CN105531408A

CN105531408A - 染色体构象划分产物捕获

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Publication number: CN105531408A
Application number: CN201580001229.XA
Authority: CN
Inventors: C·利特斯特; S·蒂佐内弗; J·阿格蕾丝蒂
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2014-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: US9822396B2; EP2986761A1; US20150225786A1; EP2986761B1; EP2986761A4; CN105531408B; WO2015123588A1

Abstract

提供了用于在划分产物中进行染色质或染色体构象捕获试验的方法、组合物和试剂盒。该方法包括：a)交联染色体DNA；b)用内切核酸酶消化交联的DNA产物；c)划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；和d)检测单个划分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个DNA序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件表明所述2个或更多个DNA序列元件在细胞或完整核中相近。

Description

染色体构象划分产物捕获

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年2月13日提交的美国临时申请61/939,565号的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

用于研究染色体体内构象的技术已经揭示了大量关于基因调控机制的信息。例如，染色体构象研究可揭示通过远程DNA序列元件对基因的远程调控。一种用于确定染色体的体内构象的广泛使用的方法被称为染色体构象捕获，或3C。其它技术延伸3C以提供其它信息或能够进行更高通量的分析。这类技术包括，例如，4C、5C、6C、Hi-C、ChIP-环和ChIA-PET。

一般而言，染色体构象捕获技术包括固定染色质的三维组织的交联步骤、内切核酸酶消化步骤、连接步骤和生成核酸分子文库的反交联步骤。该文库含有核酸分子，其中由于交联事件之前的三维染色质结构而邻近的序列元件在反交联事件之后在一级结构水平上邻近。然后可采用各种扩增、测序或其它核酸检测方法来鉴定三维空间上邻近的序列元件。

连接步骤可能需要广泛优化以提供合适的核酸分子文库。例如，连接交联的元件使得它们存在于同一核酸分子上的分子内连接事件一般有利。相反，不交联的序列元件连接的分子间连接事件一般需要避免或最小化。作为另一个示例，确保在反交联之后没有发生连接是重要的。作为另一个示例，不充分的连接可能产生提供很少信息的分子文库。

发明内容

本申请提供了使用划分产物进行染色体构象捕获的改进方法。在一些情况中，该方法不需要连接步骤。在一些情况中，该方法改善了连接步骤的效率、完成度或保真性或其组合。

在一些实施方式中，本发明提供了一种检测在细胞或完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法，包括：a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的DNA产物，其中在细胞中相近的染色体DNA序列交联；b)得到交联的DNA产物；c)用内切核酸酶消化交联的DNA产物以形成含多种交联的DNA消化片段的混合物；d)划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；并且e)检测单个划分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个DNA序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件表明所述2个或更多个DNA序列在细胞或完整核中相近。

在一些实施方式中，本发明提供了一种检测在细胞或完整核中相近的核酸序列元件的方法，包括：a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的DNA产物，其中在细胞中相近的核酸序列交联；b)得到交联的DNA产物；c)用内切核酸酶消化交联的DNA产物以形成含多种交联的DNA消化片段的混合物；d)划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；并且f)检测单个划分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个核酸序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个核酸序列元件表明所述2个或更多个核酸序列在细胞或完整核中相近。

在一些方面中，划分交联的DNA消化片段，使得各划分产物中交联的DNA消化片段的平均数量为约1或更低。在一些情况中，划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物包括产生至少1000、至少10000、至少20000、至少100000、或至少1000000个划分产物。在一些情况中，划分产物在体积上小于约100nL、小于约10nL或小于约1nL。

在一些方面中，该方法还包括反交联，从而从划分产物中交联的DNA消化片段中生成2个反交联的DNA消化片段。在一些情况中，在消化交联的DNA的步骤之后进行反交联。

在一些方面中，检测包括检测划分产物中反交联的DNA消化片段，其中在单个划分产物中检测到2个反交联的DNA消化片段表明这2个反交联的DNA消化片段曾交联，由此检测到在核中相近的染色体DNA序列元件。在一些情况中，反交联包括将划分产物加热至至少约55℃、至少约65℃、或至少约95℃。在一些情况中，反交联包括用蛋白酶，如蛋白酶K孵育划分产物。

在一些方面中，检测包括检测划分产物中反交联的同时含有DNA和RNA的DNA消化片段，其中在单个划分产物中检测到2个反交联的DNA消化片段表明这2个反交联的DNA消化片段曾交联，由此检测在核中相近的DNA和/或RNA序列元件。在一些情况中，反交联包括将划分产物加热至至少约55℃、至少约65℃、或至少约95℃。在一些情况中，反交联包括用蛋白酶，如蛋白酶K孵育划分产物。在一些情况中，检测包括逆转录。

在一些方面中，多个划分产物中的全部、几乎全部或一部分含有核酸条码。在一些情况中，核酸条码连接到固体支持物。

在一些方面中，检测包括DNA扩增。在一些情况中，DNA扩增包括PCR。在一些情况中，DNA扩增包括靶向基因座扩增(TLA)。在一些情况中，DNA扩增包括逆转录或RT-PCR。在任意前述的实施方式、方面或情况中，检测步骤可包括核酸测序。

在一些方面中，交联完整核中的染色体DNA包括用交联剂孵育细胞。在一些方面中，交联完整核中的染色体DNA包括用交联剂孵育完整核。

在一些实施方式中，可在多个完整核或含完整核的多个细胞上进行任意前述方法。在一些情况中，该方法还包括对2个或更多个核酸(例如，DNA)序列元件的交联频率进行定量，从而对这2个或更多个核酸(例如，DNA)序列元件在完整核群中相近的频率进行定量。

在一些实施方式中，本发明提供了包含划分产物的组合物，所述划分产物含有交联的DNA消化片段。在一些实施方式中，本发明提供了包含划分产物的组合物，所述划分产物含有交联的DNA消化片段，该消化片段含有DNA和RNA。在一些实施方式中，本发明提供了包含划分产物的组合物，所述划分产物含有反交联的DNA消化片段，其中反交联的DNA消化片段是下述过程的产物：交联完整核中DNA、用核酸内切酶消化DNA、形成含有消化的和交联的DNA的划分产物并反交联。在一些方面中，划分产物含有反交联的DNA消化片段和反交联的RNA或cDNA。在一些方面中，划分产物还包含DNA扩增试剂或核酸测序试剂。在一些情况中，DNA扩增试剂或核酸测序试剂包含寡核苷酸引物或DNA聚合酶。在一些情况中，组合物还包含至少1000、至少10000、至少20000、或至少100000个划分产物。在一些情况中，划分产物在体积上小于约100nL、小于约10nL或小于约1nL。

在一些情况中，检测划分产物中2个或更多个核酸(例如，DNA、cDNA或RNA)序列元件的存在可包括检测各虚拟划分产物中的这类元件。例如，检测到2个或更多个具有相同条码的核酸序列元件可表示这2个或更多个核酸序列元件位于相同的划分产物中并因此在细胞或完整核中相近。替代地，划分产物中的检测可指检测物理划分产物。

附图说明

图1显示了进行基于划分产物的染色体捕获分析的方法的几个实施方式。

图2显示了进行基于划分产物的染色体捕获分析的方法的一个实施方式。在该实施方式中，双链衔接子寡核苷酸偶联到固体支持物颗粒上并被划分。衔接子寡核苷酸可含有对各固体支持物颗粒独特的条码。衔接子寡核苷酸也可含有用于测序和/或扩增的一个或多个限制性位点和引物结合位点。可用限制性酶消化交联的DNA划分产物并且划分成条码化的划分产物。可用限制性酶(例如，热稳定限制性酶)消化衔接子寡核苷酸以生成与交联的DNA片段的一个或多个末端相容并连接到交联的DNA片段的粘性末端。可合并划分产物，并且DNA片段任选地去交联并扩增以生成扩增子。然后可对扩增子进行测序以分析染色体构象。

图3显示了进行基于划分产物的染色体捕获分析的方法的一个实施方式。在该实施方式中，单链引物寡核苷酸与固体支持物颗粒偶联或整合到凝胶支持物颗粒中并被划分。该引物寡核苷酸可含有对于各固体支持物颗粒独特的条码，和可与交联的DNA杂交的杂交区。杂交区域可以是，例如所示的随机六聚体。可用限制性酶消化交联的DNA划分产物并且划分成条码化的划分产物。可通过例如加热溶解固体或凝胶支持物。交联的DNA可去交联并通过来自单链引物寡核苷酸的随机引物扩增来生成扩增子。然后划分产物可被合并。然后可对扩增子进行测序以分析染色体构象。

图4显示了进行基于划分产物的染色体捕获分析的方法的几个实施方式。在该实施方式中，交联的DNA被划分，并且在一个或多个下游加工步骤中将额外的试剂注射到划分产物中。

定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARYOFCELLANDMOLECULARBIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING，ALABORATORYMANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分为多个部分或“划分产物”。划分产物可以是固体或流体。在一些实施方式中，划分产物是固体划分产物，例如微通道。在一些实施方式中，划分产物是流体划分产物，例如液滴。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物，或乳液。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在其它实施方式中，液体划分产物是与相邻水性液滴在物理或化学上分开的水性液滴，使得一个液滴的内容物不会扩散到相邻液滴中。

术语“探针”指与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子(例如蛋白质、核酸、适体等)。与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子的非限制性示例包括核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适体。

术语“染色体”是指细菌或真核染色体。

本文所用的染色体结构包括一级、二级、三级和四级结构。一级染色体结构，或一级结构是指染色体的核苷酸序列。二级结构可以指较高水平的结构组织，如双链DNA的双螺旋结构，与核小体结合的双链染色体DNA的11-nm纤维(例如，一串上的珠子)，或层叠和折叠的11-nm纤维的30-nm纤维。三级结构是指将30-nm纤维折叠成环、转角、假结、结构域或其它三级结构元件。在一些情况中，三级染色体结构可使在染色体的一级序列中彼此远离的DNA序列元件相近。四级结构是指2个或更多个不同的染色体的分子间组织。在一些情况中，四级染色体结构可使在物理上不相连的DNA序列元件相近。本文所用术语“染色质”用于指代与蛋白质或其它核酸结合的一个或多个染色体。例如，染色质可与组蛋白、转录因子、抑制因子、增强子、聚合酶、修复酶、甲基化酶、去甲基化酶、非编码RNA分子等结合。本文所用术语“染色体”涵盖染色质。

用于核中2个核酸序列元件之间的距离时，术语“邻近”是指在三维空间中这2个核酸序列元件之间的距离。如此，染色体中在一级序列上接近(例如，在约10、50、100、150、200、或250bp或更多以内)的DNA序列元件总是彼此相近。在一些情况中，在染色体的一级序列中彼此远离(例如，隔开超过约200、250、300、400、500、1000、1500、2000、5000、10000、25000、50000、100000、250000、500000或1000000bp)的DNA序列元件可能由于染色体的三级或四级结构而彼此相近。在一些情况中，位于不同染色体的DNA序列元件可能由于染色体的四级结构而彼此相近。在一些情况中，核酸序列元件就一级序列而言彼此远离，因为一个或多个元件是染色体DNA序列元件而一个或多个其它元件是RNA(或cDNA)序列元件。如此，核酸序列元件可以是，或可以在不同的核酸分子内。在这类情况中，2个或更多个核酸序列元件可由于它们形成复合物而彼此相近。例如，非编码RNA可与基因组中的一个或多个DNA序列元件结合。

“DNA序列元件”是指双链或单链DNA序列。在一些实施方式中，划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件(例如，多核苷酸)表明这2个DNA序列元件在获得这些DNA序列元件的一个或多个细胞中相近存在。在一些情况中，DNA序列元件是cDNA序列。例如，DNA序列元件可以是通过RNA的逆转录生成的cDNA序列。

术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如³²P、³H)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋白质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于使抗体偶联所述标记物的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物结合技术》(BioconjugateTechniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(AcademicPress，Inc.)。

“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记探针)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。

发明详述

I.引言

本文所述的是用于检测核酸序列元件之间的染色体或染色质相互作用的方法、组合物和试剂盒。例如，描述了用于检测在完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法、组合物和试剂盒。这类方法、组合物和试剂盒可例如，用于检测基因组的生理和病理变化、分析表观遗传基因调控、检测远端增强子元件在基因表达中的作用、鉴定参与DNA重组的DNA元件、并检测干细胞或多潜能所需的染色体或染色质结构要求。在一些情况中，本发明的方法、组合物和试剂盒可提供对2个或更多个核酸序列元件在细胞或细胞群中相邻的概率的绝对或相对定量。

II.方法

本文所述的是一种检测在细胞或完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法，包括：a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的DNA产物，其中在细胞中相近的染色体DNA序列交联；b)得到交联的DNA产物；c)用内切核酸酶消化交联的DNA产物以形成含多种交联的DNA消化片段的混合物；d)划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；并且e)检测单个划分产物中相对于基因组的一级序列在远端的2个或更多个DNA序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件表明所述2个或更多个DNA序列在核中相近。

本文还描述了一种检测细胞或完整核中与一个或多个染色体DNA序列元件相近的核酸序列元件的方法，该方法包括：a)交联细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的核酸产物，其中在细胞中相近的一个或多个染色体DNA序列元件和一个或多个RNA序列元件交联；b)得到交联的DNA产物；c)用内切核酸酶消化交联的DNA产物以形成含有多个交联的DNA消化片段的混合物；d)划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；和e)检测单个划分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个核酸序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个核酸序列元件表明这2个或更多个核酸序列元件在核中相近。

a.交联

如本文所述，DNA可在细胞或完整核中交联以形成交联的DNA产物。在一些情况中，DNA在一个或多个细胞中交联。在其它情况中，获得或提供一个或多个完整核，并且DNA在其中交联。获得或提供完整核的方法和组合物是本领域已知的。参见例如，Wilkie等，MethodsMolBiol.2008；463：23-41以及Blobel和Potter，Science，1966；154：3757：1662-1665。

DNA可以在细胞或完整核中交联。在一些情况中，采用可逆交联剂和方法。在其它情况中，采用导致可逆交联的交联剂或方法。示例性的交联剂包括，但不限于，甲醛、多聚甲醛、福尔马林、其它类似醛类和其它多功能(例如，双功能或三功能)交联剂，其可将蛋白质-蛋白质、DNA-DNA、RNA-RNA、RNA-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-DNA或蛋白质-RNA-DNA分子共价交联在一起。在一些情况中，用交联剂进行交联，该交联剂将蛋白质伯氨基(例如，与DNA结合的蛋白质)与在相邻蛋白质或DNA分子中发现的其它氮原子可逆交联。

可以合适的浓度应用交联剂。例如，交联剂可与一个或多个细胞或完整核接触持续约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、80、90分钟或更长。与一个或多个细胞或完整核接触的交联剂的浓度可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、1.0、1.2、1.5、2、3、4、或约5％。在一些情况中，可在合适的一段时间之后猝灭交联以抑制或停止交联反应。合适的猝灭试剂包括含有一种或多种胺，例如一种或多种伯胺的试剂。合适的猝灭剂还包括，例如，甲基胺、乙醇胺、Tris、二甲基胺、甲基乙醇胺、三甲基胺、氮丙啶、哌啶、苯胺、甘氨酸、天冬氨酸、精氨酸和谷氨酸。

在一些情况中，选择交联条件和交联剂使得仅相对紧密的相互作用发生交联。例如，可选择可在约1、2、3、4、或至约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或的距离上桥连的交联剂。作为另一个示例，可选择可在约和/或低于约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或的距离上桥连的交联剂。作为另一个示例，可选择可在约，或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或的距离上桥连的交联剂。

在一些情况中，所述交联将与染色体DNA或染色质结合蛋白质结合的RNA分子交联。因此，交联的DNA产物可含有DNA、RNA、蛋白质或其组合。可如本文所述检测或定量交联的RNA分子。例如，交联的RNA分子可被逆转录并且可检测所得的cDNA产物。在一些情况中，所述交联将RNA和DNA交联。在这类情况中，交联的DNA产物可含有RNA和DNA。可如本文所述检测或定量RNA和DNA分子。例如，RNA分子可被逆转录并且可检测所得的cDNA产物以及染色体DNA、或扩增子或其片段。

b.消化

可从一个或多个细胞或完整核获得或提供交联的染色体DNA产物，然后消化。替代地，可消化在一个或多个细胞或完整核中的交联的DNA产物，并且然后可获得交联且经消化的DNA片段。消化交联的DNA的方法和组合物是本领域已知的。在一些情况中，通过用内切核酸酶接触交联的DNA产物来进行消化。在一些情况中，采用非特异性核酸酶如切割任意DNA序列的内切核酸酶，或具有2个、3个或4个碱基对识别序列的内切核酸酶。例如，可用微球菌核酸酶或DNA酶I来消化交联的DNA产物。替代地，可用切割较大识别序列，如5、6、7、8或更多个碱基对识别序列的内切核酸酶消化交联的DNA产物。示例性内切核酸酶包括但不限于AluI、ApoI、AseI、BamHI、BfuCI、BglII、BsaJI、BstKTI、BstYI、BtgI、ClaI、CviKI-1、DpnI、DpnII、Eco47III、EcoRI、EcoRV、EcoP15I、FaiI、HaeIII、HindIII、HpaII、HpyCH4III、KpnI、MboI、MnlI、MseI、MspI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、PstI、RsaI、SacI、SacII、SalI、Sau3AI、SfiI、SmaI、TaqI、Tsp509I、XbaI、XhoI或XmaI。作为另一种替代，可通过物理手段剪切交联的DNA产物，如通过超声波或通过挤出通过小孔。

c.纯化

在消化或物理剪切之前或之后，可从一个或多个细胞或完整核中纯化交联的DNA产物。在一些情况中，从非交联的DNA、非交联的RNA、蛋白质、细胞碎片、细胞膜、交联剂、猝灭的交联剂或猝灭剂中的一个或多个中纯化交联的DNA产物。在一些实施方式中，一个或多个细胞或完整核可与含洗涤剂的溶液接触以得到交联的DNA产物，或交联的DNA产物的片段。在一些情况中，洗涤剂包括但不限于，阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂或其组合。这类组合包括：一种或多种阳离子洗涤剂与一种或多种阴离子洗涤剂；一种或多种阳离子洗涤剂与一种或多种非离子洗涤剂；一种或多种阳离子洗涤剂与一种或多种两性离子洗涤剂；一种或多种阴离子洗涤剂与一种或多种非离子洗涤剂；一种或多种阴离子洗涤剂与一种或多种两性离子洗涤剂；和一种或多种非离子洗涤剂与一种或多种两性离子洗涤剂。在一些情况中，一种或多种阴离子洗涤剂与一种或多种非离子洗涤剂组合。阴离子洗涤剂的非限制性示例包括烷基硫酸盐(例如，十二烷基硫酸钠)、烷基磺酸盐(例如，辛烷磺酸)、胆盐、多库酯钠盐和N-月桂基肌氨酸。阳离子洗涤剂的非限制性示例包括苯扎氯铵、十六烷基氯化苯基偶氮二氨基吡啶、十二烷基三甲基氯化铵、吉拉尔特试剂和非离子洗涤剂的非限制性示例包括聚乙二醇、IGEPAL、Nonidet^TM-P40、Poloxamer407、皂苷和两性洗涤剂的非限制性示例包括CHAPS、L-α-溶血磷脂酰胆碱、DDMAB和米替福新。

交联的DNA产物可被进一步纯化，或替代地在消化或物理剪切之前，在消化或物理剪切之后，或在消化或物理剪切之前和之后。纯化交联的DNA产物的方法还包括柱纯化，例如，用阴离子交换树脂，将产物与功能化以结合核酸的珠(例如，磁珠)孵育等。

d.划分

在消化或物理剪切之后，从消化或剪切产生的交联的DNA产物的片段可被划分到多个划分产物中。划分产物可包括多种类型的划分产物中的任一种，包括固体划分产物(如孔或管)和流体划分产物(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，这些划分产物是液滴。在一些实施方式中，这些划分产物是微通道。划分样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO2010/036352、US2010/0173394、US2011/0092373和US2011/0092376，其全部内容各自通过引用纳入本文。

交联的DNA划分产物产物的片段可被划分到任意数量的划分产物中。一般地，选择划分产物的数量以确保少数、明显少数、很少、基本没有或没有划分产物含有多个交联的片段。因此，单个划分产物中存在多个DNA序列元件表明这2个或多个DNA序列元件存在于同一交联的片段中。类似地，单个划分产物中一个或多个RNA和一个或多个DNA序列元件的存在表明这些序列元件存在于相同的交联的片段中。划分产物确保充分划分所需的划分产物数量取决于多个因素，包括但不限于：(a)待查询的基因组大小；(b)消化/剪切的方法；(c)生成的交联的片段(例如，交联的DNA片段)的数量和大小；(d)染色体构象捕获分析所需的分辨率；和(e)所需的统计学显著性。一般而言，划分产物的数量为至少约500、1000、10000或20000、30000、50000或更多。

在一些实施方式中，试剂如交联的产物(例如，经消化或剪切的交联的DNA、RNA或DNA/RNA片段)、缓冲剂、酶(例如，用于逆转录、扩增、条码化和/或测序的聚合酶)、底物、核苷酸、引物、盐等在划分之前混合在一起，然后划分样品。在一些情况中，试剂包括聚合酶并且在将试剂混合在一起之后不久划分样品，使得基本上全部、或大部分的聚合酶活性出现在划分之后。在其它情况中，在聚合酶缓慢或完全不进行的温度下混合试剂，然后划分样品，并且调节反应温度以使聚合酶反应进行。例如，可在冰上、5℃、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35℃或更高温度下合并试剂。一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择温度，在该温度下，一种或多种聚合酶没有活性。在一些情况中，采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显聚合。

在一些情况中，可使用一种或多种热启动聚合酶，如热启动DNA-依赖性DNA聚合酶或宿主启动RNA-依赖性DNA聚合酶来混合试剂。因此，交联的产物(例如，经消化或剪切的交联的DNA、RNA或DNA/RNA片段)、缓冲剂、盐、核苷酸、标记物、酶等可混合然后划分。随后，可通过加热划分产物混合物以激活这一种或多种宿主启动的聚合酶来引发聚合反应，包括多轮聚合。

另外，试剂可混合在一起，而没有一种或多种引发酶促反应(例如，聚合和/或扩增)所必需的试剂。混合物然后可被划分到一组第一划分产物混合物中，然后可通过融合这组第一划分产物混合物和提供必要试剂的一组第二划分产物混合物来提供一种或多种必要试剂。替代地，可向第一划分产物混合粉中加入必要试剂，而不形成第二划分产物混合物。例如，必要试剂可分散到第一划分产物混合物油包水液滴的组中。作为另一个示例，缺失的试剂可加入含有所述第一划分产物混合物组的一组微通道中。

在一些实施方式中，试剂可混合在一起以形成反应混合物或被划分。随后，可向划分产物中加入一种或多种其它试剂。例如，可向划分产物中注射一种或多种试剂。在一些情况中，可向划分产物和流体之间的界面施加电场以打破界面并使至少一部分的流体进入划分产物。作为另一个示例，一种或多种试剂可通过微流体技术导向微米或纳米尺寸孔中的划分产物中。用于向划分产物注射试剂的方法、组合物和装置包括但不限于WO/2010/0151776所述的那些。

可通过融合划分、注射、微流体或其它手段加入的试剂包括但不限于反交联试剂、逆转录试剂(例如，引物和/或RNA-依赖性DNA聚合酶)、扩增试剂、检测试剂、测序试剂、连接试剂、条码化试剂或其组合。例如，可向划分产物中加入蛋白酶(例如，蛋白酶K)来反交联。作为另一个示例，可向划分产物中加入DNA依赖性DNA聚合酶(和任选的一种或多种引物)以扩增划分产物中的核酸。作为另一个示例，可向划分产物中加入条码、引物、连接酶、聚合酶或其组合来使划分产物中的核酸条码化。在一些情况中，条码接合到，或另外整合到或关联固体或凝胶支持物，并且带条码(和任选的其它条码化试剂，如引物、聚合酶、连接酶或其组合)的固体或凝胶支持物通过融合、注射、微流体或其它手段加入到一个或多个划分产物中。

作为另一个示例，可向划分产物中加入用于对靶DNA进行测序的试剂。这类试剂可包括但不限于核苷酸或核苷酸类似物(例如，可检测标记的核苷酸、终止核苷酸、可逆终止核苷酸或其组合)、聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶或其组合。作为另一个示例，可向划分产物中加入检测试剂。这类试剂可包括但不限于插入染料、可检测的标记的核酸探针和/或引物、分子信标、适体或其组合。作为另一个示例，可向划分产物中加入逆转录试剂。这类试剂可包括逆转录酶和/或逆转录引物(例如，寡脱氧胸苷引物或序列特异性引物)。可在多个点处向划分产物中加入试剂(例如，通过注射、输注等)。例如，可向条码化的划分产物中加入交联的片段。随后，可向划分产物中加入条码化试剂。随后，可向划分产物中加入逆转录试剂。

在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中至少0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。

在一些实施方式中，使油相流过包含待检测DNA序列元件的水性样品，从而形成液滴。在一些实施方式中，包含待检测的DNA序列元件的水性样品还包括缓冲的溶液和用于检测DNA序列元件的2种或更多种引物，或2个或更多个引物对。

该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是AmmoniumKrytox(Krytox-AS)、KrytoxFSH的铵盐或KrytoxFSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62％。

在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇以约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇以约0.18％(w/w)的浓度添加。

在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前去除或留在原位。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。

在将液滴转化成微胶囊之后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输划分产物混合物。例如，可在一个位置处收集样品，划分到含有酶、缓冲剂和/或引物或其它探针的液滴中，任选地可进行一个或多个聚合反应，然后可加热该划分产物以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。

这些微胶囊划分产物可含有一种或多种探针(如本文所述经标记探针)并可抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的划分产物数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个划分产物。在一些实施方式中，样品-探针孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各划分产物之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。

在一些实施方式中，将样品划分成至少500个划分产物、至少1000个划分产物、至少2000个划分产物、至少3000个划分产物、至少4000个划分产物、至少5000个划分产物、至少6000个划分产物、至少7000个划分产物、至少8000个划分产物、至少10000个划分产物、至少15000个划分产物、至少20000个划分产物、至少30000个划分产物、至少40000个划分产物、至少50000个划分产物、至少60000个划分产物、至少70000个划分产物、至少80000个划分产物、至少90000个划分产物、至少100000个划分产物、至少200000个划分产物、至少300000个划分产物、至少400000个划分产物、至少500000个划分产物、至少600000个划分产物、至少700000个划分产物、至少800000个划分产物、至少900000个划分产物、至少1000000个划分产物、至少2000000个划分产物、至少3000000个划分产物、至少4000000个划分产物、至少5000000个划分产物、至少10000000个划分产物、至少20000000个划分产物、至少30000000个划分产物、至少40000000个划分产物、至少50000000个划分产物、至少60000000个划分产物、至少70000000个划分产物、至少80000000个划分产物、至少90000000个划分产物、至少100000000个划分产物、至少150000000个划分产物或至少200000000个划分产物。

在一些实施方式中，该样品被划分到足够数量的划分产物中，使得全部、基本全部或至少大部分划分产物含有不超过5个交联的DNA分子(例如约0.5、1、2、3、4或5个交联的DNA、RNA、或DNA/RNA分子)。在一些实施方式中，该样品被划分到足够数量的划分产物中，使得全部、基本全部或至少大部分划分产物含有不超过1个交联的DNA分子(例如约0.5、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75或1个交联的DNA、RNA、或DNA/RNA分子)。在一些实施方式中，各划分产物中存在平均不超过5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05个交联的DNA、RNA或DNA/RNA分子。在一些实施方式中，各划分产物中存在平均约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1、2、3、4或5个交联的DNA、RNA或DNA/RNA分子。在一些实施方式中，在含有交联的DNA、RNA或DNA/RNA分子的划分产物群中，划分产物中交联的DNA分子的模数为约1或0。

在一些实施方式中，划分产物含有过量的检测试剂。例如，在一些实施方式中，划分产物含有平均超过约1(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、15、20、40、50、100、150、200、250、300、350、400、500、750、1000或更多)种引物、引物对、或用于检测靶DNA序列元件的探针分子。在一些实施方式中，划分产物中存在用于检测多种靶DNA序列元件的多种检测试剂。例如，可在一个或多个划分产物中检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的靶DNA序列元件。

在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。

在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，液滴体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中，液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25％。在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。

e.检测

在一些实施方式中，在一个或多个划分产物中检测2个或更多个DNA序列元件存在或缺失。单个划分产物中存在2个或更多个DNA序列元件表明这2个DNA序列元件在其来源的细胞或完整核中是物理上相近的。在一些情况中，单个划分产物中检测到DNA序列元件的频率表示这2个序列元件在其来源的细胞群或完整核中物理上相近的频率。

在一些实施方式中，在一个或多个划分产物中检测RNA序列元件存在或缺失。在一些情况中，单个划分产物中RNA序列元件和一个或多个DNA序列元件的存在或缺失表明这2个或更多个序列元件在其来源的细胞或完整核中是物理上相近的。在一些情况中，单个划分产物中检测到RNA和任选的一个或多个DNA序列元件的频率表示这2个或更多个序列元件在其来源的细胞群或完整核中物理上相近的频率。RNA序列元件可逆转录成相应的互补DNA序列元件并且然后使用任意本文所述的DNA检测方法来检测。

在一些情况中，RNA序列元件是非编码RNA序列元件或其片段。例如，本文所述的是用于检测一种或多种非编码RNA序列元件与一种或多种染色体DNA序列元件物理结合的方法、组合物和试剂盒。非编码RNA序列元件包括，但不限于小RNA、Y-RNA、核糖开关、piRNA、CRISPR/Cas向导RNA、端粒酶RNA、X-失活-特异性转录本、反义RNA、长非编码RNA、小核仁RNA等。

检测DNA序列元件的方法是本领域已知的并且包括但不限于探针或引物的杂交、测序、和/或扩增。在一些实施方式中，可扩增交联的DNA产物或其片段(例如，来自消化或剪切的片段)。在一些情况中，可扩增DNA序列元件或其部分。在一些情况中，可在划分之前、在划分产物中或在划分产物合并后扩增DNA。在一些情况中，可扩增DNA作为检测的手段，或作为条码化的手段。在一些情况中，扩增可与连接、反交联、条码化、检测、测序、交联、或消化或剪切中的一种或多种联合进行。

更一般地，本文所述的扩增方法可用于扩增交联的DNA产物、其片段、或其中的DNA序列元件的数量。扩增可以在交联、消化或剪切、反交联、连接、检测或条码化之前和/或之后。DNA扩增的方法是本领域所熟知的并且包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、环介导的等温扩增(LAMP)和高分支RCA(HRCA)。在一些情况中，PCR可以是终点PCR、实时PCR、qPCR或数字PCR(例如，数字液滴PCR)。

在一些情况中，可通过靶向基因座扩增(TLA)来扩增一个或多个DNA序列元件。TLA使用感兴趣的基因座内的核苷酸的物理相邻作为选择基础。DNA经交联和消化。在一些情况中，经交联和消化的DNA重新连接。然后使用小基因座特异性引物来扩增数万个周围的碱基对。通过这种方式，可扩增基因座的完整序列，无论其核苷酸组成。进而可用例如下一代测序技术对扩增的基因座进行测序。在一些情况中，使用多个小基因座特异性引物来在多个基因座上进行TLA。

扩增可采用一个或多个引物。在一些情况中，一个或多个扩增引物与条码衔接子引物相同。在一些实施方式中，在复合混合物而不是一组划分产物混合物中进行扩增。例如，可在一组划分产物中条码化交联的DNA、RNA、或DNA/RNA片段，该划分产物可合并然后扩增。在一些情况中，在第一或第二条链合成引物上使用条码序列或标记物可使得能够实践本发明以确定扩增然应产物衍生自哪个划分产物混合物。因此，虽然划分产物不必在物理上保持完整，它们仍被维持完整。

在其他实施方式中，在进行消化、条码化、反交联、和/或逆转录、和/或连接、或其组合的同一划分产物中进行扩增。通过液滴输注、微通道流、扩散或其组合向划分产物中加入扩增试剂。在其它实施方式中，可在一组划分产物混合物中进行消化、条码化、反交联、和/或逆转录、和/或连接，可回收该产物，然后在第二组划分产物混合物中进行扩增。

在一些实施方式中，通过DNA测序方法分析划分产物，包括但不限于，片段分析，双脱氧测序(例如，Sanger测序)，Maxam-Gilbert链终止测序，染料终止子测序，染料引物测序，焦磷酸测序，下一代测序方法包括，高通量测序，包括大量同步记号测序，SOLiD测序(例如，通过连接测序)，通过杂交测序，质子离子半导体测序，DNA纳米球测序，单分子测序和纳米孔测序。

可使用数字读取实验，例如数字分析来计算特定DNA序列元件邻近一个或多个其它DNA序列元件的频率。可通过检测含有DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件的交联的DNA、RNA、或DNA/RNA片段与一个或多个含有其它DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件的不同片段交联的次数来确定频率。这可通过划分交联的产物或其片段并鉴定含有2个或更多个DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件的划分产物来确定。一般而言，数字分析的过程包括针对待检测DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件的存在，确定样品的一个或多个划分产物是阳性还是阴性。

在一些实施方式中，如果在划分产物中检测到扩增的靶核酸，则划分产物对于DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件的存在是“阳性”的。在一些实施方式中，通过用与探针连接的标记物(例如，与探针如寡核苷酸、蛋白质、肽或适体探针连接的荧光、化学发光、放射性或酶标记物)检测生成的信号的存在来检测扩增的靶核酸。在一些实施方式中，通过检测两种标记的探针都存在于同一划分产物中时生成，但同一划分产物中不存在一种或全部两种探针时不生成的信号产生来检测划分产物中两种或更多种探针。在一些实施方式中，如果没有检测到扩增的靶核酸，则该划分产物对于靶分子的存在是“阴性”的。

在一些实施方式中，检测方法包括荧光检测。使用荧光检测累积的扩增产物的方法是本领域所熟知的。合适的方法的示例包括，例如，使用插入染料、使用与5′核酸酶切割联用的标记的探针和使用结构化的探针。

使用插入染料采用仅与双链DNA结合的荧光化合物。在该类型的方法中，扩增产物(其在一些情况中是双链的)结合溶液中的染料分子以形成复合物。使用合适的染料，可能区分在溶液中保持游离的染料分子和与扩增产物结合的染料分子。例如，某些染料仅当与双链DNA如逆转录和/或扩增产物结合时高效发出荧光。这类染料的示例包括但不限于SYBR绿和Pico绿(来自分子探针公司(MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市))、溴化乙啶、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst33258，TOTO-I、YOYO-1和DAPI(4′，6-二眯基-2-苯基吲哚盐酸盐)。例如，Zhu等，Anal.Chem.66：1941-1948(1994)提供了关于使用插入染料的其它描述。

在一些实施方式中，可使用插入染料来区分不含靶标、单阳性和双阳性划分产物。在一些情况中，可使用插入染料在单阳性、双阳性和多重阳性(例如，对3、4、5或更多种结构上不同的靶序列或其扩增子阳性)划分产物之间区分。例如，在一些情况中，含2种或更多种靶序列和检测靶序列或其扩增子的插入染料的划分产物可提供比仅含靶序列或其扩增子的划分产物更强的可检测信号。类似地，仅含1种靶序列或其扩增子和插入染料的划分产物可提供比不含靶序列或其扩增子的划分产物更高的可检测信号。作为另一个示例，可改变用于扩增特定靶序列的引物的浓度以改变在终点扩增(例如，PCR或RT-PCR)反应中生成的扩增子的量。因此，用插入染料进行检测可基于信号强度区分不同靶序列扩增子的存在或缺失。可在例如McDermott等，Anal.Chem.，2013，85(23)，第11619-11627页；和US/2014/0178889中找到用于对靶序列、逆转录子和/或其扩增子进行多重检测的方法、组合物和装置。

荧光核酸酶试验是可与本文所述的装置和方法成功联用的产物定量方法的另一个示例。这种监测扩增产物形成的方法的基础是使用双重标记的荧光寡核苷酸探针测量扩增子累积，这是一种在文献中被经常称为“TaqMan”法的方法。

这类试验中所用的探针可以是用2种不同的荧光染料标记的短(例如，长度为约20-25个碱基)多核苷酸。在一些情况中，该探针的5′末端接合报告染料，而3′末端接合淬灭部分。在其它情况中，染料可在探针上的其它位置处接合。所述探针可设计为与靶核酸上的探针结合位点具有至少基本的序列互补性。与侧接探针结合位点的区域结合的上游和下游PCR引物也可包括在反应混合物中。当所述发荧光探针完整时，荧光剂和淬灭剂部分之间发生能量转移，淬灭荧光剂的发射。PCR延伸阶段中，探针被切割(例如通过核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5′核酸酶活性，或通过切割结合探针的单独提供的核酸酶活性)，从而使荧光剂和淬灭剂部分分离。这导致报告发射强度的增加，可用合适的检测器测量。有关检测PCR产物的荧光方法的其他细节参见例如Gelfand的美国专利5,210,015、Livak等的美国专利5,538,848、和Haaland的美国专利5,863,736，它们通过引用全文纳入本文，以及Heid，C.A.等，GenomeResearch，6：986-994(1996)；Gibson，U.E.M等，GenomeResearch6：995-1001(1996)；Holland，P.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA488：7276-7280，(1991)；和Livak，K.J.等，“PCR方法和应用”(PCRMethodsandApplications)357-362(1995)。

结构化探针(例如，“分子信标”)提供了另一种检测累积扩增产物的方法。通过分子信标，探针与扩增产物的互补区域杂交时探针构象的改变导致可检测信号的产生。除了靶标特异性部分以外，所述探针包括其他部分，通常一部分在5′端另一部分在3′端，它们彼此互补。一端部分通常接合报告染料，而另一端部分通常接合淬灭剂染料。溶液中两种端部分可彼此杂交以形成茎环结构。该构象中，报告染料和淬灭剂足够接近，以致报告染料的荧光被淬灭剂有效淬灭。相反，杂交探针产生线性化构象，其中降低了猝灭程度。因此，通过监控报告染料的发射变化可以间接监控扩增产物的形成。此类探针及其使用方法还参见例如Piatek，A.S.等，Nat.Biotechnol.16：359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F.R.，NatureBiotechnology14：303-308(1996)；和Tyagi，S.等，Nat.Biotechnol.16：49-53(1998)。

在一些实施方式中，能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各划分产物中是否存在目标分子。例如，在一些实施方式中，使用单色或双色读取器(荧光检测器)。阳性计数划分产物的分数可用于确定待检测DNA序列元件的绝对浓度或相对浓度。在一些情况中，阳性计数划分产物的分数能够确定DNA(例如，DNA或cDNA)序列元件与一个或多个其它DNA序列元件相互作用的相对或绝对频率。

一旦确定各样品划分产物的二态“是-否”结果，即可使用基于泊松统计的算法分析各划分产物的数据以定量样品中的目标分子含量。定量目标分子的浓度或含量的统计学方法描述于例如WO2010/036352，其通过引用全文纳入本文。

f.反交联

在一些实施方式中，交联的DNA、RNA或DNA/RNA片段(例如，经消化或剪切)发生反交联。例如，交联的片段可反交联以允许通过核酸探针杂交来进行逆转录、扩增、测序和/或检测。在一些情况中，在划分产物中进行反交联。在一些情况中，交联的核酸在检测前经消化或剪切，划分，然后反交联。在其它情况中，交联的核酸在检测前经划分、消化或剪切，然后反交联。在其它情况中，交联的核酸经划分和消化或剪切(例如，任意顺序)，然后检测而不进行反交联。

可在划分之后进行反交联。本文所用的反交联、去交联等是指处理交联的核酸片段或交联的核酸片段组以去除在交联期间加入的一种或多种，或基本全部，或全部DNA：DNA、DNA：RNA、RNA：蛋白质、DNA：蛋白质、或RNA：DNA：蛋白质交联。例如，交联的核酸可被划分，然后反交联。在一些情况中，经划分的交联的核酸经条码化(例如，通过连接或聚合)，然后反交联。在一些情况中，经划分的交联的核酸经反交联，然后条码化(例如，通过连接或聚合)。在一些情况中，经划分的交联的核酸经反交联，然后扩增。在一些情况中，经划分的交联的核酸在经过以下的一个或多个或其组合之后反交联：逆转录、扩增、测序、聚合、连接、条码化、探针杂交或划分产物合并。在一些情况中，经划分的交联的核酸在经过以下的一个或多个或其组合之前反交联：逆转录、扩增、测序、聚合、连接、条码化、探针杂交或划分产物合并。

按照需要进行反交联。在一些情况中，可通过将交联的核酸片段与蛋白酶接触来进行反交联。示例性的蛋白酶包括，但不限于，丝氨酸蛋白酶，如蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，弹性蛋白，枯草杆菌蛋白酶；苏氨酸蛋白酶；半胱氨酸蛋白酶，如胱冬酶，组织蛋白酶，木瓜蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶，如肾素，凝乳酶，组织蛋白酶D，胃蛋白酶；金属蛋白酶，如氨基肽酶，二肽酰肽酶，血管紧张素转换酶，羧基肽酶；和谷氨酸肽酶。一些情况中，蛋白酶是蛋白酶K。在一些情况中，交联的DNA片段与蛋白酶接触持续至少约5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、75、90、100、120或200分钟。

在一些情况中，通过加热交联的核酸片段来进行反交联。在一些情况中，通过将含有交联的核酸片段的划分产物加热至至少约55℃，至少约65℃，或至少约95℃持续至少约5、10、15、20、30、60、90、100、120、180、200、240、300、360、400、500、600、720、800、900、1000、1500、2000或4000秒或更长来反交联交联的核酸片段。在一些情况中，通过将交联的核酸片段与蛋白酶接触并在蛋白酶有活性的温度下孵育含交联的核酸片段的划分产物来反交联交联的核酸片段。例如，可用蛋白酶K接触划分产物并在约20℃至约65℃下持续至少约5、10、15、20、30、60、90、100、120、180、200、240、300、360、400、500、600、720、800、900、1000、1500、2000或4000秒或更长。在一些情况中，通过下述过程反交联所述交联的核酸片段：将交联的DNA片段与蛋白酶接触，在前述蛋白酶接触时间中的一个或多个下孵育，然后通过在前述加热时间或温度中的一个或多个下加热来灭活蛋白酶。另外，或替代地，可使用蛋白酶变性剂或抑制剂来控制蛋白酶活性。

在一些情况中，可使用高盐缓冲液来反交联核酸。在一些情况中，与加热和/或蛋白酶处理联合的高盐缓冲液可反交联核酸。示例性的高盐缓冲液包括，但不限于500mM至1MNaCl。可以任意组合同时或依次应用蛋白酶消化、加热和高盐缓冲液以得到反交联的核酸。

g.连接

在一些实施方式中，连接交联的核酸产物或其片段。例如，可连接交联的核酸产物或其片段以添加衔接子多核苷酸。在一些情况中，衔接子多核苷酸可用于进行检测(例如，扩增和/或测序)或条码化交联的核酸产物或其片段。在一些情况中，在划分产物中进行连接。在一些情况中，在划分前进行连接。在一些情况中，在合并划分产物后进行连接。在一些情况中，在逆转录后进行连接。在一些情况中，不进行连接。例如，可使用划分在下游的处理和/或检测期间在不需要连接的情况下保持交联的核酸产物、扩增子、逆转录子或其片段在物理上相邻。作为另一个示例，交联的核酸可经划分，然后条码化(例如，通过连接或聚合)，并且合并划分产物。然后可使用条码来在下游处理和/或检测期间保持核酸产物、逆转录子或其片段或扩增子的虚拟划分和/或虚拟交联。因此，检测划分产物中2个或更多个核酸序列元件的存在可包括检测虚拟划分产物中这类核酸元件或其片段或扩增子。在一些情况中，可在合并划分产物之前或之后，或在连接或条码化之前或之后反交联经划分的交联的核酸。

适用于本文所述的方法的连接方法是本领域已知的。在一些情况中，用连接酶进行连接，该连接酶对于将2个双链DNA分子连接到一起而言是特异性的。在一些情况中，连接需要或受到在DNA连接反应物上存在互补单链粘性末端的促进。在一些情况中，用一种或多种以下的连接酶进行连接：T4DNA连接酶、TfiDNA连接酶、DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA连接酶III、DNA连接酶IV或小足迹DNA连接酶。

在一些情况中，进行连接以在反交联之前物理上连接交联的DNA片段。在一些情况中，进行连接以整合含条码的衔接子寡核苷酸、测序引物结合位点、扩增引物结合位点和/或可检测标记物。在一些情况中，进行连接以制备5C或Hi-C文库。

在一些情况中，可磷酸化衔接子以促进连接。可用于磷酸化多核苷酸的激酶包括，但不限于T7多核苷酸激酶和T4多核苷酸激酶(PNK)。

在其它实施方式中，用例如大肠杆菌DNA聚合酶I进行的切口翻译代替衔接子的连接和磷酸化。在切口翻译中，通过来自衔接子的游离3′-OH基团或通过DNA酶I处理产生的“切口”在DNA内产生游离的3′-羟基。DNA聚合酶I然后催化核苷酸向切口的3′-羟基端的添加(标记或未标记的)。同时，这种酶的5′-到-3′外切核酸酶活性从切口的5′-磷酰基末端消除核苷酸单元。具有游离的3′-OH基团的新核苷酸在3′方向上整合到最初切除的核苷酸的位置上。

h.条码化

在一些实施方式中，经划分的交联的核酸片段或其扩增子或逆转录子经条码化。划分产物条码化使得即使在已经物理合并划分产物之后保持虚拟划分。因此，检测划分产物中2个或更多个核酸序列元件的存在可包括检测虚拟划分产物中这类核酸元件或其片段或扩增子。例如，检测到2个或更多个具有相同条码的核酸序列元件的存在可表示这2个或更多个核酸序列元件位于虚拟划分产物中，并因此在细胞或完整核中相近。

本文使用的“条码”是一种短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10、12、14或16个核苷酸)，其独特限定核酸分子、一组核酸分子(例如，一组来自特定划分产物的DNA分子)、或特定划分产物中生成的聚合产物、或一组产物。例如，经划分的杂交的核酸(例如，DNA)片段可与引物或一组引物杂交。各划分产物中的引物可含有不同的条码序列。然后可进行来自杂交引物的模板导向的聚合，由此将独特条码整合到各划分产物的聚合产物中。划分产物然后可合并，并任选扩增，而没有失去划分产物含有哪种交联的核酸片段或其聚合产物的踪迹。因此，可对包含各条码的聚合产物或交联的核酸片段的存在或缺失进行计数(例如，通过测序、杂交等)而不需要保持物理上的划分产物。

条码序列的长度决定能区分多少独特性样品。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于4⁴即256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标引不多于65,536个不同样品。此外，条码可接合双链分子的两条链，通过针对第一和第二链合成的条码化引物，或者通过连接。在2条链上使用2种不同的条码增加了可区分的独立事件的数量。替代地，相同条码可接合双链分子的两条链。使用相同条码可在两条链上产生相同的条码。双重条码化可提供对混杂下游分析的后续检测误差如测序或扩增误差的检测并且允许检测两条链中的任一条而不影响定量。本领域熟知条码技术的应用，参见例如KatsuyukiShiroguchi等，DigitalRNAsequencingminimizessequence-dependentbiasandamplificationnoisewithoptimizedsingle-moleculebarcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码降低序列依赖性偏置和扩增噪音)，PNAS(2012)和Smith，AM等，NucleicAcidsResearchCan11，(2010)。

在一些情况中，交联的核酸片段可经划分使得各片段含有约1个或更少的交联的核酸片段，反交联，条码化反交联的产物，并且然后合并划分产物(例如，打破乳液)。作为另一个示例，交联的核酸片段可经划分使得各划分产物含有约1个或更少的交联的核酸片段，条码化交联的核酸片段，反交联，并且然后合并划分产物(例如，打破乳液)。作为另一个示例，交联的核酸片段可经划分，条码化交联的核酸片段，合并划分产物(例如，打破乳液)，并且反交联条码化和交联的核酸片段。在一些情况中，条码化的片段允许后续检测步骤以鉴定同一划分产物中存在那些核酸序列元件。在一些情况中，交联的核酸片段划分到含条码的划分产物中(例如，条码连接到或整合到固体或凝胶支持物上)。在一些情况中，交联的核酸片段经划分，随后加入(例如，通过融合、注射、微流体或其它手段)条码(例如，条码连接到或整合到固体或凝胶支持物上)。

在一些实施方式中，用产生含单链粘性末端的片段的内切核酸酶消化交联的DNA产物。在一些情况中，片段可划分到划分产物中，使得划分产物含交联的DNA消化片段和与一个或多个双链条码衔接子寡核苷酸连接或接合的固体或凝胶支持物(例如，珠如琼脂糖珠)。在一些情况中，所述一个或多个双链条码衔接子寡核苷酸含有与由交联的DNA产物内切核酸酶消化生成的粘性末端相容的单链粘性末端。在一些情况中，一个或多个双链条码衔接子寡核苷酸含有用于例如PCR或测序的一个或多个引物位点。在一些情况中，这一个或多个双链条码衔接子寡核苷酸含有限制性位点，使得通过划分产物中的消化生成相容的粘性末端。在一些情况中，交联的DNA产物和双链条码衔接子寡核苷酸的消化产物都通过划分产物中的消化生成。含有相容粘性末端的双链条码衔接子寡核苷酸可连接到交联的DNA消化片段，形成条码化和交联的DNA消化片段。然后可合并划分产物并且条码化和交联的DNA消化片段经反交联，然后经过前述的检测步骤中的一个或多个。替代地，可在消化之前但在划分之后、双链条码衔接子寡核苷酸连接之前和/或合并划分产物之前进行反交联。在另一个替代中，交联的DNA产物没有经反交联。

在一个替代性实施方式中，交联的DNA经消化或剪切并划分到划分产物中，使得划分产物含有交联的DNA片段(例如，经消化或剪切)和连接到或接合含有随机引物序列的一个或多个条码化衔接子寡核苷酸的固体或凝胶支持物(例如，珠如琼脂糖珠)。示例性的随机引物序列包括，但不限于随机五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体等。替代地，条码化的衔接子寡核苷酸可含有非随机引物序列，如感兴趣的基因组区的序列。然后通过将条码化的衔接子寡核苷酸与交联的DNA片段杂交并进行DNA聚合，所述一个或多个含引物序列的条码化衔接子寡核苷酸可生成包含条码序列的聚合产物。然后可合并划分产物并且条码化和交联的DNA片段聚合产物经过前述的检测步骤中的一个或多个。在一些情况中，交联的DNA片段在条码化之前、在条码化之后但在合并划分产物之前、或在合并划分产物之后经反交联。在一些情况中，在通过将条码化的衔接子寡核苷酸与交联的DNA片段杂交并进行DNA聚合来生成含有条码序列的交联的DNA片段聚合产物期间进行反交联。在其它情况中，没有进行反交联。

在一些情况中，条码划分为整合或连接到固体或凝胶支持物的双链或单链寡核苷酸(例如，DNA、RNA或其组合)。用于制备和使用具有连接或整合的寡核苷酸的固体或凝胶支持物的方法和组合物包括例如美国临时专利申请号62/015,568中所述的那些。在一些情况中，在划分之后，寡核苷酸偶联到交联的DNA片段上(例如，通过连接和/或聚合)并且通过加热溶解固体或凝胶支持物。在一些情况中，在划分之后，通过加热溶解固体或凝胶支持物并且然后含条码的寡核苷酸偶联到交联的DNA片段上(例如，通过连接和/或聚合)。

如本文所述，条码，例如连接或整合到固体或凝胶支持物的条码可通过融合含有条码(和任选的固体或凝胶支持物)的划分产物和含有交联的DNA产物的划分产物来划分。替代地，条码，例如连接或整合到固体或凝胶支持物的条码可通过向含有交联的DNA产物的划分产物中注射条码(和任选的固体或凝胶支持物)来划分。在另一个替代中，可通过划分、融合、注射、微流体或其它手段向含条码的划分产物(例如，含连接或整合到固体或凝胶支持物的条码寡核苷酸的划分产物)中递送交联的DNA片段。

III.组合物

在一些实施方式中，提供了划分的交联的DNA片段的文库。在一些实施方式中，提供了划分的反交联的DNA片段的文库。划分的交联的或反交联的DNA片段可经条码化。在这类情况中，划分可以是虚拟划分，使得片段并不在物理上划分，但是条码提供了划分信息。在一些情况中，可使用前述文库中的一个或多个来检测一个或多个基因组区处的染色体或染色质构象。例如，可在前述文库中的一个或多个的划分产物中检测2个或更多个DNA序列元件(例如，分开超过约250bp的序列元件)以确定该DNA序列元件相邻的频率。在一些情况中，可使用该文库来同时或依次在多个基因组区中探测染色体或染色质构象。

可使用任意本文所述的方法制备经划分的交联的DNA片段或反交联的DNA片段文库。可储存这类文库用于未来的构象捕获分析和/或在制备后立即分析。在一些情况中，制备多重文库，其中从已经差别处理的细胞制备各文库。在一些情况中，可通过比较来自处理细胞的构象文库与对照构象文库来比较差别处理的细胞的染色体或染色质构象与对照(例如，未处理或差别处理的)细胞。替代地，可从不同细胞类型或来自不同组织的细胞中制备文库。在一些实施方式中，如可通过一个或多个基因组修饰来修饰细胞，并且从经修饰的细胞制备构象文库。

IV.试剂盒

提供了含有组合物和任选的进行本发明的方法的说明书的试剂盒。例如，试剂盒可含有引物和/或酶以及交联、消化或剪切、划分、反交联、或检测一个或多个DNA序列元件的说明。在一些情况中，该试剂盒可含有酶、缓冲剂、盐、核苷酸、形成划分混合物的试剂、和检测试剂中的一种或多种。

IV.实施例

仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。

实施例1

使用标准方案交联染色质并用限制性酶消化。然后将所得的交联的DNA片段稀释并划分到含ddPCR试验反应混合物的液滴中。交联的片段最终在相同的液滴中。在ddPCR期间在初始变性步骤中任选地反交联DNA。双阳性液滴(即，测试对于2种不同的DNA序列元件是阳性的液滴)表明DNA序列元件交联并且因此在细胞内的染色质状态中物理上相连。因此，该方法并不需要在反交联之前连接交联的DNA并且消除了由该连接步骤带来的假象。参见图1-4。

实施例2

使用标准方案交联染色质并用限制性酶消化。然后将所得的交联的DNA片段稀释并划分到含条码的液滴中。交联的片段最终在相同的液滴中。交联的DNA片段通过连接或聚合偶联到条码上。任选地反交联DNA。合并液滴，并且对条码化的DNA进行测序和/或扩增。具有相同条码的DNA序列元件被鉴定为在交联期间(例如，在细胞内的染色质状态中)物理上连接。参见图1-4。

实施例3

使用标准方案交联染色质并用限制性酶消化。然后将所得的交联的DNA片段稀释并划分到液滴中。交联的片段最终在相同的液滴中。任选地通过加热、注射蛋白酶或高盐缓冲液、或其组合来反交联交联的DNA片段。将条码化试剂注射到液滴中。条码通过连接或聚合偶联到DNA片段上。合并液滴，并且对条码化的DNA进行测序和/或扩增。具有相同条码的DNA序列元件被鉴定为在交联期间(例如，在细胞内的染色质状态中)物理上连接。参见图4，部分1-4和5b)-7b)。替代地，向液滴中注射ddPCR试剂并进行ddPCR。双阳性液滴(即，测试对于2种不同的DNA序列元件是阳性的液滴)表明DNA序列元件交联并且因此在细胞内的染色质状态中物理上连接。参见图4，部分1-4和5a)-6a)。

通过引用将本文引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。

Claims

1.一种检测在细胞或完整核中相近的染色体DNA序列元件的方法，所述方法包括：

a)交联所述细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成交联的DNA产物，其中在所述细胞中相近的染色体DNA序列元件交联；

b)得到所述交联的DNA产物；

c)用内切核酸酶消化交联的DNA产物以形成含有多个交联的DNA消化片段的混合物；

d)划分所述交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；并且

e)检测单个划分产物中就基因组一级序列而言彼此远离的2个或更多个DNA序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个DNA序列元件表明该2个或更多个DNA序列元件在所述细胞或完整核中彼此相近。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，划分所述交联的DNA消化片段，使得各划分产物中交联的DNA消化片段的平均数量为约1或更低。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在消化所述交联的DNA的步骤之后的反交联，从而在划分产物中从所述交联的DNA消化片段生成2个反交联的DNA消化片段。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测包括检测划分产物中反交联的DNA消化片段，其中在单个划分产物中检测到2个反交联的DNA消化片段表明该2个反交联的DNA消化片段曾交联，由此检测在所述细胞或完整核中相近的染色体DNA序列元件。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述反交联包括将所述划分产物加热至至少约55℃、至少约65℃、或至少约95℃。

6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述反交联包括用蛋白酶，如蛋白酶K孵育所述划分产物。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，全部、几乎全部或一部分的所述多个划分产物含有核酸条码。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述核酸条码连接固相支持物。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测包括DNA扩增。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增包括PCR。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA扩增包括靶向基因座扩增(TLA)。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测步骤包括核酸测序。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联所述完整核中的染色体DNA包括用交联剂孵育细胞。

14.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联所述完整核中的染色体DNA包括用交联剂孵育纯化的完整核。

15.一种检测在完整核群中相近的染色体DNA序列元件的方法，所述方法包括在多个完整核上进行前述权利要求中任一项所述的方法。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对2个或更多个DNA序列元件的交联频率进行定量，从而对所述2个或更多个DNA序列元件在所述完整核群中相近的频率进行定量。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述划分交联的DNA消化片段以产生多个划分产物包括产生至少1000、至少10000、至少20000、至少100000、或至少1000000个划分产物。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述划分产物在体积上小于约100nL、或小于约10nL、或小于约1nL。

19.一种包含划分产物的组合物，所述划分产物含有交联的DNA消化片段。

20.一种包含划分产物的组合物，所述划分产物含有反交联的DNA消化片段，其中所述反交联DNA消化片段是下述过程的产物：交联完整核中DNA、用核酸内切酶消化所述DNA、形成含有消化的和交联的DNA的划分产物并反交联。

21.如权利要求19或20所述的组合物，其特征在于，所述划分产物还包括DNA扩增试剂或核酸测序试剂。

22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述DNA扩增试剂或核酸测序试剂包含寡核苷酸引物或DNA聚合酶。

23.如权利要求19-22中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少1000、至少10000、至少20000或至少100000个划分产物。

24.如权利要求19-23中任一项所述的组合物，其特征在于，所述划分产物在体积上小于约100nL、或小于约10nL、或小于约1nL。

25.一种检测在细胞或完整核中相近的核酸序列元件的方法，所述方法包括：

a)交联所述细胞或完整核中的染色体DNA，从而形成含有DNA和RNA的交联的DNA产物，其中在所述细胞中相近的核酸序列元件交联；

b)得到所述交联的DNA产物；

d)划分所述交联的DNA消化片段以产生多个划分产物；并且

f)检测单个划分产物中就基因组的一级序列而言彼此远离的2个或更多个核酸序列元件的存在，其中在单个划分产物中检测到2个或更多个核酸序列元件表明该2个或更多个核酸序列元件在所述细胞或完整核中彼此相近。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括逆转录所述交联的DNA产物中的RNA。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，在所述检测期间进行所述逆转录。