山石业纳米技术有限公司生产，水分为0.5%。纳米活性硅肥由深州市中农绿禾硅肥厂生产，水分为3%、pH为8.3，二氧化硅含量≥99%。黑果腺肋花楸果渣粉由辽宁富康源黑果花楸科技开发有限公司生产，细度为80目，水分为12%。

实施例1

（一）液体发酵

1、巨大芽孢杆菌的液体种子制备：

①菌种活化

将保藏在冷冻干燥管中的巨大芽孢杆菌菌种经无菌操作接入营养肉汁琼脂培养基中，在恒温30℃下培养。

②摇瓶液体培养

采用营养肉汁液体培养基，在150r/min、30℃、20h条件下，得到2500mL的摇瓶种子液。

③种子罐培养

采用营养肉汁培养基，种子罐体积100L，装料比50%，接种量5%，通气量2VVmm[单位时间（min）发酵液体积（m³）内通入的标准状态下的空气体积（m³）]，在150r/min、30℃、16h条件下，制得50L种子罐培养液，活菌数305×10⁸个/克。

2、土壤球菌的液体种子制备：

①菌种活化

将保藏在冷冻干燥管中的土壤球菌菌种经无菌操作接入营养肉汁琼脂培养基中，在恒温30℃下培养。

②摇瓶液体培养

采用营养肉汁培养基，在180r/min、30℃、24h条件下，得到2500mL的摇瓶种子液。

③种子罐培养

采用营养肉汁培养基，种子罐体积100L，装料比50%，接种量5%，通气量1VVmm[单位时间（min）发酵液体积（m³）内通入的标准状态下的空气体积（m³）]，在180r/min、30℃、30h条件下，制得50L种子罐培养液，64×10⁸个/克。

3、罗威登斯菌的液体种子制备：

①菌种活化

将保藏在斜面培养物中的罗威登斯菌菌种经无菌操作接入LB培养基中，在恒温32℃下培养。

②摇瓶液体培养

采用LB液体培养基，在130r/min、32℃、24h条件下，得到2500mL的摇瓶种子液。

③种子罐培养

采用LB液体培养基，种子罐体积100L，装料比50%，接种量5%，通气量1VVmm[单位时间（min）发酵液体积（m³）内通入的标准状态下的空气体积（m³）]，在130r/min、30℃、20h条件下，制得50L种子罐培养液，活菌数311×10⁸个/克。

4、制备混合种子液：

将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子10L、土壤球菌的液体种子10L和罗威登斯菌的液体种子10L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数246×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数103.5×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数106×10⁸个/克、土壤球菌活菌数36.5×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制

通过干料螺旋输送机，将细度均为80目的粉剂稻壳和麸皮分别输送至转鼓式发酵罐的上方进料口，进入发酵罐体内。麸皮和稻壳的质量比为4：1，即麸皮88Kg，稻壳粉22 Kg，由进水口通入冷水110 Kg，发酵罐的体积为1000L。

启动发酵罐电源开关，电机带动装发酵罐体匀速转动，设定转速50r/min，通过罐体内的翻板和破碎器带动物料翻动、疏松、混合，混合的时间为3～5min。将经过过滤器的121℃的蒸汽通入发酵罐体内，对发酵罐内的物料进行灭菌30min，之后进行冷却降温至30～32℃。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂

将由（一）制备好的混合液体种子30L按照接种量12.5%（质量比），通过转鼓式发酵罐上方的接种分配管喷入罐体内，随着发酵罐体的转动，混合液体种子和由（二）得到的灭菌后的物料均匀混合。向罐体内通入无菌空气直接喷向物料，通气量1.5VVm。发酵过程中从发酵罐的接种分配管按需要喷入适量的无菌水，通过湿度传感器控制进水量保证罐体内湿度为60%。设定发酵的温度为32℃，发酵罐转速80r/min，发酵时间30h。将制得的微生物菌剂由出料口卸料，重量为250 Kg，湿度45.8%。

（四）生物修复剂的制备

配方：

微生物菌剂 250Kg；

纳米级贝壳粉 180Kg；

纳米活性硅肥 80Kg；

黑果腺肋花楸果渣粉 490Kg。

制备方法：

利用湿料螺旋输送机将配方量的微生物菌剂、纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥和黑果腺肋花楸果渣粉，通过干料螺旋送料机输送到双轴桨叶式混合机，启动混合机进行混合，混合时间2min。混合后的物料经测定其水分为18%，重量为1吨。然后经过粉碎（120目筛上筛余物≤20%），最后根据需求包装成规格为2 Kg /袋、5 Kg /袋、10 Kg /桶、25 Kg /桶、50Kg /桶。袋或桶采用内包装和外包装，内包装采用聚乙烯塑料袋材料，外包装采用牛皮纸材料。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数64.2×10⁸亿/ g，其中巨大芽孢杆菌活菌数27.51×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数28.26×10⁸亿/ g、土壤球菌活菌数8.43×10⁸亿/ g，pH值为7.2，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为8.56%。

实施例2

（一）液体发酵

巨大芽孢杆菌的液体种子、土壤球菌的液体种子及罗威登斯菌的液体种子的制备方法与实施例1相同。

制备混合种子液时，将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子10L、土壤球菌的液体种子15L和罗威登斯菌的液体种子5L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数238×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数102.7×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数104.2×10⁸个/克、土壤球菌活菌数30.2×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制过程与实施例1相同。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂的过程与实施例1相同。

（四）生物修复剂的制备的配方与制备方法与实施例1相同。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数56.2×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数25.62×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数25.38×10⁸个/克、土壤球菌活菌数5.2×10⁸个/克，pH值为7.1，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为9.81%。

实施例3

（一）液体发酵

巨大芽孢杆菌的液体种子、土壤球菌的液体种子及罗威登斯菌的液体种子的制备方法与实施例1相同。

制备混合种子液时，将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子10L、土壤球菌的液体种子10L和罗威登斯菌的液体种子10L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数246×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数103.5×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数106×10⁸个/克、土壤球菌活菌数36.5×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制过程与实施例1相同。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂的过程与实施例1相同。

（四）生物修复剂的制备

配方：

微生物菌剂 200Kg；

纳米级贝壳粉 150Kg；

纳米活性硅肥 70Kg；

黑果腺肋花楸果渣粉 580Kg。

制备方法：同实施例1所述制备方法。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数62.0×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数26.33×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数27.82×10⁸个/克、土壤球菌活菌数7.85×10⁸个/克，pH值为7.1，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为8.83%。

实施例4

（一）液体发酵

巨大芽孢杆菌的液体种子、土壤球菌的液体种子及罗威登斯菌的液体种子的制备方法与实施例1相同。

制备混合种子液时，将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子15L、土壤球菌的液体种子10L和罗威登斯菌的液体种子5L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数238.7×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数102.9×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数104.9×10⁸个/克、土壤球菌活菌数31.9×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制过程与实施例1相同。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂的过程与实施例1相同。

（四）生物修复剂的制备

配方：

微生物菌剂 200Kg；

纳米级贝壳粉 100Kg；

纳米活性硅肥 210Kg；

黑果腺肋花楸果渣粉 490Kg。

制备方法：同实施例1所述制备方法。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数55.2×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数25.36×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数25.12×10⁸个/克、土壤球菌活菌数5.08×10⁸个/克，pH值为7.1，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为9.86%。

实施例5

（一）液体发酵

巨大芽孢杆菌的液体种子、土壤球菌的液体种子及罗威登斯菌的液体种子的制备方法与实施例1相同。

制备混合种子液时，将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子10L、土壤球菌的液体种子15L和罗威登斯菌的液体种子5L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数238×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数102.7×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数104.2×10⁸个/克、土壤球菌活菌数30.2×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制过程与实施例1相同。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂的过程与实施例1相同。

（四）生物修复剂的制备的配方及制备方法同实施例4。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数55.0×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数25.37×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数25.18×10⁸个/克、土壤球菌活菌数5.1×10⁸个/克，pH值为7.1，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为9.84%。

实施例6

（一）液体发酵

巨大芽孢杆菌的液体种子、土壤球菌的液体种子及罗威登斯菌的液体种子的制备方法与实施例1相同。

制备混合种子液时，将制备的巨大芽孢杆菌的液体种子10L、土壤球菌的液体种子15L和罗威登斯菌的液体种子5L混合均匀得到混合种子液30L，活菌总数238×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数102.7×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数104.2×10⁸个/克、土壤球菌活菌数30.2×10⁸个/克。

（二）固态混合发酵培养基的配制过程与实施例1相同。

（三）固态混合发酵培养，制备微生物菌剂的过程与实施例1相同。

（四）生物修复剂的制备

配方：

微生物菌剂 250Kg；

纳米级贝壳粉 240Kg；

纳米活性硅肥 110Kg；

黑果腺肋花楸果渣粉 400Kg。

制备方法：同实施例1所述制备方法。

经试验测定，得到生物修复剂成品活菌总数53.91×10⁸个/克，其中巨大芽孢杆菌活菌数25.12×10⁸个/克、罗威登斯菌活菌数25.10×10⁸个/克、土壤球菌活菌数5.02×10⁸个/克，pH值为7.0，置于室温环境且无阳光直射的环境下存放12个月后菌种的死亡率为9.92%。

本发明的用于治理复合污染土壤的生物修复剂可以单独使用，也可以与基肥和/或复合肥混合使用，每亩每季的使用量为50～100Kg。使用所述生物修复剂既可以显著降低土壤（尤其是酸性土壤）中铅、锌、镉等重金属的总量和有效态含量，降幅分别达到50%以上，还能改善作物的品质、增强土壤肥力、杀死土壤中的病害菌和线虫、促进作物生长、保持土壤生态平衡、降低酸性土壤中氢离子浓度，改善作物的生长状况，使受到重金属污染的酸性土壤可以正常种植作物。

【试验例1】

2015年6月25日-2015年10月15日在山东省泰安市岱岳区满庄镇华家岭村进行了39亩集中连片的农田土壤重金属污染修复示范工作。对选取的示范基地进行土壤（耕作层20cm）污染现状调查监测，结果表明：待修复的农田土壤为污灌土壤，土壤的pH为6.84,

土壤中的镉总量0.3mg/kg～0.4mg/kg，平均值为0.362mg/kg，镉有效态含量为0.195mg/kg，铅总量250mg/kg～300mg/kg，平均值为279mg/kg，铅有效态含量为167mg/kg、锌总量100～130mg/kg，平均值为116mg/kg，锌有效态含量70mg/kg。土壤中的镉、铅、锌这三种重金属总量分别都超过了国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），均为轻度污染（1＜P_{环境质量指数}≤2），土壤中的重金属铬、汞、砷等重金属均没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995）。

（1）农田土壤所种植的作物：北方玉米。

（2）修复试验实施情况

试验设CK（普通专用肥）、T1、T2、T3、T4等5种处理。

T1为实施例1所得修复剂对土壤进行修复处理。

T2为实施例2所得修复剂对土壤进行修复处理。

T3为实施例3所得修复剂对土壤进行修复处理。

T4处理为重量比为25：18：8的微生物菌剂、纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥组成的混合物，对土壤进行修复，微生物菌剂依据实施例一所得。

T1、T2、T3、T4处理中分别包含50kg／亩，75kg／亩，100kg／亩三个施用量梯度，CK施用普通专用肥75kg／亩，３次重复，随机区组排列，共39个实验小区，每个实验小区面积1亩。

小区起埂打桩，埂界分明，水地留渠，单灌单排，杜绝串灌。向每个实验小区的耕地人工撒施，及时使用旋耕犁进行翻耕2遍，翻耕深度18～20厘米。各处理之间氮、磷、钾的施用水平基本一致。

（3）分析方法

所有样品的全量消解采用HF-HCLO4-HNO3混合酸在聚四氟乙烯坩锅中消化，然后用ICPOES测定。其具体测试方法包括：原子吸收法和原子荧光法等方法。其中土壤中镉总量按GB／T17141-1997测定，土壤中铅总量按GB／T17141-1997测定，土壤中锌总量按GB／T17137-1997测定，土壤中铬总量按GB／T17137-1997测定，土壤中汞总量利用原子荧光法测定，土壤中砷总量采用原子荧光法测定，土壤中镉、铅、锌、铬、汞砷的有效态含量测定采用二乙烯三胺五乙酸提取/电感耦合等离子体原子发射光谱法。

（4）本发明的用于治理Pb、Zn、Cd复合污染土壤的生物修复剂用量对土壤中各种金属含量的影响

土壤重金属修复剂的３个用量水平对土壤中各种金属有效态含量均有一定的降低作用，其中降幅最大的是为镉，其次是铅、再次是锌。T1处理对土壤中镉、铅、锌含量的降低作用最明显，其次是T2处理的效果，再其次是T3处理的效果，最后是T4处理的效果，而对照处理的土壤重金属有效态含量几乎无变化。

除CK外，所有的处理中，修复化效果均呈现如下趋势：75kg／亩＞50kg／亩＞100kg／亩。

T1、T2、T3、T4处理分别如下：

T1：实施例一所得修复剂，向土壤中施用50kg／亩，75 kg／亩，100kg／亩三个梯度；

T2：实施例二所得修复剂，向土壤中施用50kg／亩，75 kg／亩，100kg／亩三个梯度；

T3:实施例三所得修复剂，向土壤中施用50kg／亩，75 kg／亩，100kg／亩三个梯度；

T4：为重量比为25：18：8的微生物菌剂、纳米级贝壳粉、纳米活性硅肥组成的混合物，其中微生物菌剂依据实施例一所得，向土壤中施用50kg／亩，75 kg／亩，100kg／亩三个梯度。

试验结果显示：

T1处理(即微生物菌剂25：纳米级贝壳粉18：纳米活性硅肥8：黑果腺肋花楸果渣粉49，其中微生物菌剂固态发酵时巨大芽孢杆菌种子液：罗威登斯菌液体种子液：土壤球菌种子液体的质量比为1：1：1)中，向土壤中施用75kg／亩时，修复效果最明显，3次重复分别比对照处理土壤中镉总量降低了51.00％、51.19％、52.03%，平均降低了51.4％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.94％、50.13％、51.11%，平均降低了51.06％，处理后的土壤中镉总量为0.176mg/kg，有效态含量为0.095mg/kg，处理后的土壤镉总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为镉无污染状态；3次重复分别比对照处理土壤中铅总量降低了50.08％、51.08％、51.02 %，平均降低了50.72％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.61％、50.00％、50.83%，平均降低了50.48％，处理后的土壤中铅总量为137.49mg/kg，有效态含量为82.70mg/kg，处理后的土壤铅总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为铅无污染状态；

3次重复分别比对照处理土壤中锌总量降低了50.60％、50.48％、50.82 %，平均降低了50.63％，3次重复分别比对照处理土壤中锌有效态含量降低了50.21％、50.00％、50.13%，平均降低了50.11％，处理后的土壤中锌总量为106.63mg/kg，有效态含量为59.86mg/kg，处理后的土壤锌总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB15618-1995），为锌无污染状态；修复后的土壤pH为7.01，且施用本发明的土壤重金属修复剂不会造成二次污染。每亩每季度钝化剂成本为800-1000元。

T2处理(即微生物菌剂25：纳米级贝壳粉18：纳米活性硅肥8：黑果腺肋花楸果渣粉49，其中微生物菌剂固态发酵时巨大芽孢杆菌种子液：罗威登斯菌液体种子液：土壤球菌种子液体的质量比为2：3：1)中，向土壤中施用75kg／亩时，修复效果最明显，3次重复分别比对照处理土壤中镉总量降低了51.00％、51.12％、51.17%，平均降低了51.1％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.81％、50.13％、50.49%，平均降低了50.47％，处理后的土壤中镉总量为0.177mg/kg，有效态含量为0.097mg/kg，处理后的土壤镉总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为镉无污染状态；3次重复分别比对照处理土壤中铅总量降低了50.01％、51.00％、50.42%，平均降低了50.48％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.30％、50.00％、50.26%，平均降低了50.19％，处理后的土壤中铅总量为138.16mg/kg，有效态含量为83.18mg/kg，处理后的土壤铅总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为铅无污染状态；

3次重复分别比对照处理土壤中锌总量降低了50.15％、50.08％、50.12%，平均降低了50.12％，3次重复分别比对照处理土壤中锌有效态含量降低了50.07％、50.00％、50.1%，平均降低了50.06％，处理后的土壤中锌总量为105.58mg/kg，有效态含量为59.93mg/kg，处理后的土壤锌总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB15618-1995），为锌无污染状态；修复后的土壤pH为7.00，且施用本发明的土壤重金属修复剂不会造成二次污染。每亩每季度钝化剂成本为850-1100元。

T3处理（即微生物菌粉：纳米级贝壳粉：纳米级硅肥：黑果腺肋花楸果渣粉重量比为20：15：7：58，其中微生物菌剂固态发酵时巨大芽孢杆菌种子液：罗威登斯菌液体种子液：土壤球菌种子液体的质量比为1：1：1）中，向土壤中修复效果最明显，3次重复分别比对照处理土壤中镉总量降低了51.10％、50.42％、50.67%，平均降低了50.73％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.31％、50.08％、50.14%，平均降低了50.18％，处理后的土壤中镉总量为0.178mg/kg，有效态含量为0.097mg/kg，处理后的土壤镉总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为镉无污染状态；3次重复分别比对照处理土壤中铅总量降低了50％、50.37％、50.28%，平均降低了50.22％，3次重复分别比对照处理土壤中镉有效态含量降低了50.14％、50.00％、50.07%，平均降低了50.07％，处理后的土壤中铅总量为138.89mg/kg，有效态含量为83.38mg/kg，处理后的土壤铅总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），为铅无污染状态；

3次重复分别比对照处理土壤中锌总量降低了50.05％、50.03％、50.02%，平均降低了50.03％，3次重复分别比对照处理土壤中锌有效态含量降低了50.00％、50.00％、50.1%，平均降低了50.03％，处理后的土壤中锌总量为107.93mg/kg，有效态含量为59.96mg/kg，处理后的土壤锌总量没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB15618-1995），为锌无污染状态；修复后的土壤pH为6.95，且施用本发明的土壤重金属修复剂不会造成二次污染。每亩每季度钝化剂成本为1000-1200元。

T4处理（即微生物菌粉：纳米级贝壳粉：纳米级硅肥重量比为25：18：8，其中微生物菌剂固态发酵时巨大芽孢杆菌种子液：罗威登斯菌液体种子液：土壤球菌种子液体的质量比为1：1：1）中，向土壤中施用75kg／亩时，修复效果最明显。

在T4处理中，无论是50kg／亩，还是75kg／hm²和100kg／亩，土壤中镉、铅、锌有效态含量降低幅度均未超过15%，在T4处理中，向土壤中用量为75kg／亩时钝化效果最大，土壤中镉、铅、锌有效态含量降低幅度分别为13.52%、12.55%、12.04%，但处理后的土壤还是超过了国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995），修复后的土壤还是为镉、铅、锌重金属污染临界状态。修复后的土壤pH为6.90，且施用本发明的土壤重金属修复剂不会造成二次污染，每亩每季度钝化剂成本为700-850元。

（5）本发明的用于治理Pb、Zn、Cd复合污染土壤的生物修复剂用量对玉米竞技性状与产量的影响

与对照相比，土壤重金属修复剂的３个用量水平都有利于改善玉米生长性状和经济性状，

即能提高结实率和粒重，有利提高水稻生物学产量，进而提高经济产量。每个处理都是向土壤中施用75kg／亩时，效果最明显。

其中，T1、T2、T3处理对玉米经济性状和产量的影响最明显，相比对照，结实率分别增加了12.33％、12.18％和11.69％，千粒重分别增加1.92％、0.83％和0.59％，产量分别增加3.87％、2.06％和1.14％。

再次是T4处理的效果，相比对照，结实率分别增加2.44％、2.01％和1.57％，千粒重分别增加0.24％、0.19％和0.1％，产量分别增加0.67％、0.44％和0.28％。

【实验例2】

2015年8月20日～2015年11月10日在吉林省农安县巴吉垒镇东铁村村民郭某承包的12个蔬菜大棚，占地面积共12亩，种植的蔬菜为反季节金皮西葫芦。

待修复的土壤为污灌土壤，土壤的pH为6.73,土壤中的重金属镉、铅、锌这三种重金属均为轻度污染（1＜P_{环境质量指数}≤2），土壤中的重金属铬、汞、砷等重金属均没有超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995）。

施用本发明的土壤重金属修复剂为实施例一所制得：即微生物菌剂25：纳米级贝壳粉18：纳米活性硅肥8：黑果腺肋花楸果渣粉49重量比的混合物，其中微生物菌剂固态发酵时巨大芽孢杆菌种子液：罗威登斯菌液体种子液：土壤球菌种子液体的质量比为1：1：1。

试验设CK、T1、T2、T3等４种处理，３次重复，随机区组排列。每个实验小区面积1亩（即1个大棚）。向每个实验小区的耕地人工撒施其中，CK施普通专用肥（对照处理），T1施用本发明的土壤重金属修复剂50kg／亩，T2施用本发明的土壤重金属钝化剂75kg／亩，T3施用本发明的土壤重金属钝化剂100kg/亩。定植前施用本发明的土壤重金属修复剂撒施后深翻25厘米，7天后再定植。

结果分析

每亩添加75千克（即T2处理）的本发明的土壤重金属修复剂对土壤中的镉、铅、锌的总量和有效态含量降低幅度均最大，处理后土壤中镉总量、铅总量、锌总量均没超过国家二级土壤标准（土壤环境质量标准 GB 15618-1995）；其中修复后土壤中镉有效态含量降低52.46%，铅有效态含量为降低51.78%，修复后土壤中镉有效态含量降低51.33%，修复后土壤pH为6.96，与对照相比，产量增加了25.31%，T1、T3处理的效果比T2要差一些，土壤中的铅、铬有效态含量降低幅度均在45%左右，相比对照，增产幅度分别为15.62%、14.86%。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于治理复合污染土壤的生物修复剂，其特征在于：按质量份计， 该生物修复剂由以下原料混合而成：

微生物菌剂 10～35份；

纳米级贝壳粉 5～25份；

纳米活性硅肥 2～10份；

黑果腺肋花楸果渣粉 40～55份。

2.根据权利要求1所述的用于治理复合污染土壤的生物修复剂，其特征在于：按质量份计，该生物修复剂由以下原料混合而成：

微生物菌剂 15～30份；

纳米级贝壳粉 10～20份；

纳米活性硅肥 5～10份；

黑果腺肋花楸果渣粉 45～50份。

3.根据权利要求1所述的用于治理复合污染土壤的生物修复剂，其特征在于：所述微生物菌剂为巨大芽孢杆菌、罗威登斯菌及土壤球菌的混合菌液，混合菌液中各微生物的含量为：巨大芽孢杆菌含量≥100×10⁸个/克，罗威登斯菌含量≥100×10⁸个/克，土壤球菌含量≥20×10⁸个/克。

4.权利要求1、2或3所述的用于治理复合污染土壤的生物修复剂在酸性农田重金属污染土壤中进行原位钝化修复中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述污染土壤的重金属为铅、镉、锌，其中，铅浓度为250～300mg/Kg，镉浓度0.3～0.4mg/Kg，锌浓度为200～230mg/Kg，土壤的pH值为6.0～7.0。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述土壤为小麦、玉米、水稻、蔬菜种植土壤。