本发明专利申请延续临时美国专利US61/801,547题目为“S-腺苷蛋氨酸的免疫检测用于个体化用药或者用于健康与癌症评估”,提交日期为2013年3月15日.本专利申请将包括上述临时专利的全部内容。
发明的背景
S-腺苷甲硫氨酸或S-腺苷蛋氨酸(SAMe)几乎存在于体内所有的组织及体液中。SAM对于转甲基作用这一过程至关重要,而甲基化几乎参与到生命的每一方面。SAM是体内DNA、RNA、蛋白质、脂类及小分子甲基转移反应中的甲基供体。正常的胚胎发育需要适当的DNA甲基化,有研究证明甲基转移酶缺失可能导致死亡(Pegg,A.E.,Feith,D.J.,Fong,L.Y.,Coleman,C.S.,O’Brian,T.G.,and Shantz,L.M.,2003,Biochem.Soc.Trans.31,356-360)。许多肿瘤细胞中DNA的甲基化呈现异常,DNA甲基化模式的改变甚至可诱发致肿瘤因子基因的表达或沉默肿瘤抑制因子的基因,有研究表明,给与啮齿类动物缺乏甲基的食物将引发肝癌。
SAMe具有转硫基作用。SAMe脱甲基后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH),随后SAH水解生成同型半胱氨酸,经转硫基作用后生成胱硫醚,随后进一步转换为半胱氨酸并最终成为谷胱甘肽。谷胱甘肽是肝细胞的抗氧化剂,可作为解毒剂。
SAMe的另一个重要功能是转氨丙基作用。SAM脱羧后将氨丙基转移给与腐胺,生成亚精胺和精胺,这两种物质对细胞生长、分化以及DNA和RNA的稳定至关重要。此外,该反应过程的副产物甲硫腺苷(MTA)是一种强效止痛消炎药,这可能是SAMe对骨关节炎、类风湿性关节炎和纤维肌痛的临床治疗有功效的原因。
SAMe是免疫体系中一种重要的物质,可维护细胞膜的正常功能,且有助于大脑中血清素、褪黑激素及多巴胺的等化学物质的产生与分解。缺乏维生素B12或叶酸铁可造成SAMe水平降低。SAMe还是一种抗氧化剂,可以保护机体免受活性氧分子的损害,活性氧分子可能来自于机体自身或环境污染,被认为是造成衰老及变性疾病的重要因素。一般认为SAMe可提高机体内其它氨基酸的功能水平。
进一步的研究表明,SAMe经裂解酶裂解后转化为甲硫分子和高丝氨酸,它是tRNA的氨基丁酸链供体,也是生物素生物合成的氨基酸链供体。脱羧后的SAMe则是生物合成神经调节物质多胺,亚精胺和精胺的氨丙基供体(Zappia et al(1979),Biomedical andPharmacologcial roles of Adenosylmethionine and the Central Nervous System,page 1,Pergamon Press.N.Y.)。
SAMe在临床上可作为肝脏疾病(Friedel H,Goa,K.L.,and Benfield P.,(1989),S-Adenosyl-l-methionine:a review of its pharmacological properties andtherapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders inrelation to its physiological role in cell metabolism.Drugs.38,389-416)、关节炎(Di Padova C,(1987),Sadenosyl-l-methionine in the treatment ofosteoarthritis:review of the clinical studies.Am J.Med.83,(Suppl.5),6-65)以及抑郁症(Kagan,B,Sultzer D.L.,Rosenlicht N and Gerner R.(1990),Oral S-adenosylmethionine in depression:a randomized,double blind,placebo-controlledtrial.Am.J.Psychiatry 147,591-595.)的治疗药物。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平降低(Bottiglieri et al,(1990),Cerebrospinal fluid Sadenosyl-l-methioninein depression and dementia:effects of treatment with parenteral and oral S-adenosyl-l-methionine.J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 53,1096-1098.)。初步的研究结果表明,给予SAMe可改善阿兹海默症患者的认知能力(Bottiglieri et al(1994),Theclinical potential of admetionine(S-adenosyl-l-methioinine)in neurologicaldisorders.Drugs 48,137-152.)。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平急剧下降(Morrison et al,(1996),Brain S-adenosylmethionine levels are severelydecreased in Alzheimer's disease,Journal of Neurochemistry,67,1328-1331.),帕金森氏症患者血液中的SAMe水平也显著下降(Cheng et al,(1997),Levels of L-methionine S-adenosyltransferase activity in erythrocytes and concentrationsof S-adenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine in whole blood of patientswith Parkinson's disease.Experimental Neurology 145,580-585.)。
使用抗肿瘤药甲氨蝶呤的患者体内SAMe水平降低,该药物与SAMe一起使用可减少其神经毒性(Bottiglieri et al(1994),The Clinical Potential of Ademetionine(S-adenosylmethionine)in neurological disorders,Drugs,48(2),137-152.)。
有研究报道艾滋病伴有痴呆症或痴呆/HIV病毒感染复合性脑病患者的脑脊液中SAM-e水平,发现其SAM-e水平比无HIV感染的痴呆病人明显降低(Keating et al(1991),Evidence of brain methyltransferase inhibition and early brain involvement inHIV positive patients Lancet:337:935-9.)。
De La Cruz等人的研究表明,SAMe是一种有效的抗氧化剂,长期施用SAMe可通过增强抗氧化防御功能改变大脑、肝脏及肾脏组织中的氧化状态(De La Cruz et al,Effects of chronic administration of S-adenosyl-l-methionine on brainoxidative stress in rats.Naunyn-Schmiedeberg's Archives Pharmacol,2000,361:47-52.)。
无肝脏疾病及有肝脏疾病的患者口服SAMe后,其肝脏中谷胱甘肽水平均有上升(Vendemiale G et al,(1989),Effect of oral S-adenosyl-l-methionine on hepaticglutathione in patients with liver disease.Scand J Gastroenterol;24:407-15.)。在口服SAMe后,肝内胆汁淤积患者的瘙痒症状及胆汁淤积有所改善(Giudici et al,Theuse of admethionine(SAM-e)in the treatment of cholestatic liverdisorders.Metaanalysis of clinical trials.In:Mato et al editors.MethionineMetabolism:Molecular Mechanism and Clinical Implications.Madrid:CSIC Press;1992pp67-79.)。而原发性纤维肌痛患者在短期服用SAMe后其症状也有所改善(Tavoni etal,Evaluation of S-adenosylmethioine in Primary Fibromaylgia.The AmericanJournal of Medicine,Vol 83(suppl 5A),pp 107-110,1987.)。此外SAMe还可用于骨关节炎的治疗(Koenig B.A long-term(two years)clinical trial withSadenosylmethionine for the treatment of osteoarthritis.The American Journalof Medicine,Vol83(suppl 5A),Nov.20,1987pp 89-94)。
SAMe在细胞的基础代谢过程中发挥重要作用,因此在许多似乎不相关的领域仍具有重要的临床意义,其中它在酒精性肝硬化的临床治疗方面的应用最引人瞩目,因为酒精性肝硬化在医学上目前还无法治愈。Mato等人的研究表明口服SAMe可将酒精性肝硬化的总死亡率和/或发展为肝移植的概率降低达29%,而安慰剂治疗组仅12%(Mato et al(1999),S-adenosylmethionine in alcohol liver cirrhosis:a randomized,placebo-controlled,double blind,multi-center clinical trial,Journal of Hepatology,30,1081-1089.)。
SAMe不仅可以减弱肿瘤坏死因子-α所造成的损害,同时还可减少其分泌量,因此在这种炎症因子增加时施用SAMe可获得很好的效果(Watson WH,Zhao Y,Chawla RK,(1999)Biochem J Aug.15;342(Pt 1):21-5.S15adenosylmethionine attenuates thelipopolysaccharide-induced expression of the gene for tumour necrosis factoralpha.)。还有研究表明,SAMe具有减弱强效免疫抑制剂环孢素A的毒性的功能(Galan A,etal,Cyclosporine A toxicity and effect of the s-adenosylmethionine,ArsPharmaceutica,40:3;151-163,1999.)。
在体外培养人红细胞的过程中添加SAMe时,SAMe可穿透细胞膜并使细胞内ATP增加从而使细胞形态得以恢复(Friedel et al,S-adenosyl-lmethionine:A review of itspharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction andaffective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism,Drugs38(3):389-416,1989)。
有研究表明SAMe有利于偏头痛的治疗(Friedel et al,S-adenosyl-lmethionine:A review of its pharmacological properties and therapeuticpotential in liver dysfunction and affective disorders in relation to itsphysiological role in cell metabolism,Drugs 38(3):389-416,1989)。
SAMe也用于治疗外周动脉闭塞性疾病患病人,发现它可以降低的血液粘稠度,可能是通过影响红细胞的变形能力实现的。
用发酵法可获得纯度为60%~80%的SAMe,也就是说最终产物包含60%~80%具有生物活性的(S,S)-SAMe,其余20~40%为不具生物活性(R,S)-SAMe(Gross,A.,Geresh,S.,and Whitesides,Gm(1983)Appl.Biochem.Biotech.8,415.)。酶促合成方法得到的不具生物活性的同分异构物的比例超过60%(Matos,JR,Rauschel FM,Wong,CH.S-Adenosylmethionine:Studies on Chemical and Enzymatic Synthesis.Biotechnologyand Applied Biochemistry 9,39-52(1987)。利用对映体分离技术可以分离、纯化具有活性的SAMe。最新的分离技术可以大规模地分离手性分子,且花费较小。此外,用特定的立体结构选择法有望合成具有生物活性的对映体,但该技术目前尚未成熟(Matos,JR,RauschelFM,Wong,CH.S-Adenosylmethionine:Studies on Chemical and EnzymaticSynthesis.Biotechnology and Applied Biochemistry 9,39-52(1987;Hoffman,Chromatographic Analysis of the Chiral and Covalent Instability of S-adenosyl-l-methionine,Biochemistry 1986,254444-4449:Segal D and Eichler D,TheSpecificity of Interaction between S-adenosyl-l-methionine and a nucleolar2-0-methyltransferase,Archives of Biochemistry and Biophysics,Vol.275,No.2,December,pp.334-343,1989)。
De la Haba最先证明硫是手性分子,仅其中一个可合成并应用在生物领域((Dela Haba et al J.Am.Chem.Soc.81,3975-3980,1959))。DNA和RNA的甲基化对于细胞的正常生长至关重要,SAMe是该甲基化反应中唯一的甲基供体,该过程由甲基转移酶催化。Segal和Eichler等的研究表明(S,S)-SAM-e与酶的结合紧密度比无生物活性的(R,S)-SAM-e强10倍,从而证明了一种与硫手性中心空间特异的结合的新方式。有报道表明,(R,S)-SAM-e与其它的甲基转移酶结合的程度与(S,S)-SAM-e一致,因此(R,S)-SAM-e可充当该酶的竞争抑制剂(Segal D and Eichler D,The Specificity of Interaction between S-adenosyl-l-methionine and a nucleolar 2-0-methyltransferase,Archives ofBiochemistry and Biophysics,Vol.275,No.2,December pp.334-343,1989;BorchardtRT and Wu YS,Potential inhibitors of S-adenosylmethionine-dependentmethyltransferases.Role of the Asymmetric Sulfonium Pole in the Enzymaticbinding of S-adenosyl-l-methionine,Journal of Medicinal Chemistry,1976,Vol19,No.9,1099-1103.)。
无论是在其光学纯的SAMe对映体形式或是与其它外消旋混合物,SAMe在室温下的稳定性不佳,可能降解而产生不可取的产物。SAMe与其对映体呈现分子内不稳定从而导致在高温及室温条件下分子失去稳定性或断裂。因此获得新的SAMe的稳定盐成为许多专利的主题,为工业化生产SAMe提供基础。本发明得以使用现有技术中已公开的稳定SAMe对映体的SAMe盐进行抗体鉴定和其它方面的工作。
近年来,临床诊断等领域都有广泛的发展,既在于越来越多的可被简便而准确测定的体液中的代谢物或外源性药物等分子,也在于检测方法方面的进展。在过去的几十年中,许多物质如禁忌药物和其它生物分子的检测已是司空见惯。基于抗原与抗体反应的免疫检测也被广泛地应用在这一方面。基于抗体的特异性及高亲和力,免疫检测可以精确地定量检测生物液体中的极低浓度的物质。
因此,需要一种改进的检测方法,以定量甲基化指数,并把甲基化指数作为生物指标,以检测、诊断癌症及其它疾病,并有助于监测病情发展、治疗效果和预后。
图标说明
【图1】为ELISA测定两个抗SAM单克隆抗体效价的曲线。其中X-轴显示OD450值,Y-轴显示纯化的腹水抗体在1μg/μl时的稀释倍数。
【图2】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺苷)与84号克隆的交叉反应不超过1.25%。其中X-轴表示SAM和SAM类似物不同浓度值,以nM为单位,Y-轴是竞争抑制比率。
【图3】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺苷)与118号克隆。其中X-轴表示SAM和SAM类似物的不同浓度值,反应不超过1%。以nM为单位,Y-轴是A/A0,即是有竞争抗原的孔和空白对照孔(零竞争孔)的OD450值的比。
【图4】为竞争性ELISA定量SAM的标准曲线。其中X-轴表示SAM浓度的对数,Y-轴显示抑制反应的LOGIT值。
【图5】为本发明改进的新的SAM类似物的合成过程。
【图6】为蛋氨酸转硫代谢途径。缩写:THF:四氢叶酸;MS:蛋氨酸合成酶;BHMT:甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶;MAT:蛋氨酸腺苷甲基转移酶;SAM:S-腺苷蛋氨酸;SAH:S-腺苷同型半胱氨酸;SAHH:S-腺苷同型半胱氨酸水解酶;ADA:腺苷脱氨酶;AK:腺苷激酶;CBS:胱硫醚β-合成酶。发明的综述:
本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症的方法,包括以下步骤:(a)确定的所述哺乳动物类患有癌症的生物样品中的甲基化指数;(b)测定所述哺乳动物类的样品中甲基化指数;和(c)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所述哺乳动物类的癌症。
甲基化指数是通过下列步骤测得的:(i)采集样品;(ii)样品与抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体混合;(iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与(ii)中抗体的结合情况;(iv)定量(iii)中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量,以算出样品中S-腺苷蛋氨酸的浓度;(a2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺苷同型半胱氨酸含量;(a3)计算(a1)/(a2)比率即是样品的甲基化指数。
本发明还提供了确定癌症治疗方案用于治疗肿瘤患者的方法,包括:(a)测定患者样品中的甲基化指数;(b)比较样品中和对照组中甲基化指数的水平,以确定所测的甲基化指数是否有预测意义;和(c)根据(b)的结果决定合适的治疗方案。根据甲基化指数的大小不仅指导治疗方案,而且可以提示病人对当前治疗反应好还是反应不佳。
治疗人类抑郁症或心理疾病的方法由以下组成:用以下方法测定人类体内S-腺苷蛋氨酸含量:(i)采集样品;(ii)样品与抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体混合;(iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与(ii)中抗体的结合情况;(iv)定量(iii)中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量,以算出样品中S-腺苷蛋氨酸的浓度;分析甲基化指数和抑郁症或心理性疾病的关系;根据(b)的相关结果决定合适剂量的有效药物治疗抑郁症或心理性疾病。
一种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于精神性疾病或/和神经变性病症的易感性的方法,该方法包括:(a)获得一个或多个来自受试者的生物样品;(b)测定样品中S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数;和(c)比较(b)中样品中的生物标志物(S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数)的水平与对照样品中相应的生物标志物的水平,其中如果来自受试者的样品的两个或更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异常,预计受试者将容易患精神性疾病或神经退行性疾病。
一种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法,其中所述的疾病是伴随着S-腺苷蛋氨酸缺陷的各种疾病:选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾病的风险的人;从所述患者或潜在患者中收集生物样品;使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平;分析生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与所述疾病存在或不存的关系。
一种用于评估受试者是否需要进行用S-腺苷蛋氨酸的单独治疗或与其它化疗剂合用的方法,包括以下步骤组合:(a)从怀疑需要这种治疗的受试者中收集体液样品;(b)测定所述样品中S-腺苷蛋氨酸水平的量;(c)测量的S-腺苷同型半胱氨酸的水平并计算的甲基化指数;(d)比较所述样品与的正常标准的甲基化指数;和(e)如果所述样品的甲基化指数超出正常范围,提示需要S-腺苷蛋氨酸治疗。
对于本发明的阐述
本发明提供了对患有多种疾病的的患者的检查、诊断、治疗和健康评估。他们的健康状况可以通过精确地测定检测S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的浓度进行评估。准确测定上述分子将会算出甲基化指数,该指数可反映人体的健康状况。
本发明的测定法使用特性抗S-腺苷蛋氨酸及其特定类似物。该抗体是通过接种宿主动物获得的。所使用的免疫原包括免疫以下分子式的一系列化合物(S-腺苷蛋氨酸半抗原一类)的直接或间接耦合物:
包括其对映体、非对映体、对映体富集的混合物、外消旋混合物、一个原子富集的形式或其结晶形式、非结晶形式、无定形形式、其带电和不带电的形式、溶剂化物、代谢物以及它们的盐;其中A是从下组中选出:
其中,M是选自N、N+、C、S、S+、Se、Se+和P的组成的组中;----表示用于各如上所定义的基团的键合位置;
X独立地选自H、CH3、CH2OH、CH2NH2、OH、OCH3、NH2、SH、CHO和CN组成的组中;
Z独立地选自CH3、CH2OH、CH2NH2、OH、OCH3、NH2、SH、CHO和CN组成的组中;
B和C是独立地选自H、OH、NH2、SH、F、Cl、Br和I组成的组中;
D独立地选自NH2、OH、SH、F、Cl、Br和I组成的组中;
Y独立地选自H、CH3、CH2OH、CH2NH2、OH、OCH3、NH2、SH、CHO和CN组成的组中;
W独立地选自H、COOH、CONH2、COOCH3、CN、CHO组成的组中及这些官能衍生物;
然后收集宿主动物的血清。抗体制备细节请参见我们的另外一个美国专利8344115,其全部内容通过引用结合于此,如同它被在此重复一样。
在另一个方面,本发明提供小鼠单克隆和兔多克隆抗体,包括天然的、重组的、人源化及嵌合的抗S-腺苷蛋氨酸抗体和抗S-腺苷同型半胱氨酸抗体,制备方法见美国专利8344115中所描述。
本发明还提供了使用抗SAM和SAH单克隆抗体的免疫测定方法,以定量甲基化指数和SAM,明确SAM和甲基化指数,对于指导和选择使用SAM的治疗方案和评估病人的健康状态等。
本发明还进一步提供使用该甲基化指数作为人群普查标记物,提示个体的一般健康状态。
本发明进一步提供了快速、可靠和廉价的免疫测定方法来测量尿或血清/血浆样品中SAM和SAH水平,全血半定量快速检测试纸条及小型设备在开发中。在本发明的一个实施方案中,膜是预浸用抗SAM(或抗SAH)抗体-染料(胶体金)偶联物。第二抗体被固定在对照区。抗SAM(或抗SAH)抗体被固定在试验区。样品沿着膜迁移流动时,样品中的抗原与胶体金偶联的抗体形成抗原-抗体复合物。如果SAM(或SAH)存在,抗原-抗体复合物形成,并会被在这两个测试和控制区的抗体捕获,因此粉红色(胶体金)条带就会在这两个区域形成。如果SAM(或SAH)抗原不存在,抗体-染料(或胶体金)结合物通过对照区二抗体被捕获,从而粉色带只见于对照区,这表明试验条件本身是正确地,结果是可靠和有效的。标准品和样品的同时测试,比较测试区的和对照区的信号(阳性带颜色和宽度)强度,来大致确定SAM(或SAH)含量的高低,一种半定量的SAM(或SAH)的测试方法。
如上述同样机制的竞争性免疫测定方法,试验区固定有SAM(或SAH)抗原。样本中的SAM(或SAH)与固定在测试区膜上的SAM(或SAH)竞争性地结合数量有限的抗体-染料(胶体金)偶联物。来自标本中的SAM(或SAH)越多,膜上SAM(或SAH)与抗体偶联物结合的越少,粉色线会月浅。如果样品中没有SAM(或SAH)或者极低的,测试区和控制区会同时出现两个较强的带(或线)。
半定量快速检测试纸条是消费者或患者在服用SAM-e作为治疗药物前,治疗过程中,以及决定何时停药时使用较为理想的检测方法。
本发明还提供用于哺乳动物类疾病个性化用药的方法。该方法包括测量患者体液中的甲基化指数,基于所测的甲基化指数水平,提出一个可能有效的治疗方案。
本发明还提供一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法,诊断时测定第一个时间点的甲基化指数;治疗患者疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水平;比较第二个时间点的第一个时间点的受试者的甲基化指数变化,以确定癌症治疗的效果,甲基化指数提高预示治疗效果好。
在另一个方面,本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症患者的方法,该方法包括以下步骤的方法:(a)测定述哺乳动物类癌症的样品的甲基化指数;(b)分析所测得到的甲基化指数与相应的癌症进度发展的关系;(c)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所述哺乳动物类患有的癌症。该方法包括收集来自I期、II、III期或IV期癌症患者血液样品,并分别测定SAM和SAH的水平,然后计算出甲基化指数,探求甲基化指数与癌症阶段(或分期)的关联关系,然后选择适当的治疗方案用于治疗所述哺乳动物。
本发明也在确定DNA甲基转移酶抑制剂对于治疗癌症到底是否有效,有多大效果的问题具有非常好的评估价值。甲基化指数是评估DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂在特定组织和器官内如何发挥作用,发挥作用的程度和特异性方面的最好的工具或手段。因此,用本发明提供的免疫方法简单方便地测定甲基化指数,可以评估DNA甲基转移酶抑制剂功效。
本发明还提供:
1、指导用S-腺苷蛋氨酸进行的治疗
SAMe治疗的有效的疾病包括轻度到中度的抑郁症,骨关节炎(比非类固醇消炎药更好),纤维肌痛。SAMe治疗效果一般的情况也有所报道。最有可能的原因是与其它多数疾病的治疗情形类似,即某些患者,则不适合使用的SAMe而另一些病人是SAMe治疗的很好候选对象。为了找出病人是否是使用某些药物的最佳候选,有些必要的检测需要做。申请人已经发现,最好是在治疗疾病之前,测定血液或尿液样品中SAM的水平。
以SAMe为辅助治疗的各种疾病,例如肝脏疾病,维生素B12或叶酸缺乏,癌症,用左旋多巴(L-多巴)治疗帕金森氏症患者。原因是这些疾病可引起体内的SAM水平明显降低肯定的SAM的水平是否实际上是减少了,最好的方式是直接测量血浆的SAM水平。有的时候SAM水平可以因治疗和疾病本身等情况有所降低。因此,监测的SAM水平对于改善整体的治疗效果非常重要的,无论治疗药物中是否有SAMe。在以适当的治疗方案治疗抑郁症,骨关节炎,纤维肌痛,帕金森氏,阿尔茨海默氏病,痴呆,肝脏疾病,滑囊炎,肌腱炎,慢性腰背痛,多发性硬化症,脊髓损伤,偏头痛,铅中毒,以及延缓衰老等,当SAM水平低于一定的阈值时,补充合适剂量的SAMe将有利于整体治疗。当治疗还没有开始,如果检测到SAM不足,先静脉注射SAMe,以上疾病的症状会迅速缓解。
另一方面,由于药物或食物与SAMe的相互作用的信息报道与研究非常有限,加上SAMe也不是没有的显著精神和心血管方面的不良影响和风险这一事实,正确的做法是,在没有条件听取医生的建议(Fetrow,C.W.et al."Efficacy of the dietary supplementSadenosyl-L-methionine."Annals of Pharmacotherapy 35no.11(November 2001):1414-1425)的情况下,应该积极指导消费者,以避免这种未受监控地服用作为膳食补充剂SAMe出现不期望发生的结果。SAMe与其它抗抑郁的处方同时服用会引起五羟色胺综合征,这是相当危险的。SAM的免疫测定方法,是让临床实验室和患者自己能够快速知道体内SAM水平的最佳途径。该免疫分析灵敏、简单、快速、不需要昂贵的设备。不同时间测定的结果之间是可比的。此外,正常血浆的SAM浓度似乎因以下因素而有所不同:性别、个体的体重、种族、饮食、健康状况、是否服用药物等等。因此,监测个体的SAM水平且与该个体的其它时间或正常对照下SAM水平相比较,对于正确地指导个体化使用SAMe,以达到最佳的治疗结果起到至关重要的作用。
2、疾病发生和预后与甲基化指数的关联
甲基化指数定义为SAM与SAH的浓度比。在某些情况下,用甲基化指数比SAM水平尤其重要而准确。原因包括:(1)SAM是在甲基转移酶(COMT)作用后SAM甲基化反应的直接末端产物。(2)SAM水平随种族、性别、体重和饮食而变化。甲基化指数可以减少这些因素引起的差异。
癌症被认为具有遗传和表观遗传双重起因。DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一。越来越多的研究发现一度被忽视的表观遗传学对许许多多的生命现象都有影响,这说明甲基化对癌症的影响只能会是更加深远。在癌症发生的不同阶段,癌细胞中DNA甲基化水平是不同的。异常DNA甲基化在癌症中普遍存在,表现为基因组范围总体低甲基化和区域性高甲基化的特定模式。总体DNA低甲基化与原癌基因,例如c-JUN,c-MYC,和c-Ha-Ras的激活相关联,并导致基因组的不稳定性。位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高甲基化导致转录静化和基因组不稳定。CpG岛高甲基化是引起基因失活突变的另外和/或补充机制,现今被认为是癌症发生的重要因素。肿瘤抑制基因(例如p53基因)启动子区域CpG岛高甲基化引起的基因失活还与癌症的发展和不良预后相关。研究结果表明针对甲基化模式或状况的治疗和预防性使用药物或营养添加剂在人类肝细胞癌(HCC)中的意义,开辟了使用分子靶点,包括在此研究中发现的靶点,对有效抑制肝细胞癌的发生和发展有重大意义(DiegoF.Calvisi et al.“Mechanistic and Prognostic Significance of AberrantMethylation in the Molecular Pathogenesis of Human Hepatocellular Carcinoma.”J Clin Invest.2007;117(9):2713–2722.)。
去甲基化制剂可降低DNA甲基化的水平,是一种颇具前景的化学治疗药,目前已被用于治疗癌症的研究(Esteller M.“DNA methylation and cancer therapy:new developmentsand expectations.”Curr Opin Oncol.2005Jan;17(1):55-60.2005Jan;17(1):55-60.)。
在本发明中,癌症或肿瘤包含了所有的在病人体内恶性生长的新生物,包括原发肿瘤和任何转移肿瘤。癌症可以分为液体肿瘤或实体肿瘤。液体肿瘤包括血液来源的肿瘤,如骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、白血病(例如华氏综合症、慢性淋巴细胞白血病和其它白血病)、淋巴瘤(如B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)。实体肿瘤可能出现在器官中,包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌及肝癌等。在本文中,癌细胞包含了肿瘤细胞,指的是具有异常的细胞分裂速率(速率增加)的细胞。癌细胞包含但不仅限于肉瘤,还包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、恶性腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分化型癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝外胆管癌、乳头状癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、胚胎性癌、乳腺癌、胃肠癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌以及头部和颈部的鳞状细胞癌等;肉瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、间皮肉瘤等;血液肿瘤包括骨髓瘤、白血病(例如急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、粒细胞性白血病、单核细胞白血病和淋巴细胞性白血病)和淋巴癌(如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状细胞肉瘤和霍奇金病);神经系统肿瘤则包括神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤或室管膜瘤等。
3、胚胎发育与人的全面健康与甲基化指数的关联
SAM和SAH的水平可能通过影响DNA的甲基化水平(这种作用反过来将引起基因激活的特定改变)来控制体细胞胚胎发生。SAM水平上升可能是胚胎形成和发育成完整的胚胎的先决条件(Munksgaard D,et al.“Somatic embryo development in carrot isassociated with an increase in levels of S-adenosylmethionine,S-adenosylhomocysteine and DNA methylation.”Physiologia Plantarum,Volume 93,Issue 1,Article first published online:9OCT 2008)。
4、一般人的健康评估和筛选与甲基化指数的关联
甲基转移酶(MT)在人类疾病的形成过程中起重要作用。多巴胺(DA)多巴胺是由患者体内多巴胺过多造成。比如,有关精神分裂症起因的多巴胺(DA)假说多巴胺(DA)是说精神分裂症是由患者体内多巴胺过多造成。儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)可降解中枢神经系统中的儿茶酚胺类神经递质(包括多巴胺类),COMT为一些精神分裂症的诊断治疗奠定了基础(Renson J et al“Action of the inhibitors of catechol ortho-methyltransferase on the adrenal catecholamines in the rat.”Arch Int PhysiolBiochim.1960May;68:534-7.)。人体内有超过30种不同的甲基转移酶,其底物都是对人体功能至关重要的多种物质。
甲基化指数被作为人类总体健康、“活力”或“健康”的一个重要指标。
此外,血浆中正常的SAM浓度因人而异,主要取决于性别(一般来说男性高于女性),个体体重,还可能种族和饮食等等。SAM和SAH在代谢上关联紧密,因此SAH浓度受到以上各因素的影响与SAM相似,用两种物质(SAM和SAH)的比值应该很有可以排除或减轻这些因素的影响。
SAH和SAM与心血管疾病、抑郁症、癌症以及与老化相关的疾病如阿兹海默症等的关联是有据可查的。甲基化对于胎儿的发育、分化、蛋白质表达的表观遗传调控(主要通过DNA,RNA和组蛋白的甲基化)十分关键。SAM和甲基化指数的高低是衡量人体“活力”的指标或“健康”的标志。
本发明的重大意义在于其提供了:
1、直接、准确地定量所有各种生物样品甲基化指数的方法。
2、在所有的实验室中都可以做到的直接、准确地定量甲基化指数的方法。
3、直接、准确地定量甲基化指数的方法,用于评估整体的健康状况,肿瘤(癌症)预测和预后,所有疾病的治疗(用S-腺苷蛋氨酸的治疗或其它治疗)效果的评估。
4、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在肿瘤鉴别诊断中的应用。
5、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在癌症化疗耐受(效果)中的应用。
6、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在胚胎形成,分化及衰老研究中的应用。
7、用试纸条或其它介质的半定量和定性免疫方法测定甲基化指数,以方便消费者用于上述1-6方面。
8、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸,以方便消费者监测S-腺苷蛋氨酸作为处方和非处方药物治疗一些疾病状态。
9、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸,以方便消费者用于尿液和血样品。
10、定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸,用于指导并监测S-腺苷蛋氨酸作为药物的治疗情况。
本发明也提供用S-腺苷蛋氨酸和包括S-腺苷蛋氨酸的综合治疗分析及方案。本发明尤其提供了合成Aza-S-腺苷蛋氨酸半抗原的重要改进。详细阐述见下合成方案1和图5。
合成方案1
收集了病人血浆样品,用含有本发明中半抗原制备的抗体的酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定了S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量。ELISA形式包括以下几种:
形式1:(1)样品或标准品,(2)抗体,(3)半抗原-酶偶联物,(4)二抗包被的试纸条或酶联板,二抗举例:羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体,(5)洗涤液,(6)酶底物,(7)终止液(如果使用“终点”模式,终止液可有可无;如果使用“速率”模式,不需要终止液)
形式2:(1)样品或标准品,(2)抗体,(3)二抗-酶偶联物,(4)半抗原-载体蛋白包被的试纸条或酶联板,(5)洗涤液,(6)酶底物,(7)终止液(如果使用“终点”模式终止液可有可无;如果使用“速率”模式,不需要终止液)
形式3:(1)针对2个决定簇的2个配对抗体,(2)样品或标准品,(3)在(1)中的一个抗体与酶偶联,(4)洗涤液,(5)酶底物,(6)终止液(如果使用“终点”模式终止液可有可无;如果使用“速率”模式,不需要终止液)
本发明同时阐明基于免疫学方法(ELISA等)的测定SAM的检测试剂盒(包含抗SAM的抗体)。ELISA试剂盒可以是以上任何一种形式。例如,ELISA试剂盒可以包括以下成分:(a)二抗吸附在固相介质上,(b)包被(固化)半抗原及类似物,免疫原或其它含有免疫原的类似的蛋白,(c)以固体或溶解形式的酶底物,(d)示踪物标记半抗原或类似物(示踪物或酶偶联物),(e)缓冲液和洗液,(f)附加成分,主要用于防止非特异性吸附或结合或聚集。(g)加样枪、孵育器、标准品、标准曲线、结果读数仪。
SAM和SAH含量测定以后,甲基化指数即可以算出(SAM/SAH),用于评估个体的健康状况。从11里健康人的测定结果看,健康正常人SAM水平为147±16nM,SAH水品为29±11nM,甲基化指数为5±1。癌症病人平均SAM为103±52nM,动脉粥样硬化病人平均SAM为113±15nM,以含有兔单抗测定SAH试剂盒初步测定动脉粥样硬化病人血浆中SAH明显升高,SAM/SAH则明显降低。肝脏病人平均SAM为45±8nM(从26例样品),比正常人的SAM水平明显降低。SAM和SAH的比值,及甲基化指数比SAM或SAH能够更精确地反映一般健康状况,疾病状态,发展和预后。一般认为健康人的甲基化指数应该大于4(该值与检测方法有关,这个值是由高压液相和质谱的方法算出来的)在病理状况下,由于SAM水平降低,同时SAH水平升高,甲基化指数小于4,甚至小于1。降低的甲基化指数反过来会影响体内重要物质如DNA,RNA,多肽,激素,神经递质等的甲基化过程,从而导致身体病变的发生或恶化。
甲基化指数也可以用来决定化疗方案。甲基化指数明显降低的肿瘤病人可以使用较积极的方案。甲基化指数可以用来根据癌症阶段和每个病人的具体情况选择合适的治疗方案,显示甲基化指数在个体化治疗和用药中的应用价值。