CN105533120A - 一种花生纳米肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用高压微射流方法物理改性花生蛋白提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肽的方法，该方法的步骤包括：制备花生分离蛋白，高压微射流处理，中性蛋白酶和复合蛋白酶连续酶解、灭酶、离心、超滤、干燥后获得具有高ACE抑制活性的花生纳米肽。本发明提高了酶解效率，降低了生产成本，所获得的花生纳米肽的粒径为14.4nm，ACE抑制IC50值为0.192mg/mL，表现了良好的ACE抑制活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，涉及一种花生纳米肽的制备方法。
背景技术
花生蛋白为制备具有优良生理活性短肽的重要蛋白源，一些花生蛋白酶解产物、三肽、四肽和六肽等陆续被发现具有较好的ACE抑制活性，但ACE抑制单体肽因为需要经过高成本、低得率的酶解、纯化工艺，因此实际应用有限。提高酶解效率、充分挖掘花生蛋白中蕴藏的大量高生理活性短肽，同时适当降低生产成本，提高混合型花生短肽在功能食品中的应用，成为花生短肽的重要发展方向，而对花生蛋白进行物理改性就是一个具有实际应用价值的有效方案。
动态高压微射流(DHPM)技术是一种新兴的物理处理手段，其工作原理是通过高速碰撞、高频振荡、瞬时压降、强烈剪切等作用实现对物料的改性，能够实现对物料的改性或者改变大分子的结构。高压微射流处理目前已经成为提高蛋白质功能性质的一种有效方法，但采用高压微射流改性蛋白质以有利于短肽制备的研究尚未见报道。
因此有必要开发利用高压微射流方法对蛋白质进物理行改性的技术，从而为制备具有高生物活性的短肽产品提供新的有效的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肽的方法。
为达到以上目的，本发明提供了一种花生纳米肽的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：将花生蛋白制备成花生分离蛋白；
步骤二：将花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为4-6％的花生分离蛋白水溶液，采用高压微射流在100-135MPa压力下循环处理2-4次后干燥，得到物理改性的花生分离蛋白；
步骤三：将所述物理改性的花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为8-10％的水溶液，加入中性蛋白酶，酶解反应80-110min；得到中间酶解液(即第一次酶解液)；
步骤四：在中间酶解液中加入复合蛋白酶，酶解反应80-110min，得到最终酶解产物；
步骤五：对所得酶解产物进行灭酶处理，离心取上清液，取分子量小于1KD的滤过液，干燥后获得纳米肽。所述纳米肽为高ACE抑制活性纳米肽。
图1为本发明所述高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肽的方法示意图。
优选的，所述花生分离蛋白由如下的碱溶酸沉方法制备而成：将花生蛋白粉与去离子水混合，制备质量体积比浓度为9-11％的花生蛋白溶液，调节pH值至7.8-8.2，搅拌溶解110-130min；3800-4200rpm离心14-16min；取上清液，调节pH值至4.4-4.6，静置沉淀50-70min；3800-4200rpm离心14-16min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至6.8-7.2，搅拌溶解100-140min；喷雾干燥，得花生分离蛋白。
优选的，在步骤一中，所述花生分离蛋白中蛋白含量大于85％。
其中，可以利用NaOH和HCl进行pH值调节。
其中，步骤二中，通过高压微射流处理对花生分离蛋白进行物理改性，通过高压微射流的高速碰撞、高频振荡、瞬时压降、强烈剪切等作用实现对物料的改性，使蛋白质结构解聚，以暴露更多的酶切位点，增进酶的作用效率。
优选的，在步骤二中；高压微射流的压力为110-125MPa，循环次数为3次。
优选的，所述花生分离蛋白水溶液的质量体积比浓度为4-6％。
优选的，在步骤一中，所述花生分离蛋白中蛋白含量大于85％。
优选的，在步骤三中，中性蛋白酶的添加量为3800-4500U/g底物，酶解时间为90-110min、酶解温度为42-48℃。特别优选的，中性蛋白酶的添加量为3900-4000U/g底物，酶解时间为95-105min、酶解温度为45℃。
优选的，在步骤三中，先将物理改性的花生分离蛋白的水溶液在75-85℃水浴中震荡保温8-12min后再利用中性蛋白酶进行酶解。
优选的，复合蛋白酶的添加量为300-450U/g底物；酶解时间为90-110min、酶解温度为42-48℃。特别优选的，复合蛋白酶的添加量为350-380U/g底物；酶解时间为95-105min、酶解温度为45℃。
可选的，在步骤五中将所述酶解产物在85-95℃下水浴8-12min灭酶。
步骤五中离心的目的是为了除去部分未酶解的杂质；超滤采用1KD的超滤膜进行，滤液即为高活性的纳米肽，这主要是根据前期大量的结果发现，小于1KD的肽具有更好的ACE抑制活性。经测定，小于1KD的肽粒径低于100nm，因此所获得肽就是纳米肽。
本发明还提供了利用上述方法制备的花生纳米肽。
本发明还提供了所述的花生纳米肽在制备用于抑制ACE活性的制剂中的应用。所述制剂为降压食品或药品。
有益效果：
1.本发明所述的花生纳米肽的制备方法，采用优化的料液浓度、高压微射流压力和循环次数，实现了花生蛋白结构的最大程度展开，为后续酶解创造了最佳的作用环境；
2.本发明所述的花生纳米肽的制备方法，有效降低了酶解成本，提高了酶解效率；对比同类底物，采用相同种类的酶，中性蛋白酶用量降低了25％，酶解时间降低了17％；复合蛋白酶用量则相差不大，酶解时间降低了17％；
3.本发明所述的高压微射流处理提高酶解效率，制备花生纳米肽的方法，所获得的酶解产物短肽得率达到88.26％，所获得的分子量小于1000Da的短肽含量占98.15％，均高于原料未采用高压微射流处理的同等酶解工艺；未经超滤的短肽的ACE抑制活性，其IC50值为0.55mg/mL，高于未采用高压微射流处理同等酶解工艺的对照；而经超滤处理后，其IC50值为0.192mg/mL，粒径为14.4nm，具有高ACE抑制活性。
附图说明
图1为本发明所述高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肽的方法示意图。
图2为本发明中所得的高压微射流不同压力处理花生分离蛋白及对照微观结构。
图3为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照酶解产物ACE抑制活性IC50值变化。
图4为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照中性蛋白酶酶解不同底物浓度、酶解时间和酶用量对短肽得率的影响。
图5为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照复合蛋白酶酶解不同酶解时间和酶用量对短肽得率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
下述实施例中采用的高压微射流处理为通过微射流高压均质机进行，设备为美国BEEinternational公司生产；所采用的中性蛋白酶、复合蛋白酶均为北京索莱宝科技有限公司生产；粒径分析采用的仪器为英国马尔文仪器有限公司生产的Zeta电位分析仪；透射电镜为日本日立公司生产的H-7500透射电子显微镜；高效液相色谱采用美国Waters公司的Waters1525高效液相色谱系统；
下述实施例中通过透射电镜法进行微观结构的观察：
用去离子水将固体样品配制成浓度为1mg/mL(w/v)的溶液，取一滴溶液加到覆有聚乙烯醇缩甲醛脂膜的铜网上，铜网水平放置2～3min使分子聚集体沉积到网面上，用滤纸吸去表面多余溶液，之后滴加2％的醋酸双氧釉溶液负染2min，将铜网在滤纸上放置3min使充分染色并吸去多余的染液，干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。
花生短肽分子量分布的测定：高效液相色谱法
分别精确称取固体样品2.0mg，加入去离子水10mL配制成0.2mg/mL浓度的短肽溶液，采用高效液相色谱对短肽的分子量分布进行测定，条件为：色谱柱：TSKgel2000SWXL300mm×7.8mm；流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝45：55：0.1，流速：0.5mL/min，温度：30℃；检测波长：220nm。
ACE抑制活性的测定：高效液相色谱法
分别精确称取花生短肽，加入去离子水分别配制成2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.05mg/mL浓度的短肽溶液，采用高效液相色谱对短肽的ACE抑制活性进行测定，条件为：色谱柱SunfireTM-C18(250×4.6mm)，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝50：50：0.05，流速：0.4mL/min，温度：30℃；检测波长：228nm。测定结果采用Origin8.0软件计算IC50值。
短肽得率的测定：采用三氯乙酸可溶性氮法。
精密称取1g左右中间酶解产物样品入小烧杯，加入10ml10％三氯乙酸，电磁搅拌，溶解，定容至50ml容量瓶中，静止沉降30分钟后，4200rpm离心30分钟，取上清液5ml采用福林酚法测定含氮量；同法测定中间酶解产物的含氮量。
短肽得率＝上清液含氮量/中间酶解产物含氮量×100％
短肽粒径的测定：采用Zeta电位仪测定。
将所得短肽配制成1mg/mL(w/v)浓度的溶液，用Zeta电位仪测定粒径，测定温度25℃。
实施例1
第一步：称取150g花生蛋白粉，加入去离子水1500mL配制成10％(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白60g，加入去离子水1000mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取100mL花生分离蛋白溶液，在不施加压力情况下，加入到设备中，接取流出液，作为对照；然后，依次取样100mL溶液作为7个不同压力处理组，分别在30MPa、60MPa、90MPa、120MPa、150MPa、180MPa、210MPa压力下，通过微射流超高压均质机，接取流出液。将流出液分别干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：将经高压微射流处理的花生分离蛋白及其对照采用透射电子显微镜进行微观结构观察，结果如图2所示。可以看出，120MPa成为花生分离蛋白质在水溶液中状态的分界点，120MPa以下时，蛋白质卷曲缠绕结构逐渐打开，到120MPa时结构打开最为彻底，此时，花生蛋白处于最大解聚状态；而达到150MPa及以上压力时，蛋白质呈明显的重聚集状态。因此选择120MPa处理可以达到最大的蛋白质展开状态，有利于酶解效率提高和更多基团暴露。
实施例2不同压力处理对花生短肽分子量和ACE抑制活性的影响。
第一步：称取300g花生蛋白粉，加入去离子水3000mL配制成10％(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白120g，加入去离子水2000mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取150mL花生分离蛋白溶液，在不施加压力情况下，加入到设备中，接取流出液，作为对照；然后，依次取样100mL溶液作为7个处理组，分别在30MPa、60MPa、90MPa、120MPa、150MPa、180MPa、210MPa压力下，通过微射流超高压均质机，接取流出液。将流出液分别干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：取高压微射流不同压力及对照处理获得的花生分离蛋白粉，配制成浓度为9.2％的花生分离蛋白溶液，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照3965U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到酶解液；
第四步：将所获得的酶解液，按照360U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，酶解反应100min，得到最终酶解产物；
第五步：将酶解产物于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，即为花生短肽；
第六步：分别精确称取花生短肽配制成0.2mg/mL浓度的短肽溶液。测定不同压力下各处理及对照的分子量分布，结果见表1。可以看出，高压微射流处理显著促进了花生蛋白酶解产物分子量降低，随压力升高，＜1000Da短肽含量显著增加，对照＜1000Da短肽含量为81.07％，120MPa处理时达到91.30％，210MPa处理后达到99.39％，几乎所有短肽分子量均＜1000Da；
第七步：分别精确称取花生短肽，加入去离子水配制成一定浓度的短肽溶液，采用高效液相色谱对短肽的ACE抑制活性进行测定，结果见图3。可以看出，高压微射流处理对ACE抑制活性产生较大影响，与分子量变化略有不同，ACE抑制活性的IC50值在120MPa处理时达到最低，表明此时具有最高的ACE抑制活性，这与图2中的变化相似，说明120MPa时蛋白质处于最高解聚状态时，更有利于后续酶解进行，且能够产生高ACE抑制酶解产物。
表1高压微射流不同压力处理及对照酶解后分子量分布表
实施例3高压微射流处理与对照酶解物料浓度的影响。
第一步：称取100g花生蛋白粉，加入去离子水1000mL配制成10％(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白45g，加入去离子水750mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取750mL花生分离蛋白溶液，在120MPa压力下循环处理3次，接取流出液。将流出液干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：取经高压微射流处理的花生分离蛋白粉，分别配制成浓度为6％、7％、8％、9％、10％的花生分离蛋白溶液，取未经高压微射流处理的花生分离蛋白粉配制成同样浓度的花生分离蛋白溶液为对照，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照4000U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到酶解液；
第四步，将酶解液分别于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，得到花生中间酶解产物；
第五步：精密称取中间酶解产物用三氯乙酸可溶性氮法测定短肽得率，结果见图4A。从图4A中可以看出，经过HPM处理的花生分离蛋白在不同条件下均比对照有较高的短肽得率。图4A中可发现，在底物浓度8％时有最高的短肽得率，浓度升高，短肽得率下降，浓度低于8％时，也有较高的短肽得率。
实施例4高压微射流处理与对照酶解中性蛋白酶酶解时间的影响。
采用与实施例3相同的花生纳米太制备方法获得中间酶解产物，区别仅在于，取经高压微射流处理的花生分离蛋白粉，配制成浓度为8％的花生分离蛋白溶液，取未经高压微射流处理的花生分离蛋白粉配制成同样浓度的花生分离蛋白溶液为对照，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照4000U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，分别酶解反应60、80、100、120、150min；得到酶解液。
将酶解液分别于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，得到花生中间酶解产物；精密称取中间酶解产物用三氯乙酸可溶性氮法测定短肽得率，结果见图4B。可发现，酶解时间增加，短肽得率持续升高，但到达100min后，短肽得率变化幅度变小，综合考虑酶解效率和成本，100min取得了最佳实施效果。
实施例5高压微射流花生分离蛋白与对照酶解中性蛋白酶用量的影响。
采用与实施例3相同的花生纳米肽制备方法获得中间酶解产物，区别仅在于，取经高压微射流处理的花生分离蛋白粉，配制成浓度为8％的花生分离蛋白溶液，取未经高压微射流处理的花生分离蛋白粉配制成同样浓度的花生分离蛋白溶液为对照，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照3000、3500、4000、4500、5000U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到酶解液；
将酶解液分别于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，得到花生中间酶解产物；精密称取中间酶解产物用三氯乙酸可溶性氮法测定短肽得率，结果见图4C，可知，随酶用量增加，酶解短肽得率也持续增加，综合考虑酶解效率和成本4000U/g获得了最佳实施效果。
实施例6高压微射流处理与对照对复合蛋白酶解时间的影响。
第一步：称取250g花生蛋白粉，加入去离子水2500mL配制成1:10(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白90g，加入去离子水1500mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取1500mL花生分离蛋白溶液，在120MPa压力下循环处理3次，接取流出液。将流出液干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：取经高压微射流处理的花生分离蛋白粉，分别配制成浓度为8％的花生分离蛋白溶液，取未经高压微射流处理的花生分离蛋白粉配制成同样浓度的花生分离蛋白溶液为对照，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照3965U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到中间酶解液；
第四步：将所获得的中间酶解液，按照400U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，酶解反应100min，得到最终酶解产物；
第五步：将所获得中间酶解液，加入360U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，分别酶解反应80、90、100、110、120min，得到最终酶解产物；
第六步：将酶解产物于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，即为花生短肽；
第七步：精密称取酶解产物用三氯乙酸可溶性氮法测定短肽得率，测定结果见图5。从图5中可以看出，高压微射流处理获得的分离蛋白制备短肽在实验条件下最终酶解产物短肽得率均高于对照，这表明高压微射流处理的有效性，但需要注意的是，高压微射流处理对复合蛋白酶获得的酶解产物与对照的差距要低于中性蛋白酶，说明高压微射流处理对于复合蛋白酶酶解效率的影响相对较弱。从图5(A)中可以看出，随酶解时间延长，短肽得率上升，但酶解时间超出100min后，时间延长，短肽得率变化不大，因此100min为最适的酶解时间。
实施例7高压微射流处理与对照对复合蛋白酶用量的影响。
第一步：称取250g花生蛋白粉，加入去离子水2500mL配制成1:10(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白90g，加入去离子水1500mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取1500mL花生分离蛋白溶液，在120MPa压力下循环处理3次，接取流出液。将流出液干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：取经高压微射流处理的花生分离蛋白粉，分别配制成浓度为8％的花生分离蛋白溶液，取未经高压微射流处理的花生分离蛋白粉配制成同样浓度的花生分离蛋白溶液为对照，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照3965U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到中间酶解液；
第四步：将所获得的中间酶解液，分别按照200、300、400、500、600U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，酶解反应100min，得到最终酶解产物；
第五步：将所获得中间酶解液，加入360U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，分别酶解反应100min，得到最终酶解产物；
第六步：将酶解产物于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，干燥，即为花生短肽；
第七步：精密称取酶解产物用三氯乙酸可溶性氮法测定短肽得率，测定结果见图5B，复合蛋白酶用量在400U/g底物时，短肽得率达到最高，超过400U/g底物，短肽得率反而下降，因此复合用量以不超过400U/g底物更为适宜。
实施例8超滤处理对花生短肽粒径与ACE抑制活性的影响。
第一步：称取300g花生蛋白粉，加入去离子水3000mL配制成1:10(w/v)浓度溶液，调节pH值至8.0，搅拌溶解120min，4000rpm离心15min；取上清液，调节pH值至4.5，静置沉淀60min；4000rpm离心15min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至7.0，搅拌溶解120min；喷雾干燥，得花生分离蛋白；
第二步：称取喷雾干燥后的花生分离蛋白120g，加入去离子水2000mL配制成6％(w/v)溶液，搅拌溶解60min；开启微射流超高压均质机，取750mL花生分离蛋白溶液，在120MPa压力下循环处理3次，接取流出液。将流出液干燥，即得经高压微射流处理的花生分离蛋白；
第三步：取高压微射流不同压力及对照处理获得的花生分离蛋白粉，配制成浓度为9.2％的花生分离蛋白溶液，80℃水浴振荡器中保温10min；然后将溶液放置于45℃水浴振荡器中，按照3965U/g(酶/底物)添加量加入中性蛋白酶，酶解反应100min；得到酶解液；
第四步：将所获得的酶解液，按照360U/g(酶/底物)添加量加入复合蛋白酶，酶解反应100min，得到最终酶解产物；
第五步：将所得酶解产物置于90℃水浴中10min灭酶，4000rpm离心15min；取上清液，超滤，分别取分子量小于1KD、大于1KD的滤过液，干燥，获得具有一定活性的花生短肽。
第六步：采用高效液相色谱测定高压微射流处理不同肽段及对照的ACE抑制活性及粒径。测定结果见表2。从表2中可以看出，经过高压微射流处理和超滤分离的＜1KD短肽，粒径只有14.4nm，而ACE抑制活性IC50值为0.192mg/mL，与对照差异显著，表明本发明可获得具有高ACE抑制活性的纳米肽。
表2高压微射流处理不同肽段及对照的ACE抑制活性及粒径
| 肽 | ACE抑制活性IC50(mg/mL) | 粒径(nm) |
| 对照混合肽 | 1.76±0.115 | 124.5±18.4 |
| 高压微射流处理混合肽 | 0.55±0.084 | 88.1±4.9 |
| 高压微射流处理＜1KD肽 | 0.192±0.011 | 14.4±0.2 |
| 高压微射流处理＞1KD肽 | 2.59±0.218 | 146.7±12.6 |
本发明具有以下有益效果：对比同类原料和采用同品种中性蛋白酶和复合蛋白酶，本发明明显提高了底物浓度，降低了酶解时间和酶用量，其中以中性蛋白酶用量和酶解时间减少更为明显，总体提高酶解效率达到20％以上；更重要的是，本发明所获得的酶解产物具有更好的ACE抑制活性，IC50值为0.192mg/mL，为目前已经报道的花生酶解产物中(非纯化短肽)最低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种花生纳米肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：将花生蛋白制备成花生分离蛋白；
步骤二：将花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为4-6％的花生分离蛋白水溶液，采用高压微射流在100-135MPa压力下循环处理2-4次后干燥，得到物理改性的花生分离蛋白；
步骤三：将所述物理改性的花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为8-10％的水溶液，加入中性蛋白酶，酶解反应80-110min；得到中间酶解液；
步骤四：在中间酶解液中加入复合蛋白酶，酶解反应80-110min，得到最终酶解产物；
步骤五：对所得酶解产物进行灭酶处理，离心取上清液，取分子量小于1KD的滤过液，干燥后获得纳米肽。
2.根据权利要求1所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，所述花生分离蛋白的制备方法包括：将花生蛋白粉与去离子水混合，制备质量体积比浓度为9-11％的花生蛋白溶液，调节pH值至7.8-8.2，搅拌溶解110-130min；3800-4200rpm离心14-16min；取上清液，调节pH值至4.4-4.6，静置沉淀50-70min；3800-4200rpm离心14-16min；取沉淀，加水溶解，调节pH值至6.8-7.2，搅拌溶解100-140min；喷雾干燥，得花生分离蛋白。
3.根据权利要求1所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤二中；高压微射流的压力为110-125MPa，循环次数为3次。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤三中，中性蛋白酶的添加量为3800-4500U/g底物；酶解时间为90-110min。
5.根据权利要求4所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤三中，先将物理改性的花生分离蛋白的水溶液在75-85℃水浴中震荡保温8-12min后再利用中性蛋白酶进行酶解。
6.根据权利要求1-3和5中任意一项所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤四中，复合蛋白酶的添加量为300-450U/g底物；酶解时间为90-110min、酶解温度为42-48℃。
7.根据权利要求3所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤一中，所述花生分离蛋白中蛋白含量大于85％。
8.根据权利要求1或7所述的花生纳米肽的制备方法，其特征在于，在步骤五中将所述酶解产物在85-95℃下水浴8-12min灭酶。
9.利用权利要求1-8中任意一项所述的方法制备的花生纳米肽。
10.权利要求9所述的花生纳米肽在制备用于抑制ACE活性的制剂中的应用。
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