CN105524950A - 利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，所述方法为：以腐败希瓦氏菌(Shewanella？putrefaciens)经扩大培养的菌悬液为催化剂，以肉桂醛为底物，以吐温-80为助剂，在pH值4.5-7.5、20-40℃、100-200rpm条件下进行催化加氢反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得肉桂醇；本发明所述的利用腐败希瓦氏菌催化由肉桂醛选择性加氢制备肉桂醇的方法与现有技术相比，具有反应条件温和，成本低廉，选择性好，转化率高等优点，肉桂醇的得率在80％以上。

Description

利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种肉桂醇的制备方法，特别涉及一种利用腐败希瓦氏菌作用将肉桂醛选择性加氢制备肉桂醇的方法。
(二)背景技术
肉桂醇是一种高附加值的精细有机产品，可以作为香料、药物、食品及其它化工产品生产的重要原料和中间体，应用广泛。例如，肉桂醇是合成抗癌药物紫杉醇和抗生素绿霉素必要成分，也是合成许多芳香性化学物的中间体。通常肉桂醇由肉桂醛合成。肉桂醛分子中存在C＝C、C＝O和苯环结构，由于C＝O的键能高于C＝C的键能，C＝C比C＝O更容易加氢，当二者与苯环共轭时，选择加氢C＝O则更难进行。
当前以肉桂醛加氢制备肉桂醇大致可分为三类，分别以氢负离子、H2和醇作为还原剂，利用化学催化方法制备肉桂醇。存在着还原剂和催化剂昂贵、较难保证高选择性加氢、制备繁琐、制备设备有特殊要求、操作条件苛刻、产物与还原剂、溶剂分离困难、产品后处理繁琐、产生大量废物等最多不利因素。
近年来，由于生物催化反应具有更好的选择性和环境友好性，已被用在越来越多的化合物合成中去。例如，利用阿魏酸微生物转化合成天然香兰素；利用微生物脂肪酶催化合成多种芳香酯等。目前利用腐败希瓦氏菌直接生物催化肉桂醛选择性加氢制成肉桂醇的研究国内外均未见报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种在腐败希瓦氏菌作用下，肉桂醛选择性加氢制备肉桂醇的方法，从而使肉桂醛简易快捷高效地选择性还原成肉桂醇。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，所述方法为：以腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)经扩大培养的菌悬液为催化剂，以肉桂醛为底物，以吐温-80为助剂，在pH值4.5-7.5、20-40℃、100-200rpm条件下进行催化加氢反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得肉桂醇。
进一步，所述腐败希瓦氏菌优选为腐败希瓦氏菌CICC22940，购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种编号：CICC22940，保藏日期2013年10月31日。
进一步，所述肉桂醛浓度为0.002-10g/L菌悬液(优选1-6g/L)，所述助剂浓度为5-20g/L(优选10g/L)。
进一步，所述菌悬液中腐败希瓦氏菌浓度为108-1013CFU/mL。
进一步，所述催化剂的制备方法为：将腐败希瓦氏菌接种至TSB培养基，在30℃下培养12小时，再以体积浓度0.1-0.5％的接种量(优选0.1％)转接到新鲜的TSB培养基中，30℃培养12h，随后以体积浓度0.1-0.5％的接种量(优选0.1％)接种到新鲜TSB培养基中，30℃培养5h至对数期，然后利用TSB培养基将培养液稀释制成腐败希瓦氏菌菌悬液；所述TSB培养基质量浓度组成为：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.3±0.2，溶剂为水。
进一步，本发明利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇过程中，所述吐温-80先与肉桂醛混合，在100Hz条件下超声混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再将肉桂醛乳化液加入腐败希瓦氏菌经扩大培养的菌悬液中进行加氢反应。
本发明所述分离纯化方法为：反应完全后将反应液离心，弃沉淀，上清液加入等体积二氯甲烷，摇床震摇2-3h进行萃取，离心，分出二氯甲烷层，旋转蒸发后得肉桂醇。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明所述的利用腐败希瓦氏菌催化由肉桂醛选择性加氢制备肉桂醇的方法与现有技术相比，具有反应条件温和，成本低廉，选择性好，转化率高等优点，肉桂醇的得率在80％以上。
(四)附图说明
图1为肉桂醛在腐败希瓦氏菌作用下定向转化为肉桂醇反应式。
图2为含207μg/mL肉桂醛的腐败希瓦氏菌反应液0min时的总离子流图(a，肉桂醛；b，肉桂醇)。
图3为含207μg/mL肉桂醛的腐败希瓦氏菌反应液180min时的总离子流图(a，肉桂醛；b，肉桂醇)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1.乳化肉桂醛加入量不同
将2g肉桂醛加入100mL吐温80溶液(10g/L)中，超声(100Hz，15min)乳化，制成乳化肉桂醛。
腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)CICC22940购自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种编号：CICC22940，保藏日期2013年10月31日。将腐败希瓦氏菌CICC22940接种至胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，在30℃下培养12小时，再转接体积浓度0.1％到新鲜的TSB培养基中30℃培养12h，随后接种体积浓度0.1％到新鲜TSB培养基中，30℃培养5h至对数期，然后利用TSB培养基将培养液稀释，获得菌体浓度为108CFU/mL的腐败希瓦氏菌菌悬液100mL，pH值为7。
按表1所需浓度，加入不同体积的乳化肉桂醛于腐败希瓦氏菌菌悬液中，混匀，25℃于摇床中，以180rpm速度振荡培养反应6h后，离心分离，用GC-MS进行定性分析，条件如下：色谱柱：TG-5，30m×0.25mm×0.25μm；载气：氮气，流速：1mL/min；程序升温：初始温度100℃，以20℃/min的速率升温至130℃，再以5℃/min的速率升温至170℃，再以50℃/min的速率升温至230℃；进样口温度；230℃；进样量：1μl。质谱条件：电离方式：EI；传输线温度:230℃；电离能量：70eV；扫描质量范围：40-500m/z；溶剂延迟：3min。用HPLC进行定量分析，条件如下：流动相：乙腈-水(0-10min内由35：65线性变化到38：62，在10-15min内由38：62线性变化到50：50)；流速：1mL/min；检测波长：肉桂醛：290nm，肉桂醇：250nm；柱温：30℃；进样量：10μl。
反应时间6h，不同加入量肉桂醛下肉桂醛的转化率和得率见表1。
表1不同肉桂醛加入量下肉桂醛的转化率和得率
实施例2.腐败希瓦氏菌催化反应时间不同
将2g肉桂醛加入100mL吐温80溶液(10g/L)中，超声(100Hz，15min)乳化，制成肉桂醛乳化液。
向pH值为6.8、108CFU/mL腐败希瓦氏菌菌悬液100mL(制备方法同实施例1)中加入1mL肉桂醛乳化液，混匀，30℃于摇床中以180rpm速度振荡培养反应5min-6h(见表2)，离心，去除腐败希瓦氏菌沉淀，用GC-MS进行定性分析，测定分析上清夜。GC-MS条件、质谱条件同实施例1。用HPLC进行定量分析，条件同实施例1。表2给出了不同反应时间下肉桂醛的转化率和得率。
表2不同反应时间下肉桂醛的转化率和得率
备注：肉桂醛加入量为2g/L。
实施例3.腐败希瓦氏菌加入量不同
将2g肉桂醛加入100mL吐温80溶液(10g/L)中，超声(100Hz，15min)乳化，制成肉桂醛乳化液。
分别向pH值为5.5、不同浓度(表3)腐败希瓦氏菌菌悬液100mL(制备方法同实施例1)中培养液中加入1mL肉桂醛乳化液，混匀，37℃于摇床中以180rpm速度振荡培养反应6h后，离心，去除腐败希瓦氏菌沉淀，用GC-MS进行定性分析，测定分析上清夜。GC-MS、质谱条件同实施例1，用HPLC进行定量分析，条件同实施例1。表3给出了不同腐败希瓦氏菌浓度下肉桂醛的转化率和得率。
表3不同反应时间下肉桂醛的转化率和得率
备注：肉桂醛加入量为2g/L，反应时间6h。

Claims (7)

1.一种利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述方法为：以腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)经扩大培养的菌悬液为催化剂，以肉桂醛为底物，以吐温-80为助剂，在pH值4.5-7.5、20-40℃、100-200rpm条件下进行催化加氢反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得肉桂醇。
2.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述腐败希瓦氏菌为腐败希瓦氏菌CICC22940。
3.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述肉桂醛浓度为0.002-10g/L菌悬液，所述助剂浓度为5-20g/L菌悬液。
4.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述菌悬液中腐败希瓦氏菌浓度为108-1013CFU/mL。
5.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述催化剂的制备方法为：将腐败希瓦氏菌接种至TSB培养基，在30℃下培养12小时，再以体积浓度0.1-0.5％的接种量转接到新鲜的TSB培养基中，30℃培养12h，随后以体积浓度0.1-0.5％的接种量接种到新鲜TSB培养基中，30℃培养5h至对数期，然后利用TSB培养基将培养液稀释成腐败希瓦氏菌菌悬液；所述TSB培养基质量浓度组成为：胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.3±0.2，溶剂为水。
6.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述吐温-80先与肉桂醛混合，在100Hz条件下超声混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再将肉桂醛乳化液加入腐败希瓦氏菌经扩大培养的菌悬液中进行加氢反应。
7.如权利要求1所述利用腐败希瓦氏菌选择性加氢制备肉桂醇的方法，其特征在于所述分离纯化方法为：反应完全后将反应液离心，弃沉淀，上清液加入等体积二氯甲烷，摇床震摇2-3h进行萃取，离心，分出二氯甲烷层，旋转蒸发后得肉桂醇。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102344915A (zh) * 2011-09-16 2012-02-08 中国科学院研究生院 具有肉桂醇脱氢酶活性的蛋白及其编码基因与应用

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