CN114617899B - S-腺苷甲硫氨酸在制备治疗脓毒血症相关性脑病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了S‑腺苷甲硫氨酸在制备预防脓毒血症相关性脑病药物中的应用。S‑腺苷甲硫氨酸可以缓解SAE的相关症状，接受S‑腺苷甲硫氨酸治疗的盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠，相比对照组，其死亡率有所降低，其神经系统的相关症状有不同程度的缓解，各种细胞因子表达的下调，小胶质细胞的激活及数量减少。本发明发现S‑腺苷甲硫氨酸对SAE有预防作用，这为SAE的治疗开拓了新的研究前景，为S‑腺苷甲硫氨酸的深度研发和S‑腺苷甲硫氨酸的临床治疗提供了新的思路。

Description

S-腺苷甲硫氨酸在制备治疗脓毒血症相关性脑病药物中的 应用

技术领域

本发明涉及 S-腺苷甲硫氨酸在制备预防脓毒血症相关性脑病药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸，英文名S-adenosyl methionine，又称活性甲硫氨酸，是体内甲基的最重要的直接供体。在生物体内由ATP与甲硫氨酸在甲硫氨酸活化酶的作用下合成。甲硫键是高能键，另外其丙基胺部分也加入到多胺化合物中。当胆碱、肌酸及其它甲基化合物生成时它作为甲基供体而起作用。

临床常用药-丁二磺酸腺苷蛋氨酸是S-腺苷甲硫氨酸的稳定性复盐，在肝内，腺苷蛋氨酸使质膜磷脂甲基化，而且通过转硫基反应可以促进解毒过程中硫化产物的合成，多年来主要用于治疗肝硬化前和肝硬化所致的肝内胆内淤积。

脓毒血症相关性脑病(SAE)常见于全身疾病患者。该综合征被定义为弥漫性脑功能障碍，临床或标准实验室检测发现，脓毒血症相关性脑病是在没有直接中枢神经系统感染、结构异常或其他类型脑病（例如肝性或肾性脑病）的情况下，伴随败血症。SAE患者表现为从轻度谵妄到昏迷的一系列脑功能紊乱。由于死亡率随着SAE的严重程度而增加，所以SAE患者的早期识别和治疗对于降低相关的发病率和死亡率非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供 S-腺苷甲硫氨酸在制备治疗脓毒血症相关性脑病药物中的应用，以解决上述背景技术中遇到的问题。

S-腺苷甲硫氨酸可以缓解SAE的相关症状，接受S-腺苷甲硫氨酸治疗的盲肠结扎穿刺（CLP）小鼠，相比对照组，其死亡率有所降低，其神经系统的相关症状有不同程度的缓解，各种细胞因子表达下调，小胶质细胞的激活及数量减少。本发明发现S-腺苷甲硫氨酸对SAE有预防作用，这为SAE的预防开拓了新的研究前景，为S-腺苷甲硫氨酸的深度研发和S-腺苷甲硫氨酸的临床治疗提供了新的思路。

附图说明

图1：各组小鼠进行盲肠结扎穿刺术（CLP）后3d的死亡率比较。Sham组是空白组，即不进行CLP处理+不进行药物处理；CLP+生理盐水组是对照组，即CLP处理+腹腔注射生理盐水；SAM50mg/kg给药组，即CLP+术前腹腔注射SAM 50mg/kg /d 2周处理；SAM100mg/kg给药组，即CLP+术前腹腔注射SAM 100mg/kg /d 2周处理；SAM150mg/kg给药组，即CLP+术前腹腔注射SAM 50mg/kg /d2周处理。

图2：各组小鼠在CLP处理后3d后疾病行为的比较。各分组的含义与前图一致。注：*p<0.05。

图3：各组小鼠在CLP处理后3d认知功能的比较。各分组的含义与前图一致。注：*p<0.05。

图4：各组小鼠在CLP处理后3d脑组织皮层及海马部位TNF-α的比较。各分组的含义与前图一致。注：*p<0.05。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。

下述实验方法中所用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出诸多修改，这样的修改也落入本发明的保护范围之内。

实施例1：盲肠结扎穿刺术实验

一、实验材料

实验动物：C57裸小鼠，6-8周龄，雄性，体重20-25g。

药物制备：S-腺苷甲硫氨酸，溶于0.9％生理盐水，分别配制成5.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml的溶液。

二、实验分组

1、Sham：不进行CLP处理的小鼠+不进行药物处理

2、对照组：CLP+不加药物处理

3、T1组：CLP+术前14d腹腔注射S-腺苷甲硫氨酸50mg/kg/d。

4、T2组：CLP+术前14d腹腔注射S-腺苷甲硫氨酸100mg/kg/d。

5、T3组：CLP+术前14d腹腔注射S-腺苷甲硫氨酸150mg/kg/d。

给药方案：药物均在CLP术前14d开始每日给予腹腔注射，按照10ul/g的单位体积进行腹腔注射

三、盲肠结扎穿刺术

1.器材：保护设备：乳胶手套、口罩和实验服；麻醉：40%水合氯醛、1ml针管；备皮：电动修剪器；手术器械:手术刀、解剖剪刀、显微解剖剪刀、直型手术钳、直型解剖钳、持针器、不可吸收外科缝合线、21G注射器针头、缝合针；术后复苏：0.9%生理盐水、电热毯。

2.实验步骤：

①称量动物的重量，以确定麻醉剂的用量。

②腹腔注射40%水合氯醛(按照每g体重0.01ml)

③用镊子夹住脚趾，监测麻醉强度。充分的麻醉应导致肢体无反应(如肢体无屈曲)。

④使用电动修剪器刮除腹部下象限，并用碘伏消毒该区域。

⑤把动物放在背上的聚苯乙烯泡沫垫上，头部远离操作人员。

⑥用手术刀纵向切开皮肤中线，注意不要刺入腹膜腔。初次切开后，用小剪刀将切口延伸，进入腹膜腔1.5-2 cm

⑦识别腹肌的白线(中线白色筋膜)，并将其切开进行肌间切口和筋膜和腹膜层切口。

⑧用钝性解剖钳定位盲肠并将其取出，将剩余的小肠和大肠留在腹腔内。重要的是不能破坏或损伤肠系膜血管。（在大多数病例中，盲肠位于腹部左侧）

⑨在距盲肠尾端1/2处结扎盲肠。

⑩盲肠穿孔前，将盲肠内容物轻轻推向盲肠远端，在盲肠穿孔时，轻轻抽吸任何滞留的空气或气体。在结扎和盲肠末端之间，从肠系膜到反肠系膜方向进行一次穿透穿刺穿孔盲肠。

⑪取下针头后，从肠系膜和反肠系膜穿通孔中挤出少量(滴)粪便。

⑫将盲肠移至腹腔内，不要将粪便从盲肠扩散到腹壁伤口边缘。

⑬应用简单的流动缝合线关闭腹膜、筋膜、腹肌和皮肤。

⑭皮下注射预温生理盐水1ml。

⑮.小鼠放回到笼子里，并将笼子放在控温毯上12h。并且在 12 h光明与黑暗周期和监控它们每6 h。小鼠回到笼子后可自由获得水和食物。

实施例2：小鼠存活率的比较

一、实验方法：

按照实验设计分组经过药物处理14后，按照实例1对各组小鼠进行手术处理，3天后统计各组小鼠的存活数量，并进行比较。

二、实验结果：如图1. 经过CLP手术处理后小鼠的存活率较未进行CLP处理的sham组小鼠的存活率明显降低。经过腹腔注射SAM处理的小鼠，在CLP术后3天的存活率较注射生理盐水后进行CLP处理的小鼠有所升高。

实施例3：旷场实验

一、实验器材：实验装置由旷场反应箱和数据自动采集两部分组成。小鼠旷场反应箱高25—30 cm，底边长72 cm，将旷场底面平均分为16个格子，中央4个格子（面积625 cm²）为中央区。正上方1 m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。数据自动采集系统将实验结果进行记录及分析。

二、实验步骤：实验在安静地环境中进行，将实施例1的小鼠放入旷场反应箱内底面，同时开始摄影及计时，10min后将小鼠重新放回笼内。清洗箱内的内壁及底面，以免上次动物残留的信息（如动物的大小便、气味等）影响下次测试结果。清洗结束后更换动物，继续进行实验。

三、观察指标：1、水平运动平均速度――――反应小鼠的运动情况。例如抑郁小鼠水平运动距离将大大减少，多躲避于旷场一角不动。

2. 中央区运滞留时间――――反应小鼠的焦虑情况。抗焦虑药物可以在不改变一般运动情况的前提下增加小鼠的中央区滞留时间。抑郁小鼠中央区滞留时间也会大幅度下降。

四、实验结果：

如图2A.经过CLP手术处理后小鼠在旷场内运动的平均速度较sham组小鼠的明显降低。但是经过腹腔注射SAM处理的小鼠在旷场内运动的平均速度较注射生理盐水后进行CLP处理的小鼠增加。反映了经过SAM预防处理后可以改善SAE小鼠的运动功能。

如图2B.经过CLP手术处理后小鼠在旷场中央区域的滞留时间较sham组小鼠的明显降低。但是经过腹腔注射SAM处理的小鼠在旷场内中央区域的滞留时间较注射生理盐水后进行CLP处理的小鼠增加。因为在中央区域滞留时间放映了小鼠的焦虑情况，故改实验结果证明经过SAM预防处理后可以改善SAE小鼠的疾病行为。

如图2C.小鼠在旷场内的轨迹图。

实施例4：新物体识别实验：

一、实验器材：仍采用旷场实验时使用的旷场反应箱及摄影设备，准备A，B，C三种物体，其中A，B物体完全一样，C物体与A，B两物体大不相同；物体直径为3cm左右。

二、实验步骤：

第1阶段，适应期，小鼠在实验装置内(无物体)自由运动10分钟。------这个也相当于做矿场实验

第2阶段，熟悉期，在装置中放入2个相同的物体(AB，确保物体没有气味，不被推动)，物体距离两侧壁10cm，将小鼠背朝物体从距物体等距离处放入装置中，用摄像头及软件来纪录小鼠在每个物体上的探索时间(以嘴或者鼻子接触到物体和凑近物体约2-3cm范围都算对物体的探索)，在10min内记录测定动物探索每个物体的次数。

第3阶段，测试期，一般选择第2阶段完成后的1h作为检测记忆的时间间隔。将两个相同物体中的一个物体替换成一个不同的物体放入装置中(AC或BC)，同样将小鼠背朝物体从距物体等距离处放入装置中5min。同样记录10min内小鼠对两个物体的探索时间。

三、观察指标：测试期间，小鼠分别对新旧物体的探索时间。该模型根据动物对见过的熟悉物体和没有见过的新物体的探究时间的长短来评价被测试动物的记忆能力，即当被测试动物未遗忘环境中见过的熟悉物体时，便会用更多的时间探究没有见过的新物体;当被测试动物遗忘了见过的熟悉物体，则动物对环境中没有见过的新物体和见过的熟悉物体的探究时间应基本相同。

四、实验结果：

如图3. sham组小鼠在测试期对新旧两个物体的探索时间明显不同，对新物体的探索时间较旧物体明显增多。腹腔注射生理盐水2周后再进行CLP处理的小鼠在测试期对新旧两物体的探索时间无差异。腹腔注射过各个浓度梯度的SAM2周后再进行CLP处理的小鼠在测试期对新物体的探索时间较旧物体明显增加。此实验结果证明经过SAM的预防处理可以改善SAE小鼠的认知障碍。

实施例5：Elisa检测脑组织皮层及海马部位TNF-α：

一、实验准备：各实验组经过实例1的小鼠，按照0.01ml/g腹腔注射40%水合氯醛。

二、实验步骤:

1.注射水合氯醛10分钟后，灌注小鼠，取脑组织，取脑组织的皮层及海马部位。

2.制备样品：取出组织后加入裂解液进行匀浆处理。

3.按照TNF-α因子盒的说明书进行包板、加样、加抗体、显色、终止反应等操作。

4.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值。

三、实验结果：

如图4.TNF-α等炎症因子在SAE早期会大幅升高，如图4A所示，经过CLP手术处理后小鼠的较未进行CLP处理的sham组小鼠的皮层部位的TNF-α明显升高。但是经过腹腔注射各浓度梯度的SAM处理后小鼠，在CLP术后早期TNF-α较注射生理盐水后进行CLP组的小鼠有降低。如图4B所示，经过CLP手术处理后小鼠的较未进行CLP处理的sham组小鼠的大脑海马部位的TNF-α明显升高。但是经过腹腔注射各浓度梯度的SAM处理后小鼠，在CLP术后早期TNF-α较注射生理盐水后进行CLP组的小鼠有降低。此结果证明经过SAM的预防处理，SAE早期的炎症因子可以下降。

Claims (1)

1.S-腺苷甲硫氨酸在制备预防脓毒血症相关性脑病药物中的应用。