CN105524848A - 一株产抗病毒活性物质的真菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株代谢产物对病毒具有抑制作用的真菌菌株及其应用，该菌株为链格孢（<i>Altemaria？altemata</i>）FJA14，已于2015年06月05日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC？No.？10902。菌株FJA14可用于制备病毒病防治制剂。本发明的菌株FJA14来源于植物内生菌，制备的活性化学成分具有抗病毒活性高、对环境无污染等特点，因此，从FJA14发酵液中分离提取抗病毒活性物质，并将其研制成天然抗病毒剂，具有广阔的应用前景。

Description

一株产抗病毒活性物质的真菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株代谢产物具有抗植物病毒活性的真菌菌株及其应用。
背景技术
植物病毒病具有危害大、防治难的特点，烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）是正单链植物病毒的模式病毒，是植物病毒抑制物筛选最常用的靶标。目前，生产上对植物病毒病防治效果好的药物还很少，因此，以TMV为靶标，从自然界中筛选出天然抗病毒活性物质，进而研制出安全、高效的新型抗病毒剂具有广阔的应用前景。细交链孢菌酮酸（tenuazonicacid）是链格孢菌产生的一种小分子活性物质，研究表明细交链孢菌酮酸具有抗肿瘤、抗细菌和抗人体病毒等多种生物活性，其在低浓度时，还具有诱导植物对蚜虫的抵抗作用。本发明采用组织块分离法，从臭椿的叶片中分离到1株发酵产物对TMV具有较好抑制效果的内生真菌菌株FJA14，该菌株经形态学和分子生物学鉴定为链格孢菌，通过对该菌的大量发酵培养，我们从发酵液中分离到对TMV具有抑制作用的活性物质细交链孢菌酮酸。发酵工程可为具有潜在价值的微生物创造良好的生长、繁殖条件，并能进行大规模的培养，其在生物制药领域显现出了巨大的潜力，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。综上所述，筛选可产抗病毒活性代谢物质的真菌，通过发酵工程大量生产抗病毒活性物质，是新型、安全、高效抗病毒剂研制最经济有效的途径，具有很好的潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一株代谢产物具有抗植物病毒活性的真菌菌株及其应用，通过从菌株发酵液中提取分离抗病毒活性物质，并将其研制成天然源抗植物病毒剂，具有很好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了一株具有抗植物病毒活性的菌株，该菌株为链格孢（Altemariaaltemata）FJA14，已于2015年06月05日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.10902，地址为北京朝阳区北辰西路1号院。
其次，本发明还保护了所述的具有抗植物病毒活性的菌株在制备病毒病防治制剂中的应用。
更详细地，所述的病毒病是由烟草花叶病毒引起的植物病毒病。将所述菌株培养发酵后，获取发酵液提取物，从中进一步分离提取到抗病毒活性物质，用于制备植物病毒病的防治制剂。
所述抗病毒活性物质的制备方法，具体步骤如下：
（1）将链格孢（Altemariaaltemata）FJA14纯菌种接种于PDA平板培养基上，28℃培养5～7d；
（2）用直径4mm的无菌打孔器于培养的菌落边缘打取菌饼，取4～6片菌饼置于装有100mLPDB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、130～150r/min摇床振荡培养4～5d作为种子液；（3）将种子液按5%～10%的接种量接入装有PDB培养基的三角瓶中，28℃、110～130r/min摇床振荡培养15～25d，得到发酵液。
（4）将发酵液过滤后的滤液经D101大孔树脂柱层析吸附，先用3～4个柱体积的水洗脱，再用2～4个柱体积的甲醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至膏状，得膏状物。
（5）膏状物用质量体积比为1：10～15的蒸馏水充分悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取4～5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩去除溶剂即为FJA14发酵液提取物。
（6）发酵液提取物用少量甲醇充分溶解，溶解后的溶液经SephadexLH-20柱层析分离，以甲醇为洗脱剂，对分离得到的各组分进行薄层层析分析和抗病毒活性跟踪指导，取抗病毒活性最好的组分以氯仿-甲醇（8:2）为洗脱剂进行硅胶柱层析分离，对分离得到的各组分进行薄层层析分析和抗病毒活性跟踪指导，可分离出抗病毒活性物质。
本发明中制备的抗病毒活性物质细交链孢菌酮酸可用于防治由TMV引起的植物病毒病，试验结果表明细交链孢菌酮酸对TMV有很好的抑制效果。该活性物质与目前生产上使用的多数植物病毒抑制剂的有效化学成分相比有很大的优点：
抗病毒效果好；
与环境友好。细交链孢菌酮酸是植物内生真菌链格孢菌的代谢产物，来源于自然界，与自然环境相容性好，在自然界中易降解，不污染环境。
细交链孢菌酮酸可通过微生物发酵工程大量生产，生产和制备工艺简单，便于推广应用。
具体实施方式
为了更好了解本发明，以下通过实施例作进一步说明，但其绝不对本发明的范围构成限制。
实施例1一种分离臭椿内生链格孢菌FJA14的方法
（1）将新鲜的臭椿叶切成0.5cm×0.5cm的小方块，无菌水洗净，用75％乙醇处理2min，5.6%的次氯酸钠溶液处理0.5min，无菌水充分冲洗。将小方块接种于固体PDA培养基上，22℃下培养7d；（2）挑取尖端菌丝，于PDA培养基平板上划线纯化分离，置于22℃培养7d；（3）将纯化的菌株转接到PDA固体培养基上28℃培养5d，菌落用打孔器打成直径4mm的菌饼，挑起3个菌饼接种于PDB液体培养基中，于摇床上25℃，120rpm振荡培养8d后，发酵液过滤后的滤液经减压浓缩制得发酵液提取物。分别采用半叶枯斑法和叶圆盘法对发酵液提取物的抗病毒活性进行测定，从中选择具有抗病毒活性的菌株，鉴定并保存活性菌株。
链格孢FJA14具有如下生物学特征：
1.菌落形态特征：在PDA培养基平板上生长良好，菌落呈灰白色至暗青褐色，边缘整齐，正面和背面均有同心轮纹。
2.菌体形态特征：气生菌丝初期为淡色，后逐渐变为青褐色。分生孢子梗单生或簇生，直立或略弯曲，淡褐色，分隔，常分枝。分生孢子呈倒梨形、倒棍棒形、卵形或近椭圆形，单生或链生，深褐色，具有3-8个横膈膜，1-4个纵、斜膈膜。
3.遗传学特征：该链格孢菌FJA14的ITS序列(570bp)已提交到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Genbank基因序列数据库，登录号为KP196360。FJA14的ITS序列分析表明，其与GenBank中Alternariaalternata（登录号为AF404661.1）同源性达100%。因此，将FJA14鉴定为链格孢菌。
实施例2：一种从链格孢菌FJA14中制备抗病毒物质细交链孢菌酮酸的方法
将链格孢FJA14纯菌种接种于PDA平板培养基上，28℃培养5d；（2）用直径4mm的无菌打孔器于培养的菌落边缘打取菌饼，取4片菌饼置于装有100mLPDB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、140r/min摇床振荡培养4d作为种子液；（3）将种子液按8%的接种量接入装有PDB培养基的三角瓶中，28℃、120r/min摇床振荡培养21d，得到发酵液。（4）将发酵液过滤后的滤液30L经D101大孔树脂柱层析吸附，先用4个柱体积的水洗脱，再用3个柱体积的甲醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至膏状，得膏状物19g。（5）膏状物用质量体积比为1：12的蒸馏水充分悬浮，悬浮液用乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩去除溶剂，得FJA14发酵液提取物7.1g。（6）发酵液提取物用少量甲醇充分溶解，溶解后的溶液经SephadexLH-20柱层析分离，以甲醇为洗脱剂，分部收集洗出液，洗出液经薄层层析分析后合并相同洗出液，共得到7个合并组分，抗病毒活性（以烟草花叶病毒为靶标，采用叶圆盘法对得到的组分进行抗病毒活性测定）测定结果表明第3个合并组分抗病毒活性最好，将该组分减压浓缩去除溶剂后所得的干物质（210mg）用少量甲醇充分溶解，溶解后的溶液经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇（8:2）为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗出液，对分离得到的各组分进行薄层层析分析，合并相同洗出液得到4个合并组分，其中组分2挥干溶剂后可得97mg的淡黄色粉末，抗病毒活性测定结果表明该物质抗病毒活性最好，HPLC测定结果显示其纯度为98.0%，该物质为细交链孢菌酮酸，其分子量为197，分子式为C10H15NO3，是链格孢菌FJA14发酵液中抗TMV的有效活性成分，结构式如下：
。
实施例3：叶圆盘法测定细交链孢菌酮酸对TMV的抑制活性
（1）试验方法健康的普通烟草K326接种TMV6h后，用打孔器从接种叶上打取直径约为15mm的叶圆盘，分别飘浮于用少量DMSO（终浓度为3%）配制成一定浓度的细交链孢菌酮酸水溶液中，以飘浮于含3%DMSO的蒸馏水中接种TMV的叶圆盘为阳性对照，飘浮于含3%DMSO的蒸馏水中不接种TMV的健康烟草叶圆盘为阴性对照，并设漂浮于200μg/mL的宁南霉素中接种TMV的叶圆盘为标准药剂对照，每处理3个叶圆盘，处理48h后将叶圆盘称重，用1:20(W/V)的碳酸盐缓冲液包被研磨，采用间接ELISA法测定各测定孔的OD405值。将处理和阳性对照的OD405值分别减去阴性对照的OD405值，然后根据病毒浓度标准曲线求出各处理和对照的病毒浓度，并计算抑制率。
抑制率（%）=[(对照病毒浓度-处理病毒浓度)/对照病毒浓度]×100%
（2）试验结果采用叶圆盘法测定细交链孢菌酮酸对TMV的抑制活性结果（表1）表明，细交链孢菌酮酸对TMV的增殖有显著的抑制作用，抑制效果随细交链孢菌酮酸浓度的增加而逐渐升高，当细交链孢菌酮酸浓度为150μg/mL时，其对TMV的抑制率可达91.2%，抑制效果明显高于对照药物宁南霉素。
表1叶圆盘法测定细交链孢菌酮酸对TMV增殖的抑制作用
实施例4：半叶枯斑法测定细交链孢菌酮酸对TMV的抑制活性
（1）试验方法选取健康、长势一致的6～8叶期的心叶烟，在待接种叶片上均匀撒上少量500目石英砂，左半叶接种细交链孢菌酮酸与TMV的混和液（TMV终浓度为10μg/mL），右半叶接种用蒸馏水配制的TMV溶液（TMV终浓度为10μg/mL）作对照，叶片接种病毒后用蒸馏水冲洗。每处理接种4个叶片，重复3次，3d后统计枯斑数，按照以下公式计算抑制率。
抑制率（%）=[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100%
（2）试验结果采用半叶枯斑法对细交链孢菌酮酸的抑制TMV活性测定结果（表2）表明，细交链孢菌酮酸对TMV有显著的抑制作用，抑制效果随细交链孢菌酮酸浓度的增加而逐渐升高，当活性物质浓度为100μg/mL时，其对TMV的抑制率可达91.8%。
表2半叶枯斑法测定细交链孢菌酮酸对TMV的抑制作用
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一株产抗病毒活性物质的真菌菌株，其特征在于：所述菌株为链格孢（Altemariaaltemata）FJA14，已于2015年06月05日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.10902。
2.如权利要求1所述的一株产抗病毒活性物质的真菌菌株在制备病毒病防治制剂中的应用。
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