CN105483164B - 一种自由控制丙丁梭菌abe发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法 - Google Patents

一种自由控制丙丁梭菌abe发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法，通过调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20‑60g/L；当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期后3‑5h或pH触底反弹回升0.2‑0.3以后，控制葡萄糖浓度在接近于0‑3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。使用本发明提供的方法，可以调节丙酮/丁醇比为0.6‑1.02之间、丙酮浓度7.34g/L‑11.74g/L在之间，最大丙酮浓度和丙酮/丁醇比是所见研究报道和相关专利的最高水平，为实现利用生物质原料替代化石原料合成丙酮、自由调控ABE发酵的丙酮/丁醇比、实现ABE发酵产品的多样化提供了参考，对ABE发酵具有重要指导意义。

Description

一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的 方法
技术领域
本发明涉及一种提高和自由控制ABE发酵丙酮/丁醇比的方法，尤其是利用丙丁梭菌生产丙酮和丁醇、强化生物丙酮合成的新型发酵方法，属于生物技术领域。
背景技术
丁醇和丙酮都是重要的平台化合物，在化工、塑料、医药、有机合成、涂料和印染等行业具有广泛用途。同时，生物丁醇是一种极具潜力、清洁可再生的新型液态燃料，可作为化石燃料的替代品；而丙酮则是优良的柴油助燃剂，它可以提高柴油的燃烧性能、减少有害气体(NOX、SOX等)的排放，环境效益明显(Wu H,Nithyanandan K,Zhang J,et al.Impactsof acetone-butanol-ethanol(ABE)ratio on spray and combustion characteristicsofABE-diesel blends.Appl.Energy,2015,149:367-378)。发展生物燃料和高效燃料添加剂已成为世界各国应对能源危机、减少温室气体排放、改善气候环境的重要措施。丙酮-丁醇-丁醇发酵也称为ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵，其主产品是丁醇，丙酮是主要副产品，发酵产物中的丁醇/丙酮/乙醇的摩尔比率大约为6:3:1(质量比约为67:26:7)。目前，人们更为看中的是丁醇发酵生产，几乎所有研究都集中在高效生产丁醇、抑制丙酮合成，增加丁醇在总溶剂中所占有的比率(等同于降低丙酮/丁醇比)，提高原料对丁醇的转化率等方面。
2014年，我国丙酮消费量达130万吨，年增加率逾10％。目前，由于没有专一性发酵生产丙酮的微生物菌株，丙酮基本上完全(90％以上)依靠不可再生的、化石原料合成生产，其可持续发展和碳排放存在很大问题。ABE发酵可以生产少量丙酮，但是，多年来，丙酮生物合成并不受重视。其原因在于：1)发酵浓度太低(一般只有5g/L左右)；2)与主产品(丁醇)抢夺发酵原料、降低原料的目标转化率。但是，即便丙酮发酵浓度很低，它毕竟也是一个副产品、而不能简单地抛弃，其产量仍旧要统计到ABE发酵的原料利用报表中去。目前，发酵法生产丙酮仍利用传统丙丁发酵菌种(丙丁梭菌、拜式梭菌、糖型梭菌等)进行，生产效率低。生命周期评价(life cycle assessment，LCA)法是一种对多重产品生产过程进行经济评价的有效方法。它通过对某一过程的产品多样性、产品价格、温室气体排放，以及生产原料的物性和能量特征进行评估，找出过程经济性、环境效益和产品多样性的最佳切入点，从而实现生产过程性能的整体最优。有研究报道指出，ABE发酵的LCA和经济性依赖于将丙酮作为重要平台化合物和高效清洁燃料添加剂的评价(KA,Rühl J,Blank L M,etal.Integration ofbiocatalyst and process engineering for sustainable andefficient n-butanol production.Eng.Life Sci.,2015,15:4-19)。实际上，侧重LCA的ABE发酵实际上等同于同时强化丙酮和丁醇的合成、并最大可能地提高丙酮/丁醇质量比。
传统丙丁梭菌实际上也具备高产丙酮的能力。但是，由于ABE发酵存在严重的丁醇产物抑制，一旦丙丁梭菌间歇式ABE发酵开始，丁醇浓度迅速上升，在较短时间内(40-50h)达到抑制浓度，丙丁梭菌的产丙酮的能力无法得到体现。一般情况下，最终丁醇浓度和丙酮浓度分别停留在12-13g/L和5-6g/L左右的水平。使用高效丁醇原位萃取剂-油醇，选择性地将丁醇萃取到油醇中、控制发酵液相中的丁醇浓度于低水平，发酵液相中的丙酮浓度甚至可以积累到15g/L左右的高水平(数据未公开)。但是，由于高效丁醇原位萃取剂(油醇)价格昂贵、原位萃取体系操作难度大，实用上存在很大问题，现在丁醇和丙酮生物合成的主流依旧是间歇发酵。与丁醇及其合成相比，丙酮及其合成具有截然不同的特征：丙酮合成不需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的参与，对细胞的能量供给压力小；丙酮对细胞的毒害作用小、提高其发酵浓度不会影响溶剂生产效率；丙酮沸点低、蒸馏精制相对容易、精制纯化成本低。因此，从以下几个方面考虑对ABE发酵过程实施调控，提高生物丙酮的生产效率、提高或控制丙酮/丁醇比，从强化丙酮合成的角度改善ABE发酵的总体性能是可行的：1)通过环境胁迫，强化丙丁梭菌(C.acetobutylicum)对于高丁醇浓度环境的耐受能力(Luo H Z,GeL B,Zhang J S,et al.Enhancing butanol production under the stressenvironments of co-culturing Clostridium acetobutylicum/Saccharomycescerevisiae integrated with exogenous butyrate addition,PLoS ONE,2015,10(10):e0141160)；2)通过适度降低梭菌胞内的NADH再生速度，改变梭菌胞内碳代谢流的分配、使较多的碳流走向丙酮合成途径，降低细胞的能量供给压力、使得ABE发酵以高效的NADH再生模式运转(Luo H Z,Ge L B,Zhang J S,etal.Enhancing acetone biosynthesis andacetone-butanol-ethanol fermentation performance by co-culturing Clostridiumacetobutylicum/Saccharomyces cerevisiae integrated with exogenous acetateaddition.Bioresour.Technol.,2016,200:43-51)；3)控制发酵体系的还原糖浓度于低水平、弱化梭菌糖酵解主路的碳代谢速度，进而限制NADH的生成，为高丙酮/丁醇比率的形成创造条件；4)外添乙酸作为共同碳源、维持胞内乙酸浓度于较高水平，提高催化丙酮合成的辅酶A转移酶(CoAT)的活性(Chen C K,Blaschek H P.Effect of acetate on molecularand physiological aspects of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052solventproduction and strain degeneration.Appl.Environ.Microbiol.,1999,65:499-505)，进而强化ABE整体代谢网络中的丙酮合成途径。
在申请人前期的研究中，申请人发现，在丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养的操作模式下、外添少量乙酸可以在维持甚至提高ABE发酵丁醇浓度的同时，较大幅度地提升丙酮的合成强度和效率。与传统ABE发酵(对照组；丙酮质量浓度约5.0g/L，丙酮/丁醇比0.50)相比，外添化学合成乙酸时，丙酮质量浓度和丙酮/丁醇(质量)比分别达到8.27g/L和0.59，增幅分别为41.1％和18.0％；外添廉价的乙酸发酵上清液时，相应的发酵指标达到8.55g/L和0.60，增幅分别为46.0％和20.0％，发酵原料成本降低、丙酮发酵生产的可行性提高。发酵性能改善的原因在于：1)该发酵控制策略可刺激有利于梭菌生存和丁醇合成的4种氨基酸的胞内分泌，提高了梭菌对高丁醇浓度环境的耐受能力；可以在保证丁醇正常合成的前提下，适度抑制NADH再生、降低细胞能量周转负担、延缓了梭菌细胞的过早凋亡；可以提高CoAT的活性、适度强化外添乙酸向丙酮的转化，进而改善了ABE发酵性能。
发明内容
本发明的目标是提供一种可以提高和自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮浓度与丙酮/丁醇比的方法。为实现上述目标，本发明采用的技术方案为：在发酵培养基调制过程中，将培养基初始还原糖(葡萄糖)浓度控制在20-60g/L的水平，当发酵进入到产溶剂期pH触底反弹回升0.2-0.3后，控制葡萄糖浓度在接近于0-3.9g/L的低水平，维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束。
丙丁梭菌具有分泌淀粉酶(液化)和糖化酶(糖化)的复杂酶系，当葡萄糖浓度降至接近于0的低水平后，梭菌可以继续分泌糖化酶、维持葡萄糖于低浓度，限制梭菌胞内糖酵解途径的碳代谢和NADH的生成速度。
为了获得更好的效果可以添入乙酸溶液、强化外添乙酸向丙酮的生物转化，形成双底物环境。在能量代谢基本不受破坏、丁醇浓度未达到抑制浓度的条件下，适度抑制丁醇生产、有效地利用乙酸底物，打出时间差、强化丙酮合成。
为了获得更好的技术效果，可以在添入乙酸溶液的基础上，再添加一定量的酿酒酵母，形成丙丁梭菌和酿酒酵母的混合发酵体系，酿酒酵母在严格厌氧环境中仍然可以生存，利用上述混合发酵体系提高梭菌细胞对高丁醇浓度环境的耐受能力，严格控制葡萄糖浓度于低水平，最终提高丙酮浓度和丙酮/丁醇比，维持丁醇产量不变。
乙酸溶液可以使用工业级合成乙酸调配，也可以直接使用乙酸发酵上清液、替代合成乙酸以降低发酵原料成本。通过使用以上调控手段或策略，可将丙酮浓度和丙酮/丁醇比任意控制在5-12g/L和0.5-1.0的水平，并可维持丁醇浓度于10-14g/L的正常水平，充分满足工业ABE发酵对于丙酮/丁醇比的不同需求。由于需要限制还原糖浓度和梭菌胞内糖酵解途径的碳代谢速度，如果需要获取高丙酮浓度和丙酮/丁醇比，发酵时间将略有延长(55-65h vs 50h)。
所述酿酒酵母可选择市售的安琪超级酿酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司。所述丙丁梭菌可选择丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824。所述乙酸生产菌可选择巴氏醋酸杆菌(Acetobacterpasteurianus)ATCC 33445。
在使用丙丁梭菌进行ABE发酵的过程中，如果仅添加乙酸，乙酸溶液添加时间为丙丁梭菌进入产溶剂期pH触底反弹回升0.2-0.3后(发酵开始22-24h左右)。表征为产酸期积累的乙酸和丁酸被逐步消耗，pH逐渐上升。初次乙酸添加量为4.0g/L左右，将乙酸溶液pH调为5.0添入。之后按需要多次(4次)加入乙酸溶液(每次纯乙酸添入量1.5g/L)左右，将乙酸溶液pH调为4.0添入。
如果仅添加酿酒酵母，酿酒酵母的添加时间与乙酸添加时间相同。初次酵母培养液接种量约为1％(v/v，相当于接入约0.20～0.25g-DCW/L-broth的活性酵母)。之后，如果ABE发酵液中的葡萄糖浓度超过1.5g/L，则多次(4次)加入酵母培养液(每次接种量0.5％)。
如果既添加乙酸又加入酿酒酵母，先将乙酸溶液pH调为5.0，酵母培养液接种量为1％，乙酸的添加量为4.0g/L。之后，如果ABE发酵液中的乙酸浓度低于3.0g/L，则多次(4次)加入乙酸溶液(每次纯乙酸添入量1.5g/L，将乙酸溶液pH调为4.0添入)和酵母培养液(每次接种量0.5％)。
本发明采用的发酵培养基为玉米粉酶解培养基，其碳源和氮源的配比最为适量、最易实现发明专利的目标。制备方法为：第一步于95℃环境下加入高温淀粉酶，添加量为8U/g-淀粉，液化45min。第二步将第一步水解得到的酶解液冷却至50～62℃，在50～62℃下添加糖化酶，两步水解结束所得到的玉米酶解液即为ABE发酵培养基。通过调节糖化酶用量、糖化温度和糖化时间，以控制培养基初始葡萄糖浓度于期望水平。糖化酶用量、糖化温度和时间与培养基初始葡萄糖浓度之间的对应关系为：初始葡萄糖浓度60g/L，120U/g-淀粉、温度62℃、反应时间60min；初始葡萄糖浓度35g/L，60U/g-淀粉，温度55℃、反应时间50min；初始葡萄糖浓度20g/L,60U/g-淀粉，温度50℃、反应时间40min。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在25g/L的水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，乙酸总添加量为10g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。发酵50h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为9.15g/L、11.84g/L和0.77。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在60g/L的水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加4次。乙酸总添加量为10g/L。发酵55h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为8.27g/L、13.91g/L和0.60。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在36g/L的水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加4次。乙酸总添加量为10g/L。发酵52h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为9.28g/L、13.44g/L和0.70。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在20g/L的水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加6次。乙酸总添加量为13.0g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。发酵52h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为10.38g/L、11.44g/L和0.91。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在20g/L的水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加6次。乙酸总添加量为13.0g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。如果残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0～1.5g/L的极低水平。发酵64h结束，丙酮和丙酮/丁醇质量比达到11.74g/L和1.02的最高水平，丁醇浓度也维持在11.46g/L的水平。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在60g/L的高水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。使用发酵乙酸上清液(乙酸浓度约80g/L)替代化学合成乙酸，降低发酵原料成本。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加2次，乙酸总添加量为8.0g/L。发酵62h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比达到8.56g/L、14.23g/L和0.60。
在本发明的一种实施方式中，通过调控玉米培养基配制时的糖化酶用量，将培养基的初始葡萄糖浓度控制在20g/L的低水平，在7L罐上进行玉米原料ABE发酵。使用发酵乙酸上清液(乙酸浓度约80g/L)替代化学合成乙酸，降低发酵原料成本。在产溶剂期开始pH触底反弹回升0.2-0.3后，一次性添加乙酸4g/L和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加7次。乙酸总添加量为14.5g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。如果残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0～1.5g/L的极低水平。发酵60h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比达到10.52g/L、13.58g/L和0.76的水平。
在5L通气发酵罐中获取活性酿酒酵母培养液。培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母抽提物8.5g/L，硫酸铵1.3g/L，七水硫酸镁0.1g/L，二水氯化钙0.06g/L。培养开始15h、葡萄糖耗尽后，利用DO-Stat法流加50％(w/v)高浓葡萄糖。向ABE发酵液添加活性酿酒酵母时，培养液OD600达到80～90、折合细胞干重20.0～22.5g-DCW，pH为5.5～6.0。
在5L通气发酵罐中获取乙酸发酵上清液。使用巴氏醋杆菌ATCC 33445为发酵菌种。培养基配方为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，无水硫酸镁0.4g/L，乙酸10g/L，乙醇40g/L。发酵开始40h、乙醇耗尽后、手动添加高浓度乙醇，发酵约在90h结束。离心、过滤分离得到乙酸发酵上清液，其中乙酸含量约为80g/L，置4℃冰箱保藏待用。
本发明的工艺原理：1)丙丁梭菌具有分泌淀粉酶和糖化酶的复杂酶系。梭菌首先利用培养基中的葡萄糖，当葡萄糖浓度降至接近于0的水平后，梭菌可以继续分泌糖化酶、不断分解淀粉糊化后得到的寡糖，并将葡萄糖维持在低浓度，这限制了梭菌胞内糖酵解途径的碳代谢和NADH的生成速度。2)葡萄糖浓度受限环境可以诱导丙丁梭菌分泌糖化酶的能力，提高糖化酶活力，有利于淀粉/寡糖的持续分解、减少糖化酶用量和发酵原料成本。3)在葡萄糖浓度和梭菌胞内糖酵解途径受限的条件下，添入乙酸溶液、可以强化外添乙酸向丙酮的生物转化，形成双底物环境。在能量代谢基本不受破坏、丁醇浓度未达到抑制浓度的条件下，利用丙酮合成不需要还原力NADH的特点，可以强化丙酮合成、适度抑制丁醇生产。4)外添乙酸本身就可以降低ABE发酵梭菌胞内的NADH再生速度，营造出有利于丙酮合成的低还原力环境。5)酿酒酵母的正常培养温度为29～31℃、兼性厌氧，丙丁梭菌的培养温度为37℃、偏性(严格)厌氧。在酿酒酵母生存恶劣环境(高丁醇浓度、高乙酸浓度、高温、葡萄糖浓度受限，等)下，酵母自身会产生一系列抵抗因子热休克蛋白、氨基酸、甘油等以维持自身的生存，而酵母所分泌的氨基酸有利于丙丁梭菌的生存和丁醇合成。同时添加酵母和乙酸后，芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)和天冬氨酸族氨基酸(赖氨酸和蛋氨酸)的大量、不断地积累，提高了丙丁梭菌对高丁醇浓度的耐受能力。6)活性酿酒酵母利用葡萄糖的能力较强，按照需要连续间歇式添加酿酒酵母培养液，可以将葡萄糖浓度严格控制在极低水平，进一步限制梭菌胞内糖酵解途径的碳代谢和NADH的生成速度。上述因素的共同作用最终导致丙酮浓度和丙酮/丁醇比的大幅提高，丙酮/丁醇比自由可控。具体而言，各个可操作因子的主要功能如下：限制培养基中初始葡萄糖浓度可以限制梭菌胞内糖酵解途径的碳代谢速度和NADH合成速度，间接限制丁醇的合成速度；添加乙酸是为了提高催化丙酮合成的辅酶A转移酶(CoAT)的活性，以乙酸为第二碳源、强化丙酮合成，经初步测算，外添合成乙酸时、有72-89％的乙酸可以转化成丙酮；添加活性酵母是为了进一步降低葡萄糖浓度、限制NADH合成，与乙酸一起、进一步提高梭菌抵御高丁醇浓度恶劣环境的能力。混菌培养耦联乙酸外添的ABE发酵体系可以按照碳和NADH平衡的原则，通过改变培养基配制条件和发酵环境条件，自由调节发酵参数α和β的比例。其中，α是根据NADH的平衡计算得到的，而β则是根据葡萄糖、丙酮、乙酸之间的碳摩尔平衡，以及α值计算得到的。不同操作条件下，电子穿梭传递系统对NADH的贡献率α变化不大，基本在0.1-0.2的范围内徘徊(附表1-B)。使用化学合成乙酸时，无论其填加量多少，β也大致在0.72-0.89的范围内波动(附表1-B)，表明外添乙酸的绝大部分可以转化为丙酮，这就是丙酮浓度和丙酮/丁醇比率得以提高的直接原因。本工艺的优点：本发明针对尚无专一性发酵生产丙酮的微生物菌株，丙酮基本上完全依靠不可再生的、化石原料合成生产，其可持续发展和碳排放存在问题的现状，使用丙丁梭菌和玉米原料、传统ABE发酵中丙酮/丁醇质量比低(约0.5)、丁醇产物抑制严重等问题，通过调控玉米培养基的初始葡萄糖浓度，结合使用丙丁梭菌/酿酒酵母形成的复杂混菌发酵体系和外添乙酸的操作策略，可以大幅提高ABE发酵中的丙酮浓度和丙酮/丁醇比，效果显著明显。使用基因工程菌进行ABE发酵是改善ABE发酵性能的另一选择。但是，工程菌普遍存在遗传性能不稳定、丙酮/丁醇比无法按照需要任意调控的问题。本工艺使用遗传性能稳定的野生丙丁梭菌、避免了菌种退化的问题；通过改变ABE发酵培养基调制过程的操作条件和ABE发酵环境，可以按照需要任意调控丙酮/丁醇比，使得ABE发酵过程更具有产品多样性、供需灵活性和实用能力；工艺实施简单易行，减少了糖化酶用量、缩短了糖化反应时间、降低了培养基调制过程的操作成本；双底物(葡萄糖/乙酸)ABE发酵还可以通过使用乙酸发酵上清液直接进行，有利于降低发酵原料成本。另外，我国是食醋和白酒生产消费大国，但是，我国食醋和白酒销售市场鱼目混珠、假冒伪劣产品充斥市场。充分利用下架的劣质食醋生产有用的化工和生物能源产品，利用劣质白酒生产丙酮丁醇发酵的第二底物-乙酸，可以消化和有效利用伪劣产品、促进社会和经济的可持续发展。
附图说明
图1丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养耦联外添乙酸体系的代谢简图。
图2具有代表性的、后述的实施例#1、#2、#6、#7和#10的发酵曲线。A)丙酮浓度；B)丁醇浓度；C)丙酮/丁醇比；D)残留葡萄糖浓度；E)总糖浓度；F)总糖消耗速度；G)乙酸浓度；H)糖化酶活性；I)pH。
A-H:不同发酵模式下ABE发酵曲线，I：不同发酵模式下pH变化曲线(─：批次#1；…：批次#2；─：批次#6；---：批次#7；─：批次#10)
○：传统发酵，G0＝60g/L，批次#1；
■：传统发酵，G0＝20g/L，批次#2；
▲：外添乙酸，G0＝20g/L，批次#6；
□：共混培养+外添乙酸，G0＝60g/L，批次#7；
●：共混培养+外添乙酸，G0＝20g/L，批次#10。
注：G0代表初始葡萄糖浓度。
具体实施方式
实施例1玉米丁醇传统发酵-I(对照1)
菌株活化：将保藏于4℃冰箱的丙丁梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)接种于5％(w/v)的玉米醪种子培养基中，用真空泵除空气后于37℃水浴锅中静态培养27h作为发酵种菌。其中，玉米醪种子培养基的制备过程如下：称取25g玉米粉溶于2L水中，在沸水中高温糊化处理直至玉米醪溶液体积为500mL，此即为5％(w/v)的玉米种子培养基，灭菌条件为121℃、50min。
发酵培养基为15％(w/v)玉米粉的双酶水解液，制备过程为：第一步于95℃环境下加入高温淀粉酶，添加量为8U/g-淀粉，液化45min；第二步将第一步水解得到的酶解液冷却至62℃，于62℃条件下添加糖化酶，添加量为120U/g-淀粉，糖化60min；两步水解结束所得到的玉米酶解液即为丁醇发酵培养基。此时，所用玉米粉中的淀粉含量约为60％(w/v)，玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为60g/L。
发酵在7L厌氧静态(可按需要短时搅拌)发酵罐进行。初始装液量3.5L，在121℃下高压蒸汽灭菌30min；为保证发酵罐中的厌氧环境，在接种前向发酵培养基内通入N2，持续30min；以发酵罐自带的温控系统控制发酵温度于37℃进行接种，接种量为10％(v/v)，继续通入N2使发酵罐内压力在0.04–0.045MPa，发酵开始、自产气发生后，停止通气，开始发酵；每1h测量产气量，在发酵过程中适时取样，直至发酵结束。
发酵罐在线参数的测定：ORP、pH通过ORP、pH电极在线测定；产气量的测定：利用排水法和NaOH吸收CO2法测定发酵过程中气体(H2和CO2)的生成量；产物的测定：丙酮、丁醇、乙醇、乙酸和丁酸通过气相色谱GC测定。
由表1可知，发酵(对照1)65h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为5.86g/L、11.63g/L和0.50。
实施例2玉米丁醇传统发酵-II(对照2)
实施例2中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。减少并控制ABE发酵培养基调制时的糖化酶用量、反应温度和时间，添加量为60U/g-淀粉、糖化温度50℃、反应时间40min；此时，玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为20g/L。ABE发酵后期(约30h)，葡萄糖耗尽后，梭菌自动释放糖化酶水解培养基中的寡糖，将葡萄糖浓度控制低水平(0～4g/L)，刻意限制糖酵解途径碳代谢速度和NADH生成速度。发酵50h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为4.25g/L、7.67g/L和0.55。
实施例3单一添加酿酒酵母-I
实施例3中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为60g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.2)，用3mol/L的氢氧化钠溶液上调丁醇发酵液pH至5.0，再向发酵液中一次性添加1％(v/v)的酿酒酵母培养液，酵母培养液OD600为80～90、、折合细胞干重20.0～22.5g-DCW，pH为5.5～6.0。发酵53h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为5.36g/L、11.91g/L和0.45。
实施例4单一添加酿酒酵母-II
实施例4中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为20g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.3)，一次性添加1％(v/v)的酿酒酵母培养液。之后，如果残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0～1.5g/L的极低水平。发酵56h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为5.23g/L、9.53g/L和0.55。
实施例5单一添加乙酸-I
实施例5中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为60g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.2)，开始脉冲式添加乙酸溶液(pH 4.0)。每隔3h进行一次有机酸的添加，每次添加以pH下降0.1为止。并记录下添加前后的天平读数，用以计算有机酸的添加量。添加过程伴随轻微搅拌(搅拌桨转速为100r/min)，使加入的有机酸溶液和发酵液迅速混匀，保证发酵液各部分pH均一，添加过程结束后关闭搅拌，乙酸添加总量为4g/L。发酵50h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为7.34g/L、12.18g/L和0.60。
实施例6单一添加乙酸-II
实施例6中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为25g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.2)，一次性添加乙酸4g/L(乙酸溶液pH调节到5.0)。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，乙酸总添加量为10g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。发酵50h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为9.15g/L、11.84g/L和0.77。
实施例7高初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸
实施例7中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为60g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.3)，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(pH4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加4次。乙酸总添加量为10g/L。发酵55h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为8.27g/L、13.91g/L和0.60。发酵结束前10h，还原糖浓度降到接近于0的低水平，整个发酵过程中，葡萄糖浓度基本没有得到限制。
实施例8中初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸
实施例8中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为36g/L。当发酵进行至22h时(pH触底反弹回升0.2)，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(pH4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加4次。乙酸总添加量为10g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。发酵52h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为9.28g/L、13.44g/L和0.70，残留乙酸浓度1.54g/L。发酵进入产溶剂期、初次添加乙酸和酿酒酵母10h后(发酵32h)，还原糖浓度基本降到接近于0的低水平(0～3.9g/L)，产溶剂期后段，葡萄糖浓度得到有效限制。
实施例9低初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸-I
实施例9中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为20g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.3)，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(pH4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加6次。乙酸总添加量为13g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。发酵52h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为10.38g/L、11.44g/L和0.91，残留乙酸浓度2.92g/L。发酵进入产溶剂期、初次添加乙酸和酿酒酵母4h后(发酵28h)，还原糖浓度基本降到接近于0的低水平(0～2.5g/L)。整个产溶剂期，葡萄糖浓度得到有效限制。
实施例10低初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸-II
实施例10中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为20g/L。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.2)，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(pH4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加6次。乙酸总添加量为13.0g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。如果残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0～1.5g/L的极低水平。发酵64h结束，丙酮和丙酮/丁醇质量比达到11.74g/L和1.02的最高水平，丁醇浓度也达到11.46g/L的较高水平。整个产溶剂期，葡萄糖浓度得到有效限制。
实施例11高初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸发酵上清液
实施例11中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为60g/L。使用发酵乙酸上清液(乙酸浓度约75g/L)替代化学合成乙酸，降低发酵原料成本。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.3)，一次性添加乙酸4g/L(pH5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(乙酸溶液pH调节到4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加2次，乙酸总添加量为8.0g/L。发酵62h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比达到8.56g/L、14.23g/L和0.60。
实施例12低初始还原糖浓度条件下、共混添加酿酒酵母和乙酸-III
实施例12中菌株活化、发酵条件和测定方法均与实施例1相同。玉米培养基中初始还原糖(葡萄糖)浓度为20g/L。使用发酵乙酸上清液(乙酸浓度约75g/L)替代化学合成乙酸。当发酵进行至24h时(pH触底反弹回升0.2)，一次性添加乙酸4g/L(pH 5.0)和1％(v/v)的酿酒酵母。之后，每间隔约5h间歇式添加乙酸溶液一次(pH 4.0)、纯乙酸量1.5g/L，共添加7次。乙酸总添加量为14.5g/L，形成乙酸/葡萄糖双底物体系。如果残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0～1.5g/L的极低水平。发酵60h结束，丙酮和丁醇浓度、丙酮/丁醇质量比分别为10.52g/L、13.58g/L和0.77，乙酸基本耗尽。发酵进入产溶剂期、初次添加乙酸和酿酒酵母后，还原糖浓度基本降到接近于0的低水平。整个产溶剂期，葡萄糖浓度得到有效限制。不同于使用化学合成乙酸，此时丙酮浓度的提升幅度略小、但丁醇浓度却有较大幅度的提升，最大丙酮/丁醇比只能达到约0.8的水平。如附表1-B所示，添加乙酸发酵上清液时，外添乙酸走向丙酮合成途径的比例β较小，即便将初始葡萄糖浓度控制在20g/L的低水平，β也只有49％，较多的乙酸走向了丁醇合成途径。这是乙酸发酵上清液未知杂质较多、其中的乙酸较难被梭菌吸收利用，梭菌偏好利用葡萄糖、NADH产生量较多，间接促进了丁醇合成的缘故。相比于使用合成乙酸的发酵批次(#9和#10)，梭菌的总糖利用量高出约17％-25％(附表1-B)。尽管如此，即便使用乙酸发酵上清液，限制葡萄糖浓度、使用葡萄糖/乙酸双底物的发酵调控策略也对自由控制或提高丙丁梭菌ABE发酵的丙酮浓度和丙酮/丁醇比具有普适效果；直接使用廉价乙酸发酵上清液替代合成乙酸也大大降低了发酵原料成本。
表1不同发酵操作模式下的ABE发酵性能比较
表1-A不同操作模式下ABE发酵性能的比较
表1-B不同操作模式下的电子穿梭传递系统的电子走向NADH系数α和乙酸走向丙酮合成的比例β
发酵模式 批次 总糖耗量 梭菌糖耗量(g/L) 乙酸耗量(g/L) α 1-γ β
传统，G<sub>0</sub>＝60g/L #1 51.30 51.30 0.00 0.20 1.0 0.00
传统，G<sub>0</sub>＝20g/L #2 38.00 38.00 0.00 0.06 1.0 0.00
混菌，G<sub>0</sub>＝60g/L #3 71.30 57.00 0.00 0.13 0.2 0.00
混菌，G<sub>0</sub>＝20g/L #4 50.00 43.97 0.00 0.12 0.2 0.00
乙酸，G<sub>0</sub>＝60g/L #5 57.50 57.50 2.84 0.15 1.0 0.89
乙酸，G<sub>0</sub>＝25g/L #6 51.00 51.00 8.52 0.27 1.0 0.86
混菌+乙酸，G<sub>0</sub>＝60g/L #7 70.40 66.50 3.32 0.14 0.6 0.76
混菌+乙酸，G<sub>0</sub>＝36g/L #8 68.00 64.90 8.46 0.15 0.6 0.48
混菌+乙酸-I，G<sub>0</sub>＝20g/L #9 55.50 53.10 10.08 0.18 0.6 0.72
混菌+乙酸-II，G<sub>0</sub>＝20g/L #10 59.50 56.58 10.29 0.14 0.6 0.76
混菌+乙酸上清，G<sub>0</sub>＝60g/L #11 74.00 70.80 5.47 0.07 0.6 0.31
混菌+乙酸上清，G<sub>0</sub>＝20g/L #12 70.50 66.46 11.82 0.18 0.6 0.49
注：G0代表初始葡萄糖浓度。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种自由控制丙丁梭菌ABE发酵丙酮产量与丙酮/丁醇比的方法，其特征在于，调整发酵培养基初始葡萄糖浓度在20g/L；当丙丁梭菌ABE发酵进入到溶剂生产期pH触底反弹回升0.2-0.3后，控制葡萄糖浓度在低水平，维持ABE厌氧发酵条件直至发酵结束；所述溶剂生产期控制葡萄糖浓度的方法为在发酵液中一次性添加4g/L的pH为5.0的乙酸和1％(v/v)的酿酒酵母后，每间隔5h间歇式添加1.5g/L的pH为4.0乙酸溶液一次，共添加6次，将葡萄糖浓度严格控制在0.0-2.5g/L的低水平；或所述溶剂生产期控制葡萄糖浓度的方法为一次性添加4g/L的pH为5.0的乙酸和1％(v/v)的酿酒酵母后，每间隔5h间歇式添加1.5g/L的pH为4.0乙酸溶液一次，共添加6次，期间，若残留葡萄糖浓度超过1.5g/L，继续间歇式添加0.5％(v/v)的酿酒酵母培养液，将葡萄糖浓度严格控制在0.0-1.5g/L的低水平。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为玉米粉酶解培养基。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，获得所述酿酒酵母培养液，采用的培养基配方为：葡萄糖20g/L，酵母抽提物8.5g/L，硫酸铵1.3g/L，七水硫酸镁0.1g/L，二水氯化钙0.06g/L；将酿酒酵母在5L通气搅拌发酵罐上、利用上述培养基中培养；葡萄糖耗尽后、利用DO-Stat法流加50％(w/v)高浓葡萄糖。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，获得乙酸发酵上清液：使用巴氏醋杆菌ATCC33445为发酵菌种；培养基配方为，葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，无水硫酸镁0.4g/L，乙酸10g/L，乙醇40g/L；将醋杆菌在5L通气搅拌发酵罐上、利用上述培养基中培养；乙醇耗尽后、手动添加高浓度乙醇；发酵上清液中的乙酸含量80g/L。
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丙丁梭菌/酿酒酵母混合培养耦联乙酸外添强化丙酮合成-侧重LCA的ABE发酵;陈锐等;《精细化工》;20151130;第32卷(第11期);第1223页左栏第3段、右栏第1段、第1.1节、第1.2节、第1.3.2节，第1224页左栏第1.3.3节、第1.3.4节，第1229页左栏第3节
乙、丁酸添加条件下丁醇发酵图论模型的构建;李志刚等;《中国生物工程杂志》;20141231;第34卷(第4期);第46-52页

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