CN105520967B - 冬虫夏草提取液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冬虫夏草提取液及其制备方法，所述方法包括：提供冬虫夏草原料；以冬虫夏草原料的重量16‑24倍的水浸泡冬虫夏草，在38‑42℃温浸8–12小时；过滤浸泡液，得到冬虫夏草提取液；任选地，将所述冬虫夏草提取液于118‑122℃高温消毒10–20分钟；其中所述冬虫夏草是完整的冬虫夏草、断裂的或只有子实体或虫体部分的冬虫夏草、或者呈粉末状的冬虫夏草。按照该方法所制得的冬虫夏草提取液，含有冬虫夏草中的美容活性成分(如肌苷)，可加工为各种美白产品，如药品、保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品。

Description

冬虫夏草提取液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草提取液及其制备方法和应用。更具体而言，本发明涉及一种具有美白效果的冬虫夏草提取液及其制备方法和应用。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps)是麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。冬虫夏草的生长环境独特，分布区域有限，仅产于我国西藏、青海、四川西部及甘肃南部地区海拔3000米以上的高原地带，生长周期2至3年，目前尚没有实现人工栽培。由于有限的野生资源与巨大的市场需求，冬虫夏草成为我国目前价格最为昂贵的名贵滋补中药。

冬虫夏草的药用功效始载于《本草从新》，其具有补肺益肾、止血化痰的功效，用于治疗肺虚咳嗽、咯血盗汗等症，是我国防病治病的名贵中药之一。由于在《黄帝内经》内有记载“肺主皮毛、司呼吸”，冬虫夏草或可通过改善肺的功能从而改善皮肤质素。然而从现代科学的角度来看，我们并未找到任何能证明冬虫夏草有美白功效的证据。根据《中国药典》，核苷中的腺苷是一个用来鉴定冬虫夏草质量的指标。但天然冬虫夏草的腺苷及其衍生物虫草素的含量极低，反之北虫草(Cordyceps militaris(L.)Link.)则含有较多的腺苷及大量的虫草素。虽然虫草素已被证实有美白作用，但是冬虫夏草的虫草素含量极微。

酪氨酸酶活性抑制作用的测试是用来筛选美白药品的传统测试方法，其中酪氨酸会因为酪氨酸酶的作用而转化成左旋多巴(L-DOPA)，进而转化成为多巴色素(Dopachrome)。多巴色素在492nm波长下有吸光度，故可以量化及计算酪氨酸酶的活性。多巴色素只是暂存物，它会转化成黑色素(Melanin)。人类皮肤上的黑色素是由黑色素细胞(Melanocyte)所产生的多巴色素转化而成的。黑色素会渐渐地在黑色素细胞内的黑色素体(Melanosome)内成熟，成熟后黑色素体便会沿着黑色素细胞的树突(Dentrite)转移到角质细胞(Keratinocyte)，使肤色变深。抑制酪氨酸酶活性能有效减少多巴色素及黑色素的产生，从而使肤色变得更淡更白。

目前，大部分的美白产品如对苯二酚(Hydroquinone)及熊果苷(Arbutin)等均为针对酪氨酸酶活性而达到美白功效。虽然对苯二酚的美白功效明显，却于2006年因为致癌的风险而被禁用。随后，熊果苷亦因为化学结构与对苯二酚相似而被禁用。科学界正找寻安全性较高的美白用品来替换对苯二酚等药品。

目前，市场上还没有冬虫夏草或冬虫夏草提取物所制成的美容产品。其次，冬虫夏草具有特殊的香菇味。因此，若以其提取液作为美白产品原料，则需要考虑从中去除这股特殊的香菇味，否则会引起部分美白产品使用者的反感。但是，一般的冬虫夏草提取方法均未能除掉这股特殊的香菇味。简而言之，冬虫夏草具有特殊香菇味是制备冬虫夏草提取液以用作美白产品原材料的一个局限性。

此外，由于冬虫夏草提取液含有大量多糖和核苷、营养丰富，被微生物污染的风险较高，因此，为了长期储存，冬虫夏草提取液在被提取出来后进行消毒是期望的。但是，尚不清楚在消毒的过程中是否会破坏冬虫夏草中的活性成分例如美白活性成分。

发明内容

本发明旨在解决上述问题中的一个或多个。

在第一方面中，本发明提供了一种制备包含肌苷的冬虫夏草提取液的方法，包括以下步骤：

1)提供冬虫夏草原料；

2)以所述冬虫夏草原料的重量16-24倍的水浸泡所述冬虫夏草原料，在38-42℃温浸8–12小时，得到浸泡液；和

3)过滤所述浸泡液，得到冬虫夏草提取液。

在一个实施方案中，本发明的方法还可包括步骤4)：对所述冬虫夏草提取液进行消毒。例如，所述消毒可以是于118-122℃的温度进行10–20分钟的高温消毒。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以以冬虫夏草原料的重量20倍的水浸泡所述冬虫夏草原料。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以在40℃浸泡所述冬虫夏草原料。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以浸泡所述冬虫夏草原料10小时。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤3)中，可以以滤膜过滤所述浸泡液，以除去残渣。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤4)中，可以将所述冬虫夏草提取液于120℃高温消毒15分钟。

在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的冬虫夏草原料是天然的冬虫夏草。

在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的冬虫夏草原料是完整的冬虫夏草、断裂的或只有子实体或虫体部分的冬虫夏草、或者呈粉末状的冬虫夏草。

在第二方面，本发明提供了一种根据本发明的第一方面获得的包含肌苷的冬虫夏草提取液。

在第三方面，本发明提供了一种美白产品，其包含美白有效量的本发明的包含肌苷的冬虫夏草提取液或包含美白有效量的肌苷。在一个实施方案中，本发明的美白产品是药品、保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品的形式。

在第四方面，本发明提供了本发明的包含肌苷的冬虫夏草提取液或肌苷在制备美白产品中的用途。在一个实施方案中，本发明的美白产品是药品、保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品的形式。

在第五方面，本发明提供了一种鉴定冬虫夏草质量的方法，包括以下步骤：

1)提供冬虫夏草原料；

2)以所述冬虫夏草原料的重量16-24倍的水浸泡所述冬虫夏草原料，在38-42℃温浸8–12小时，得到浸泡液；

3)任选地，过滤所述浸泡液，得到冬虫夏草提取液；和

4)测定所述浸泡液或所述提取液中肌苷的含量。

在一个实施方案中，冬虫夏草质量包括冬虫夏草的美白功效。

附图说明

以下将结合附图，对本发明进行进一步的详细说明。本领域技术人员将理解，附图以及下文详细描述旨在仅为示例性的，不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。

图1为实施例1中五种核酸(尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、虫草素)对照的液相指纹图谱。

图2为实施例1中提取自完整的冬虫夏草的液相指纹图谱。

图3为实施例1中提取自冬虫夏草子实体的液相指纹图谱。

图4为实施例1中提取自冬虫夏草虫体部分的液相指纹图谱。

图5为实施例1中提取自冬虫夏草粉未的液相指纹图谱。

图6为实施例2中多巴色素在492nm下的吸光度的标准曲线。

图7为实施例2中提取自不同种类冬虫夏草的提取液对酪氨酸酶活性的抑制作用的结果。

图8为实施例2中不同种类核苷对酪氨酸酶活性的抑制作用的结果。

图9为实施例2中不同肌苷浓度对酪氨酸酶活性的抑制作用的结果。

图10为实施例3中高温消毒前后的冬虫夏草提取液对酪氨酸酶活性的抑制作用的影响。

具体实施方式

除非本文中另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等价的那些方法和材料也可用于本发明的实践中，但是优选的方法和材料还是在本文中加以描述。此外，如本文所使用，数值范围包括定义该范围的数字。本发明的小标题仅仅为了阐述的目的，而不旨在限制本发明的范围。

如本文所使用，除非上下文明确指出，所有百分比都按重量计算。

本申请的发明人首次发现，通过在一定条件下提取冬虫夏草，所得的冬虫夏草提取液含有美白活性成分肌苷，从而可用于美白用途。另外，通过本发明方法提取冬虫夏草，可以去除冬虫夏草的特殊香菇味。此外，可以对通过本发明的方法得到的冬虫夏草提取液进行消毒，例如高温消毒，从而可长期储存。

因此，本发明的第一方面提供了一种制备包含肌苷的冬虫夏草提取液的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供冬虫夏草原料；

2)以所述冬虫夏草原料的重量约16-24倍的水浸泡所述冬虫夏草原料，在约38-42℃温浸约8–12小时，得到浸泡液；和

3)过滤所述浸泡液，得到冬虫夏草提取液。

在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括步骤4)：对所述冬虫夏草提取液进行消毒，例如，于约118-122℃的温度进行高温消毒约10–20分钟。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以以冬虫夏草原料的重量约20倍的水浸泡所述冬虫夏草原料。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以在约40℃浸泡所述冬虫夏草原料。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤2)中，可以浸泡所述冬虫夏草原料约10小时。

通过本发明方法中所限定的上述条件，尤其是浸泡时间和温度条件，能有效地从冬虫夏草中释放出美白成分(如核苷)，而带有特殊香菇味的成分(如挥发油)则保留在药材残渣中。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤3)中，可以以滤膜过滤所述浸泡液，以除去残渣。然而，任何能使药材残渣与提取液完全分离的方法皆可用于本发明。

在一个实施方案中，在本发明的方法步骤4)中，可以将所述冬虫夏草提取液于约120℃高温消毒约15分钟。

在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的冬虫夏草原料是天然的冬虫夏草。

在一个实施方案中，可用于本发明的方法中的冬虫夏草原料是完整的冬虫夏草、断裂的或只有子实体或虫体部分的冬虫夏草、或者呈粉末状的冬虫夏草。

本发明的方法简单、易操作，并且所得提取液含有作为美白成分的肌苷，因而可以用作生产美白产品的原料。与一般同类方法相比，所述方法能除掉冬虫夏草特殊的香菇味，大大提升了产品的市场价值。可以对通过本发明的方法所获得的提取液进行高温消毒，从而可将所述提取液储存较长时间，这增加了工艺流程的灵活度，降低了后期添加大量稳定剂的成本及风险；在不影响冬虫夏草中美白活性成分及美白功效的同时，又能增加安全性。

在本发明的第二方面，提供了一种通过本发明第一方面的方法制备的包含肌苷的冬虫夏草提取液。

除了肌苷外，所述冬虫夏草提取液还可以包含其他核苷，如尿苷、鸟苷、腺苷等。

该冬虫夏草提取液包含肌苷，因而具有美白功效。另外，该冬虫夏草提取液不具有冬虫夏草特殊的香菇味，大大提升了产品的市场价值。可以对该冬虫夏草提取液进行高温消毒，从而可将该提取液存储较长时间，因此增加了工艺流程的灵活度，降低了后期添加大量稳定剂的成本及风险。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种美白产品，其包含美白有效量的本发明的包含肌苷的冬虫夏草提取液或包含美白有效量的肌苷。在一个实施方案中，本发明的美白产品可以是药品、保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品的形式。

肌苷是核苷的一种，它能被转化为其它组成DNA(如腺苷)的核苷。在人类细胞中也可以找到。另外，就化学品角度而言，肌苷也并未被列入危险品的类别。再者，整个提取工艺以水提及温浸为主，未涉及有机溶剂或催化剂。因此，包含冬虫夏草提取液或者肌苷自身的美白产品不存在安全性的问题。

在本发明的第四方面，本发明提供了本发明的包含肌苷的冬虫夏草提取液或肌苷在制备美白产品中的用途。在一个实施方案中，本发明的美白产品是药品、保健品、食品、饮料、食品添加剂、营养强化剂或美容用品的形式。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种鉴定冬虫夏草质量的方法，包括以下步骤：

1)提供冬虫夏草原料；

2)以所述冬虫夏草原料的重量16-24倍的水浸泡所述冬虫夏草原料，在38-42℃温浸8–12小时，得到浸泡液；

3)任选地，过滤所述浸泡液，得到冬虫夏草提取液；和

4)测定所述浸泡液或所述提取液中肌苷的含量。

在一个实施方案中，冬虫夏草质量包括冬虫夏草的美白功效。

按照《中国药典》，冬虫夏草是根据腺苷含量来确定其质量的。但是，根据发明人十多年来对冬虫夏草的研究发现，天然冬虫夏草中的腺苷含量并不高，这一点从图2可以得到证实。另外，从图8的结果可以看出，腺苷的美白效力远不如肌苷。由此可见，冬虫夏草中的肌苷含量和冬虫夏草的美白功效可以反映冬虫夏草的质量。

本发明所述的冬虫夏草提取液及其制备方法和应用具有以下的一个或者多个优点和有益效果：

(1)本发明能除掉冬虫夏草特殊的香菇味，大大提升了产品的市场价值。

(2)所得提取液亦可进行高温消毒，从而可以保存较长时间，这增加了工艺流程的灵活度，降低了后期添加大量稳定剂的成本及风险；另外，在不影响冬虫夏草中美白活性成分及美白功效的同时，又能增加安全性。

(3)按照该方法所制得的冬虫夏草提取液，含有美白活性成分如肌苷，因此可以用于制备美白产品，从而实现其美白功效。

(4)本发明可以以多种冬虫夏草(例如完整的冬虫夏草、断裂的或者只有子实体或虫体部分的冬虫夏草、或者呈粉末状的冬虫夏草)为原料来制备冬虫夏草提取液，并且所得的冬虫夏草提取液亦可加工为多种美白产品，使冬虫夏草这种珍贵稀少、价格昂贵的天然补品能以相对较低的原料成本和产品价格，广泛地用于药品、保健品、食品和美容产品，具有巨大的市场潜力。

实施例

下面通过实施例进一步说明本发明。然而，本发明的范围不局限于这些实施例。除非特别说明，所有试剂和设备均可商购获得。

实施例1冬虫夏草提取液的制备和各核苷含量检测

本实施例所述的冬虫夏草提取液的制备方法，包括以下步骤：

a)色谱条件

Grace Prevail Select C18色谱柱(4.6x 150mm,5μm)；流动相为水：甲醇梯度洗脱：0-3min(98:2)，3-10min(98:2-90:10)，10-22min(90:10-78:22)，22-30min(78:22)；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；检测波长为260nm；理论塔板数按虫草素计不得少于7000。

b)对照品的制备

精密称取尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、虫草素对照品，用蒸馏水溶解并定容至容量瓶里，配制的对照品储备液浓度依次为975μg/mL、968μg/mL、637.5μg/mL、928μg/mL和1212μg/mL，备用(见图1)。

c)标准曲线(表1)

表1

标准品	标准方程式	相关系数(R<sup>2</sup>)
			尿苷	y＝21.87X+4.5	1
肌苷	y＝16.37X+6.6	0.9999
			鸟苷	y＝18.20X+10.37	1
腺苷	y＝30.02X-1.512	1
			虫草素	y＝28.95X+14.46	0.9996

d)样品制备方法

称取完整天然冬虫夏草(采自青海玉树)5g，分别加入16、20和24倍重量的水，并分别在38、40和42℃温浸8、10和12小时。使用滤膜(120mm，2号)过滤浸泡液。经上述处理所获得的各提取液均不具有冬虫夏草所具有的特殊香菇味。将加入20倍重量的水、在40℃温浸10小时所获得的滤液，利用冷冻干燥器把提取液冻干成粉末后，再重新加水定容至0.05g生药/ml，按照下述方法测定其核苷含量，每个样品重复三次，取平均值。图2示出了该冬虫夏草提取液的核苷含量。分别采用16和24倍重量的水、在38℃和42℃温浸8和12小时、利用冷冻干燥器把提取液冻干成粉末后，再重新加水定容至0.05g生药/ml，获得了跟图2类似的结果。

e)高压液相层析测定

(1)按照上文所述色谱条件设定高压液相层析的条件，设定检测程序。

(2)用流动相平衡高压液相层析系统之基线为零。

(3)进样不同浓度各对照品建立标准曲线，进样量为10μL。

(4)进样各样品，并按照标准曲线计算各样品含量。

将完整天然冬虫夏草换成断裂的或只有子实体或虫体部分的天然冬虫夏草(西藏)、或呈粉末状的天然冬虫夏草(西藏)，采用20倍重量的水、在40℃温浸10小时的提取方法，所获得的提取液同样不具有冬虫夏草所具有的特殊香菇味。按照上述方法测定各提取液中各核苷(包括肌苷)的浓度水平。结果是，与完整天然冬虫夏草(见图2)相比，在断裂的或只有子实体(见图3)或虫体部分(见图4)的天然冬虫夏草、或呈粉末状的天然冬虫夏草(见图5)中，尿苷、鸟苷、腺苷含量差异较大，而肌苷含量则相当。所有冬虫夏草样品均不含虫草素(见下表2)。

表2.各冬虫夏草原料中各核苷的含量

实施例2酪氨酸酶活性抑制作用测试

酪氨酸酶活性抑制作用测试是筛选美白药品的传统测试方法。酪氨酸酶的活性包括把左旋多巴转化成为多巴色素，这也是人类身体黑色素产生的第一步。测量多巴色素的含量可计算出酪氨酸酶的活性，同时也可以测定不同美白药品的抑制作用。不同浓度的多巴色素在492nm的吸收波长下呈线性关系(见图6)。由于5mM的维生素C能有效并完全抑制酪氨酸酶活性，故在该测试中以5mM维生素C的酪氨酸酶活性抑制能力为参考值(100％)(-29.75μM多巴色素/分(即，每分钟减少29.75μM多巴色素的产生)。

本实施例所述的酪氨酸酶抑制作用实验，包括以下步骤：

将不同种类的冬虫夏草提取液或核苷用于酪氨酸酶活性抑制作用测试，同时以没有加入任何抑制剂的对照及加入5mM维生素C为实验对照。对苯二酚的测试结果作为实验阳性对照。

具体实验过程如下：在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.8))中加入1mM左旋多巴及阳性对照或实施例1中获得的各种提取液(除了将其浓度调整为0.5mg生药/mL)或者不同核苷。加入酪氨酸酶后，在室温及黑暗的环境下放置20分钟。在492nm的吸收波长下量度吸光度。

图7显示，不同种类的冬虫夏草的提取液对酪氨酸酶均有显著的抑制作用，且所有不同种类的冬虫夏草提取液对酪氨酸酶的抑制能力相当。由此可知，本发明公开的制备方法可用于各种冬虫夏草提取液的制备，其所得的冬虫夏草提取液对酪氨酸酶活性具有显著的抑制作用。

图8示出了不同核苷对酪氨酸酶的抑制能力，结果发现肌苷亦对酪氨酸酶有显著的抑制作用，为五种核苷之首。相反，虫草素的酪氨酸酶抑制能力相对较弱，在同等浓度下，虫草素的酪氨酸酶抑制能力只有肌苷的大约四分之一。这可能是含有肌苷的冬虫夏草提取液在没有虫草素的情况下仍拥有对酪氨酸酶显著抑制作用的原因。

图9示出了有关不同浓度的肌苷(0.1mM–2.0mM)对酪氨酸酶的抑制能力的比较数据。我们发现不同浓度的肌苷对酪氨酸酶的抑制能力平均达35–42％，且抑制能力呈剂量相关：剂量越高，抑制能力越强。

实施例3高温消毒对冬虫夏草提取液的影响

本实施例证明了本发明方法获得的冬虫夏草提取液可以进行消毒，以避免在长期储存中变坏。由于高温消毒较辐照及抗菌剂成本较低，同时较适合工业大量生产的运作，故被采纳使用。采用传统的高温消毒方法，将刚从冬虫夏草提取出来的提取液，于120℃高温消毒15分钟。然后消毒后的冬虫夏草提取液与并未消毒的冬虫夏草提取液同时置于常温下48小时。按照上述方法分别检测其肌苷含量及美白功效。冬虫夏草提取液则使用按照实施例1中所描述的采用20倍重量的水、在40℃温浸10小时的提取方法提取完整天然冬虫夏草(西藏)而获得的完整冬虫夏草提取液(除了浓度调整为0.5mg生药/mL)。

48小时后，经消毒的冬虫夏草提取液明显较未消毒的冬虫夏草提取液清澈，证明本发明的有效防止冬虫夏草能够进行高温消毒，以有效防止冬虫夏草在常温下变坏。肌苷测定实验结果显示，高温消毒并不会破坏冬虫夏草中的美白活性成分肌苷(见下表3)。另外，高温消毒亦不会影响冬虫夏草提取液的美白功效(见图10)。

表3高温消毒前后冬虫夏草提取液中的肌苷含量比较

	肌苷含量(ppm)
		冬虫夏草提取液(未消毒)	40
冬虫夏草提取液(已消毒)	50

由上述实验可知，本发明所述的冬虫夏草提取液含有美白有效量的肌苷，可以通过肌苷对酪氨酸酶的抑制作用而起到美白作用。并且，本发明所述的冬虫夏草提取液不具有不期望的香菇味。另外，本发明所述的冬虫夏草提取液可方便地进行高温消毒而有利于长期储存。

以上实施例仅示例了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.包含肌苷的冬虫夏草提取液在制备美白产品中的用途，其中所述包含肌苷的冬虫夏草提取液通过包括以下步骤的方法制备：

1)提供冬虫夏草原料；

2)以所述冬虫夏草原料的重量16-24倍的水浸泡所述冬虫夏草原料，在38-42℃温浸8-12小时，得到浸泡液；和

3)过滤所述浸泡液，得到冬虫夏草提取液，

其中所述冬虫夏草原料是只有虫体部分的冬虫夏草。

2.权利要求1所述的用途，其中所述方法还包括步骤4)对所述冬虫夏草提取液进行消毒，其中所述消毒是于118-122℃的温度进行10-20分钟的高温消毒。

3.权利要求1所述的用途，其中在步骤2)中以冬虫夏草重量20倍的水浸泡所述冬虫夏草原料。

4.权利要求1所述的用途，其中在步骤2)中在40℃浸泡所述冬虫夏草原料。

5.权利要求1所述的用途，其中在步骤2)中浸泡所述冬虫夏草原料10小时。

6.权利要求1所述的用途，其中在步骤3)中以滤膜过滤所述浸泡液，以除去残渣。

7.权利要求2所述的用途，其中在步骤4)中将所述冬虫夏草提取液于120℃高温消毒15分钟。

8.权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述冬虫夏草原料是天然的。

9.权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述冬虫夏草是断裂的或者呈粉末状的。

10.权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述美白产品是药品、保健品、食品、食品添加剂、营养强化剂或美容用品的形式。

11.权利要求10所述的用途，其中所述食品是饮料。

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