CN105519435B - 一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法 - Google Patents
一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,该方法包括切取浙贝母的芯芽作为外植体、灭菌、成苗培养、诱导培养和膨大培养等步骤。本发明首次采用浙贝母芯芽为外植体,经培养成苗后诱导产生小鳞茎,可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期,在整个培养过程中,没有发生细胞脱分化和再分化,从而可大大降低遗传突变几率,可保证优良品质。本发明繁殖速度快、培养周期短,具有显著的经济效益和推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及浙贝母组织培养与繁殖的方法,是一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法。
背景技术
浙贝母(Fritillaria thunbergii)是临床常用的大宗中药材之一,被列为“浙八味”之首,历版《中国药典》均有收载,具有清热散结,化痰止咳的功能。目前,在浙贝母生产上主要有狭叶种、宽叶种、多籽种及小三子4个栽培品种。其中以狭叶种浙贝母种植面积最广,并且于2007年通过新品种认定,定名为浙贝1号;宽叶种浙贝母于2014年被认定为浙贝2号。由于浙贝母种子采收后经种植到鳞茎生长到能用于生产需要5年,有性繁殖周期长,目前生产上采用鳞茎繁殖。但浙贝母无性繁殖系数一般为2,并且由于不能通过有性生殖过程阻断病毒的继代危害,病毒在鳞茎中不断累积,导致品种退化、产量和品质降低,鳞茎变小,商品性状受到较大影响,浙贝母休眠期长、用种量大、繁殖率低成为生产上的主要问题。组织培养可以显著提高浙贝母的繁殖率,且生长周期明显缩短。目前,浙贝母离体快繁主要有2种途径:一、器官间接发生途径:浙贝母通过外植体诱导愈伤组织,继而诱导再生苗是目前研究最多的一种快繁方式,但由于该方法需要经过细胞脱分化和再分化获得组培苗,该途径存在大量的遗传变异,不利于浙贝母优良品质的遗传。二、器官直接发生途径:该途径不经过愈伤组织,浙贝母外植体直接诱导出不定芽或小鳞茎,可避免细胞分化和再分化导致的遗传变异,对保持浙贝母种质优良性状具有积极作用,但是浙贝母通过该种途径实现快繁的技术缺乏研究,存在诸多不足。
发明内容
发明目的:本发明的目的是为了解决现有技术的不足,提供一种方法简单、可减少多次继代培养的过程、繁殖速度快、培养周期短、经济效益好的高效诱导浙贝母小鳞茎的方法。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,其特征在于,它包括以下步骤:
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽,得到外植体;
(2)灭菌:用自来水冲洗浙贝母的芯芽,放入超净工作台,用体积浓度70%~75%乙醇消毒,用无菌水冲洗3~6次,再放入体积浓度为0.1~0.2%的升汞中灭菌,用无菌水冲洗3~6次,并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的浙贝母的芯芽接种于成苗培养基中培养,经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,经诱导培养后,苗大部分叶腋处逐渐出现白色膨大,统计小鳞茎诱导率;
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上进行培养,膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L,pH为5.5~6.5,培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为30~35天,统计小鳞茎膨大率,培养得到浙贝母小鳞茎。
作为优选方案,以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,步骤(2)灭菌过程为:用自来水冲洗浙贝母的芯芽15min,放入超净工作台,用体积浓度70%~75%乙醇消毒15~20s,用无菌水冲洗3~6次,再放入体积浓度为0.1~0.2%的升汞中灭菌5~15min,用无菌水冲洗3~6次,并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份。
作为优选方案,以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,步骤(3)所述的成苗培养基由MS培养基,蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成,pH为5.5~6.5;成苗培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为25~30天。
作为优选方案,以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,步骤(4)所述的诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,诱导培养基由MS培养基,1.5mg/L的NAA,0.5mg/L的KT,30g/L的蔗糖和6g/L琼脂组成,pH为5.5~6.5;诱导培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为20~30天。
作为优选方案,以上所述的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,步骤(5)所述的膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上进行培养,膨大培养基由MS培养基,60g/L蔗糖和6g/L琼脂组成,pH为5.5~6.5;膨大培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为30~35天。
本发明所述浙贝母鳞茎的打破休眠处理方法为:将鳞茎采收后用常规方法进行清洗、消毒处理后,用河沙包埋,放于2~4℃冰箱中40~50天。
本发明通过大量实验,依据愈伤组织诱导,芽增殖率,平均增殖芽数等因素筛选成苗培养基和诱导培养基的组成,并通过大量实验,依据小鳞茎膨大率筛选膨大培养,筛选不同培养基,如A.MS+1.0mg/L 2.4-D+1.0mg/L NAA;B.MS+1.5mg/LNAA+0.5mg/L KT;C.MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA,并添加不同含量的蔗糖和琼脂进行优选。实验结果表明:本发明成苗培养基(MS培养基,蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成,pH为5.5~6.5)时浙贝母芯芽能快速发育成小苗,芯芽抽茎成高5~9cm。另外实验结果表明:本发明以诱导培养基(MS+1.5mg/LNAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)诱导培养时,80~90%的分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎,可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期,取得非常好的技术效果。另外实验结果表明:本发明以MS培养基,60g/L蔗糖和6g/L琼脂组成的膨大培养基进行膨大培养;小鳞茎膨大率为80~90%,取得了非常好的技术效果。
另外本发明通过大量实验筛选了成苗培养条件、诱导培养条件和膨大培养条件,优选得到的最佳成苗培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为25~30天。最佳的诱导培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为20~30天。最佳的膨大培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为30~35天。采用本发明优选得到的成苗培养条件、诱导培养条件和膨大培养条件,可以取得高的成苗率,可实现80~90%的分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎,可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期。可实现80~90%小鳞茎膨大率为,能取得非常好的技术效果。
本发明提供的诱导浙贝母小鳞茎的组培方法和现有技术相比,具有以下创新点:
1.与常规鳞片组培生产小鳞茎的技术相比,本发明以浙贝母芯芽为外植体,通过大量实验研究筛选成苗培养,筛选结果表明浙贝母芯芽在培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)中能快速发育成小苗,芯芽抽茎成高5~9cm的苗;并且本发明通过大量实验筛选诱导培养基的组成成分,将小苗接种到优选的诱导培养基(MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L)中,大部分叶腋处均能直接膨大形成小鳞茎,从而可大大缩短浙贝母诱导产生小鳞茎的周期,在整个培养过程中,没有发生细胞脱分化和再分化,从而可降低遗传突变几率,可保证浙贝母快繁育苗优良性状的遗传,培育得到的浙贝母鳞茎的品种优良。
2.现有技术在浙贝母传统组培技术生产过程中,诱导产生的愈伤组织和不定芽还要经过至少2次继代培养才能产生小鳞茎,为单芽诱导培养产生小鳞茎,培养周期长,需要大量人力物力,成本高。而在本发明中以芯芽为外植体诱导产生小鳞茎,可大大减少多次继代培养的过程,并且每个芯芽可诱导产生多个鳞茎,再生率高,可快速生产小鳞茎,显著缩短培养周期,提高培养效率,经济效益更好。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1:一种诱导培养浙贝母小鳞茎的方法
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽;
(2)灭菌:用自来水冲洗15min后,放入超净工作台,用75%酒精消毒20s,用无菌水冲洗3次,再放入浓度为0.1%的升汞中灭菌15min,用无菌水冲洗3次,用无菌滤纸吸干外植体表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养,成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为5.5,培养条件为:温度22℃,光照强度2000Lux,光照时间10h,培养时间为30天。经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为5.5,培养条件为:温度24℃,光照强度2000Lux,光照时间10h。经诱导培养后,苗90%叶腋处逐渐出现白色膨大,培养30天;
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上进行培养,膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L,pH为5.5,培养条件为:温度25℃,置于暗处培养,培养时间为30天,小鳞茎膨大率为88%。
实施例2:一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽;
(2)灭菌:用自来水冲洗15min后,放入超净工作台,用70%酒精消毒20s,用无菌水冲洗5次,再放入浓度为0.15%的升汞中灭菌15min,用无菌水冲洗6次,用无菌滤纸吸干外植体表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养,成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度25℃,光照强度2500Lux,光照时间14h,培养时间为25天。经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度26℃,光照强度2500Lux,光照时间14h。经诱导培养后,苗89%叶腋处逐渐出现白色膨大,培养30天。
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上,膨大培养基为MS+蔗糖60/L+琼脂6/L,pH为6.5,培养条件为:温度24℃,置于暗处培养,培养时间为35天,小鳞茎膨大率为89%。
实施例3:一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽;
(2)灭菌:用自来水冲洗15min后,放入超净工作台,用75%酒精消毒20s,用无菌水冲洗4次,再放入浓度为0.1%的升汞中灭菌10min,用无菌水冲洗4次,用无菌滤纸吸干外植体表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养,成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度24℃,光照强度3000Lux,光照时间14h,培养时间为30天。经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度26℃,光照强度2500Lux,光照时间14h。经诱导培养后,苗90%叶腋处逐渐出现白色膨大,培养30天;
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上,膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度25℃,置于暗处培养,培养时间为35天,小鳞茎膨大率为90%。
实施例4:一种诱导培养浙贝母小鳞茎的新方法
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽;
(2)灭菌:用自来水冲洗15min后,放入超净工作台,用75%酒精消毒15s,用无菌水冲洗5次,再放入浓度为0.2%的升汞中灭菌5min,用无菌水冲洗5次,用无菌滤纸吸干外植体表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的外植体接种于成苗培养基中培养,成苗培养基为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为5.5,培养条件为:温度22℃,光照强度3000Lux,光照时间10h,培养时间为40天。经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,诱导培养基为MS+1.5mg/L NAA+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂6g/L,pH为5.5,培养条件为:温度25℃,光照强度3000Lux,光照时间10h。经诱导培养后,苗88%叶腋处逐渐出现白色膨大,培养30天;
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上,膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L,pH为6.5,培养条件为:温度22℃,置于暗处培养,培养时间为35天,小鳞茎膨大率为90%。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种诱导浙贝母小鳞茎的组培方法,其特征在于,它包括以下步骤:
(1)切取外植体:选取无病害的浙贝母鳞茎,剥开鳞片,从鳞茎基部切取浙贝母的芯芽,得到外植体;
(2)灭菌:用自来水冲洗浙贝母的芯芽15min,放入超净工作台,用体积浓度70%~75%乙醇消毒15~20s,用无菌水冲洗3~6次,再放入体积浓度为0.1~0.2%的升汞中灭菌5~15min,用无菌水冲洗3~6次,并用无菌滤纸吸干浙贝母的芯芽表面的水份;
(3)成苗培养:将灭菌后的浙贝母的芯芽接种于成苗培养基中培养,经培养后,芯芽抽茎成苗,高5~9cm;所述的成苗培养基由MS培养基,蔗糖30g/L和琼脂6g/L组成,pH为5.5~6.5;成苗培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为25~30天;
(4)诱导培养:将成苗接种于诱导培养基中培养,经诱导培养后,苗叶腋处逐渐出现白色膨大,统计小鳞茎诱导率;诱导培养基由MS培养基,1.5mg/L的NAA,0.5mg/L的KT,30g/L的蔗糖和6g/L琼脂组成,pH为5.5~6.5;诱导培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为20~30天;
(5)膨大培养:从叶片基部切取诱导培养出的小鳞茎,接种到膨大培养基上进行培养,膨大培养基为MS+蔗糖60g/L+琼脂6g/L,pH为5.5~6.5,培养条件为:温度22~26℃,光照强度2000~3000Lux,光照时间10~14h,培养时间为30~35天,统计小鳞茎膨大率,培养得到浙贝母小鳞茎。
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