CN105456306A - 藤石松提取物在制备抗菌消炎天然药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种藤石松提取物在制备抗菌消炎天然药物中的应用，本发明采用管碟法对藤石松的超纯水提取液进行了抑菌活性的研究，发现藤石松水提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气大肠杆菌的抑制效果较强，说明藤石松水提取液中含有对细菌具有抑制作用的活性成分，是筛选、开发植物源杀菌剂的前提和基础，为制备抗菌消炎天然药物提供了依据。
Description
技术领域
本发明涉及藤石松功能研究领域，具体涉及藤石松活性成分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气大肠杆菌的抑制作用，同时涉及藤石松活性成分在抗菌消炎天然药物中的作用。
背景技术
植物是生物活性化合物的巨大天然宝库，据统计，地球上的植物至少有50万种，其中许多植物具有抑菌或杀菌作用。我国植物资源丰富，植物的次生代谢产物已超过40万种，并且还具有对环境兼容性好等特点，从中发现活性强的植物源杀菌剂是当今药物研究的一个重要课题，也是现代抗菌药物的发展方向之一。植物次生代谢产物是植物在长期协同进化过程中，通过次生代谢途径产生的能抵御病虫害侵入、抑制其他物种生长，从而在竞争生长过程中处于相对有利地位的化学物质，而其成分天然，经过长期的衍化，可以进入天然能量代谢系统，毒性低，对环境污染小。
近年来抗生素和化学合成药物广泛应用于人类疾病、养殖和种植等多方面的防治，效果非常显著，但长期大量使用会使细菌产生耐药性，而且其本身具有毒副作用，对人类生存和环境造成威胁。中草药是我国特有的中医药理论与实践的产物，因具有药用、保健、营养无副作用等功效，并具有低毒、低残留、耐药性发生率低和资源丰富等多种因素，而愈来愈受国内外研究者的重视。
目前国内外对植物抑菌的研究研究非常活跃。藤石松(LycopodiumjaponicumThunb)，多年生攀援草本，长可达4m。主茎下部有叶疏生，叶钻状披针形，先端长渐尖，膜质，灰白色，向上的叶较小，绿色，厚革质，有早落的膜质尖尾。藤石松为石松科植物石松的干燥全草。性味微甜、辛、温、无毒，归肝、脾、肾经，有祛风除湿、舒筋活络等多种功效，主要用于治疗关节酸痛、屈伸不利等症。其临床应用历史悠久，疗效确切，全国大部分地区都盛产，资源丰富。作为一味重要的中药，人们越来越关注藤石松的各方面性能，对其进行了大量研究，但关于藤石松提取物的抗菌特异效果，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，通过藤石松提取物对细菌抑制作用的研究，而提供一种藤石松提取物的应用。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种藤石松提取物在抑制细菌中的应用，其中，所述藤石松提取物为藤石松的水提取液；所述细菌为制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或产气大肠杆菌。
本发明同时提供一种藤石松提取物在制备抗菌消炎天然药物中的应用，其中，所述藤石松提取物为藤石松的水提取液，所述菌是指金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或产气大肠杆菌。
上述提及的藤石松的水提取液是取干燥的藤石松粉碎，按1g藤石松干粉加20-35ml超纯水的比例，于藤石松粉中加入超纯水，浸泡2-4h后，先于100℃加热30min，再于60-90℃加热1-2h，离心过滤，得上清液，残渣再按1g残渣加25ml超纯水的比例加入超纯水，于100℃加热30-60min，离心过滤，合并滤液，提取液再加热浓缩至浓度为0.25-0.75g/ml。
上述藤石松的水提取液使用前先于120℃灭菌30min或采用22微米微孔无菌过滤器除菌。
本发明采用管碟法测定藤石松提取液的抑菌效果，发现藤石松水提取液具有较高的抑菌效果，尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及产气大肠杆菌抑菌效果明显，说明藤石松中含有对细菌具有抑制作用的物质，是筛选、开发植物源杀菌剂的前提和基础，为制备抗菌消炎天然药物提供了依据。
具体实施方式
1.实验器材
供试菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli)，金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)，产气大肠杆菌(coli-aerogenesgroup),为武汉国家菌种中心购买。
供试植物：藤石松(LycopodiumjaponicumThunb)。
实验仪器：数显恒温水浴器(HH-4)国华电器；气浴恒温摇床(THZ-820)国旺仪器；冰箱(容声BCD-185DKA)；超净工作台(SW-CJ-1FD)苏净安泰；生化培养箱(SPX-250B-Z)上海博讯实业有限公司；立式压力蒸汽灭菌器(LS-50HJ)江阴滨江医疗设备有限公司；超纯水器(UPWS-I-10T)杭州永洁达净化有限公司；水浴式电磁炉(GCA16)珠海格力小家电有限公司等。
LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、pH值7.0、加无菌水至1000ml。
LB固体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g、琼脂15-20g、pH值7.0、加无菌水至1000ml。
2.实验方法
2.1制备中药提取物
藤石松水提液的制备：称取藤石松干品20g，绞碎后置电磁炉(GCA16)中，加超纯水500ml，浸泡4h后，先于100℃加热30min，再于70℃加热1小时，离心过滤，得上清液，残渣再加500ml水于100℃加热30min，离心过滤，合并滤液，加热浓缩至浓度为0.5g/ml。水提液置立式压力蒸汽灭菌器(LS-50HJ)中高温高压(120℃，30min)灭菌后放入超净工作台备用。
藤石松醇提液的制备：称取藤石松干品5g，绞碎后置带塞广口瓶中，加入75％乙醇100ml浸泡48h，经过滤离心，滤液用旋转蒸发仪浓缩至5ml(浓度为1g/ml)，醇提液经微孔滤膜(0.22μm)除菌后放入超净工作台备用。
2.2菌悬液的制备
用平板画线法将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气大肠杆菌分别接种于LB固体培养基上，用封口膜封好，37℃置生化培养箱中培养24h活化细菌，活化后，用接种环挑取同一菌落的细菌，接种于装有LB液体培养基的试管内，然后置于气浴恒温摇床中37℃培养48h，得三种菌的菌悬液，以用作实验菌种。
3.抑菌试验
3.1提取物抑菌效果的测定
采用管碟法。将实验菌种摇匀，用移液枪移取50ul菌悬液于制好的琼脂平板上，平铺涂匀，3种实验菌，每种涂10个平板；然后将已灭菌的牛津杯等间距置于琼脂表面上，每皿4个，全部排好之后，在超净台上静放10分钟。用1ml灭菌移液枪吸取藤石松水提取液200ul，注入摆好的牛津杯中，每皿中3个牛津杯注入水提取液，另一牛津杯注入灭菌的超纯水200ul作对照，然后用封口膜小心的封好。一种细菌做一个平板，共得3个水提药平板。同样，醇提液也是如此(以75％乙醇100ml浓缩至5ml为对照液)。之后置于37℃生化培养箱内培养24h，观察培养皿内的细菌生长情况，并用千分尺测量抑菌圈的直径，每一培养皿中三个药物的抑菌圈效果取平均值，并且数据精确到小数点后一位，结果见下表1。
表1藤石松提取液的抑菌效果(单位：mm)
| 金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | 产气大肠杆菌 | |
| 藤石松水提取液 | 14.8 | 13.9 | 14.1 |
| 超纯水对照 | 8.3 | 8.3 | 8.3 |
| 藤石松醇提取液 | 10.3 | 9.5 | 9.3 |
| 乙醇对照 | 9.2 | 9.2 | 9.2 |
由表1中结果可知，藤石松水提取液的抑菌效果很好，对三种细菌的抑菌作用都很明显，且效果几乎相同；而藤石松醇提液对金黄色葡萄球菌略有抑制效果，对大肠杆菌和产气大肠肝菌无抑制效果或抑制效果不明显。
3.2不同浓度提取液对抑菌作用影响的测定
采用管碟法。以前面2.1节中制备的提取液作为100％原液，无菌水2倍法稀释，得1：2、1：4、和1：8浓度提取液系列。由于两种方法的提取液对细菌的抑制效果各有不同，分别选取了两种抑制效果比较明显的提取液做稀释实验。每一系列都分别接菌并作对照，摆好牛津杯并注入等体积药物，置37℃恒培养24h，再测定抑菌圈的大小并记录，与对照比较抑菌效果,有效果记为“+”，没有效果记为“-”，结果见下表2。
表2藤石松提取液稀释后的抑菌效果(单位：mm)
| 藤石松提取液 | 金黄色葡萄球菌 | 大肠杆菌 | 产气大肠杆菌 |
| 水提液(1:2) | + | + | + |
| 水提液(1:4) | + | + | + |
| 水提液(1:8) | ﹣ | ﹣ | ﹣ |
| 醇提液(1:2) | + | + | + |
| 醇提液(1:4) | + | ﹣ | ﹣ |
| 醇提液(1:8) | ﹣ | ﹣ | ﹣ |
由上表可知，藤石松提取液要想发挥抑菌效果，需要控制一定浓度，浓度太低会导致其抑菌作用无法发挥而使得误认为没有抑菌效果。同时也可以看出，同一种提取液对几种细菌的抑制作用大致相同，可见是提取液中含有的某种或多种物质对细菌的生长、繁殖或其本身组织的一个共同特征作用所发挥的抑菌效果。
Claims (5)
1.一种藤石松提取物在抑制细菌中的应用，其中，所述藤石松提取物为藤石松的水提取液，该细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或产气大肠杆菌。
2.一种藤石松提取物在制备抗菌消炎天然药物中的应用，其中，所述藤石松提取物为藤石松的水提取液，所述菌是指金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或产气大肠杆菌。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述藤石松的水提取液是取干燥的藤石松粉碎，按1g藤石松干粉加20-35ml超纯水的比例，于藤石松粉中加入超纯水，浸泡2-4h后，先于100℃加热30min，再于60-90℃加热1-2h，离心过滤，得上清液，残渣再按1g残渣加25ml超纯水的比例加入超纯水，于100℃加热30-60min，离心过滤，合并滤液，提取液再加热浓缩至浓度为0.25-0.75g/ml。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述藤石松的水提取液使用前先于120℃灭菌30min。
5.如权利要求3所述的应用，其中，所述藤石松的水提取液使用前先采用22微米微孔无菌过滤器除菌。
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