CN105452202A - 放射性标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于体内成像的放射性药物领域，具体地讲，涉及用放射性同位素18F标记生物靶向分子的方法。本发明提供制备氨基氧官能化生物分子的冻干组合物的方法和使用纯化物质的放射性标记方法。本发明也提供冻干组合物和包含此类纯化组合物的盒。本发明特别适用于自动合成器装置。

Description

放射性标记方法
发明领域
本发明涉及用于体内成像的放射性药物领域，具体地讲，涉及用放射性同位素18F标记生物靶向分子的方法。本发明提供制备氨基氧官能化生物分子的冻干组合物的方法和使用纯化物质的放射性标记方法。本发明也提供冻干组合物和包含此类纯化组合物的盒。本发明特别适用于自动合成器装置。
发明背景
WO 2004/080492 A1公开一种放射性氟化生物靶向载体的方法，所述方法包括使式(I)的化合物与式(II)的化合物反应：
或者，
使(III)的化合物与式(IV)的化合物反应
其中：
R1为醛部分；酮部分；受保护醛，例如，乙缩醛；受保护酮，例如，缩酮；或可用氧化剂快速且有效地氧化成醛或酮的官能团，例如，二醇或N-末端丝氨酸残基；
R2为选自伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、氨基氧、苯肼、氨基脲和氨基硫脲的基团；
R3为选自伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、氨基氧、苯肼、氨基脲或氨基硫脲的基团；
R4为醛部分；酮部分；受保护醛，例如，乙缩醛；受保护酮，例如，缩酮；或可用氧化剂快速且有效地氧化成醛或酮的官能团，例如，二醇或N-末端丝氨酸残基；
以分别得到式(V)或(VI)的缀合物；
其中X为-CO-NH-、-NH-、-O-、-NHCONH-或-NHCSNH-，优选-CO-NH-、-NH-或-O-；Y为H、烷基或芳基取代基；并且
式(II)、(IV)、(V)和(VI)化合物中的接头选自：
其中：
n为0至20的整数；
m为1至10的整数；
p为0或1的整数；
Z为O或S。
Poethko等[J.Nucl.Med., 45(5), 892-902 (2004)]公开一种用放射性同位素18F放射性标记肽的方法，其中使氨基氧官能化肽与[18F]-氟苯甲醛如下缩合，以得到具有肟醚键的经标记的肽：
Schottelius等[Bioconj.Chem., 19(6), 1256-1268 (2008)]进一步发展Poethko等的方法。Schottelius等使用一种氨基氧官能化肽，其中用N-Boc(Boc=叔丁基氧基羰基)保护基保护氨基氧基的胺。所需的氨基氧官能化肽在[18F]-氟苯甲醛存在下通过在酸性pH(pH=2)在75℃下N-Boc基团去保护而原位产生。Schottelius等使用5倍摩尔过量的Boc保护前体，因为去保护在反应条件下不是定量的。
Mezo等[J.Pept.Sci., 17, 39-46 (2010)]描述与Boc保护的氨基氧官能化肽的以上肟配位化学相关的一些问题。因此，已知Boc-氨基氧反应剂可使生成的Boc-保护氨基氧-肽酰化，产生不合乎需要的副产物。也已知官能化肽的游离氨基氧基的反应性对羰基化合物高。因此，与在反应混合物或在任何随后纯化步骤中存在的任何外来的醛或酮可能发生不需要的缩合。这些醛或酮可以为所用溶剂中存在的微量丙酮或甲醛(例如，来自增塑剂)。Mezo等关注解决抗癌药和[18F]-氟苯甲醛二者缀合到肽的这个问题。在10倍摩尔过量游离(氨基氧)乙酸(Aoa)作为‘羰基捕获剂’存在下，通过进行Boc-氨基氧肽去保护，Mezo等解决这一问题。然后冻干去保护的氨基氧-肽和过量Aoa，并在4℃储存。在肟配位反应前立刻重组经冻干的混合物，并通过HPLC或Sep-Pak plus C18柱分离过量Aoa。Mezo等提供一个实例，其中用此技术使非放射性(即，19F) 4-氟苯甲醛缀合到氨基氧-官能化的生长抑素肽。Mezo等未提供关于18F-放射性标记的任何数据。
WO 2012/072736公开将替代保护基化学用于官能化生物分子的氨基氧基。受保护氨基氧基具有下式：
其中R1和R2独立选自C1-3烷基、C1-3氟烷基或C4-6芳基。
WO 2012/072736教导优选使受保护氨基氧基原位去保护，即，在要缀合到的放射性醛存在下，不用中间分离。然而，WO 2012/072736的实施例3公开用这种受保护氨基氧基官能化的肽的去保护，随后直接冻干，以提供经分离产物。直接得到的该冻干组合物被描述为纯的。然而，WO 2012/072736未认识到乙酸盐生成副产物的副反应问题，如本发明所教导。
因此，仍需要制备和放射性标记肽和其它生物靶向分子的替代或改进方法。
本发明
本发明提供一种制备具有与其缀合的氨基氧官能基团的生物靶向分子(BTM)的冻干组合物的方法。
本发明提供纯化的氨基氧官能化BTM作为这种纯化物质的冻干组合物及其随后用于放射性标记的用途。本发明由于增加受保护前体溶解提供更有效的去保护步骤。由于去保护发生在层析纯化所用的流动相，该方法更有效，因为不需要分离纯化的受保护氨基氧衍生物。这特别重要，因为节省冻干步骤，因为受保护氨基氧衍生物一般通过冻干分离，冻干是一个耗时过程。在用于放射性标记时，冻干物质更容易溶解，这对BTM的有效标记和纯化是重要的。
发明详述
在第一个方面，本发明提供一种制备氨基氧官能化生物靶向分子冻干组合物的方法，所述方法包括：
(i)用流动相反相层析纯化式(IA)的受保护化合物：
[BTM]-X1　　(IA)
以在所述流动相得到纯化化合物IA；
(ii)使来自步骤(i)的纯化化合物IA去保护，以得到式(IIA)的氨基氧化合物的溶液：
[BTM]-O-NH2　　(IIA)
(iii)冻干来自步骤(ii)的溶液，以得到式(IIA)的所述氨基氧化合物的冻干组合物；
其中：
[BTM]为生物靶向分子；
X1为下式的受保护氨基氧基：
其中R1和R2独立选自C1-3烷基、C1-3氟烷基或C4-6芳基。
术语“生物靶向部分”(BTM)是指给予后在哺乳动物体的体内具体部位选择性吸收或定位的化合物。这些部位可例如牵涉具体病症或指示器官或代谢过程是如何运作的。
术语“受保护”具有在化学和/或放射化学领域的常规意义，并指用保护基保护官能基不发生不需要的反应。术语“去保护”具有在化学和/或放射化学领域的常规意义，即，去除保护基。术语“保护基”或PGP是指抑制或阻止不合乎需要的化学反应、但被设计成由足够反应性以便能够在不改变分子其余部分的足够温和条件下从所述官能团断开的基团。在去保护后，得到所需产物。保护基的使用描述于“Protective Groups in OrganicSynthesis”(有机合成中的保护基), 第4版, Theorodora W. Greene和Peter G. M.Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]。
术语“氨基氧基”具有其常规意义，是指式-O-NH2的取代基，优选-CH2-O-NH2。
术语“反相层析纯化”具有其常规意义，是指其中固定相亲油且流动相亲水的层析，一般涉及含水介质。适合的层析技术包括HPLC、中压液相层析(MPLC)或固相萃取(SPE)。优选的反相层析技术为HPLC。适合的RP-HPLC柱材料基于二氧化硅，因此，应封端，以避免与颗粒表面上硅烷醇基不期望的相互作用。柱材料应具有高表面积覆盖率，接受适中到高制备载量的待纯化物质，并且容易以不同柱形式填充得到，并且在需要较大量的情况下也可以大量填入较大制备型柱而得到。优选的此类HPLC柱包括：Luna C-18 (2) (10µm, 100A)，购自Phenomenex；或其它二氧化硅基C-18材料，例如购自Eka的Kromasil或购自YMC的ODS AQ。HPLC柱最优选为Luna C-18 (2) (10µm, 100 A)柱。
去保护步骤(ii)适合地按在本领域已知的进行[Dulery等，Tetrahedron, 63,11952-11958 (2007)；和Foillard等，[J.Org.Chem., 73, 983-991 (2008)]。
也应适当地从步骤(i)-(iii)除去醛和酮，因为即使微量或在实验室气氛中空中传播，它们也将经历与式IIA氨基氧化合物的不期望的副反应。
术语“冻干”具有常规意义，即，冷冻干燥的组合物，优选以无菌方式制备的组合物。
优选特征
在步骤(i)中使用的流动相优选为酸性。酸性流动相的优点是，在BTM包含碱性基团时，例如肽或蛋白质的氨基，这些被质子化，以达到充分的层析分离。
优选在步骤(i)的流动相中使用的酸包括三氟乙酸(TFA)，更优选包括含水TFA。在步骤(i)流动相中的适合TFA浓度为0.01-5%体积，优选0.05-1%体积，更优选0.1-0.3%体积。TFA的优点是，它为挥发性，并且在制备第二个方面的冻干组合物时比乙酸铵更容易去除。
因此，对于步骤(i)用含水TFA作为流动相，发明人已发现，在HPLC层析期间不在有意义的程度上发生化合物IA的去保护，因为与含水TFA流动相的接触时间短(20-40min)，并且因为化合物IA结合到固定相，因此不可达到去保护。然而，在含水TFA流动相内在溶液中储存期间，在数分钟接触时间下发生去保护。
在流动相为酸性时，去保护优选通过分离的纯化化合物IA在酸性流动相中在5至60℃温度放置一段时间以允许反应，和/或向所述溶液加入更多酸来实现。因此，例如在环境温度在氩下在0.1%含水TFA中储存过夜显示约0.8%保持受保护的(化合物IA)。完全去保护和/或较短反应时间需要加入更多TFA，例如0.13-0.15% TFA。
因此，优选在不分离纯化化合物IA下进行第一个方面的步骤(i)，以便其作为来自步骤(i)的流动相中的溶液用于步骤(ii)。这具有提高效率的优点，因为发明人已发现，如果被分离(例如，通过冻干)，则纯化化合物IA倾向于显示在去保护介质中的低溶解性，这使其必须作为悬浮体使用，甚至在稀释时。这进而导致较大溶剂体积用于步骤(iii)中冻干，这显著延长冻干时间，减小每次可处理的最大批量。对要处理的最大体积而言，冷冻干燥器的容量通常决定批量。
在第一个方面，优选R1和R2二者独立为C1-2烷基。更优选R1和R2选自甲基和乙基，最优选R1为甲基，R2为乙基，即，乙氧基乙叉基(“Eei”)保护基。
BTM可来源于合成或天然，但优选来源于合成。术语“合成”具有其常规意义，即人造，与从天然源分离相反，例如来自哺乳动物体。此类化合物的优点是可完全控制其制备和杂质特性。因此，天然来源的单克隆抗体及其片段在本文所用术语“合成”的范围外。BTM的分子量优选最高30,000道尔顿。更优选分子量在200至20,000道尔顿的范围内，最优选300至18,000道尔顿，400至16,000道尔顿尤其优选。当BTM为非肽类时，BTM的分子量优选为最高3,000道尔顿，更优选200至2,500道尔顿，最优选300至2,000道尔顿，400至1,500道尔顿尤其优选。
BTM优选包括3至100聚体肽、肽类似物、拟肽或肽模拟物，这些可以为线形或环状肽或其组合；单氨基酸；酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂(包括部分激动剂)或酶抑制剂；受体结合化合物(包括受体底物、拮抗剂、激动剂或底物)；寡核苷酸或寡DNA或寡RNA片段。更优选BTM包括AffibodyTM或单氨基酸、3-100聚体肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物。
术语“肽”是指包含由肽键(即，将一个氨基酸的胺连接到另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的两个或更多个如下定义的氨基酸的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”是指模拟肽或蛋白质的生物活性，但不再是肽化学性质，即它们不再包含任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的生物活性的化合物。在本文中，术语“肽模拟物”以较宽意义使用，包括不再为完全肽性质的分子，如假肽、半肽和拟肽。术语“肽类似物”是指包含一个或多个下述氨基酸类似物的肽。也参阅Synthesis of Peptides and Peptidomimetics(肽和肽模拟物的合成)，M. Goodman等，Houben-Weyl E22c，Thieme。
术语“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如，萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，其可天然存在或为纯合成来源，并且可为光学纯(即，单一对映异构体并因此为手性)，或为对映异构体的混合物。在本文中使用氨基酸的传统3-字母缩写或单字母缩写。优选本发明的氨基酸为光学纯。术语“氨基酸模拟物”是指天然产生氨基酸的合成类似物，其为等排物，即已设计成模拟天然化合物的立体和电子结构。此类等排物为本领域的技术人员所熟悉，包括但不限于酯肽、逆反转(retro-inverso)肽、硫代酰胺、环烷烃或1,5-二取代的四唑[见M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)]。已知放射性标记的氨基酸可用于体内成像剂，例如酪氨酸、组氨酸或脯氨酸。
AffibodyTM分子基于从葡萄球菌蛋白A的IgG-结合域之一衍生的58个氨基酸残基域。亲和体可以单体或二聚体形式使用，并且已由Nygren[FEBS J., 275, 2668-2676(2008)]和Nilsson等[Curr.Opin.Drug.Disc.Dev., 10, 167-175 (2007)]回顾。与10至20倍大的亲和体(~150kDa)比较，这些亲和体的相对小尺寸应允许较佳的靶组织渗透和血液清除。亲和体也具有在一定pH条件范围(pH 5.5至11)下稳定的优点。本发明的优选亲和体靶向HER2。优选的HER2靶向亲和体包括亲和体1，如下所述。
在BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体-结合化合物时，优选其为非肽，更优选是合成的。术语“非肽”是指不含任何肽键(即，两个氨基酸残基之间的酰胺键)的化合物。适合的酶底物、拮抗剂、激动剂或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物、脂肪酸或弹性蛋白酶、血管紧张素II或金属蛋白酶抑制剂。适合的合成受体结合化合物包括雌二醇、雌激素、孕激素(progestin)、黄体酮(progesterone)和其它类固醇激素；多巴胺D-1或D-2受体的配体，或多巴胺转运体，如莨菪烷；和5-羟色胺受体的配体。
BTM最优选为3-100聚体肽或肽类似物。在BTM为肽时，其优选为4-30聚体肽，最优选5至28聚体肽。
在BTM为酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂或酶抑制剂时，优选本发明的这些生物靶向分子是合成的药类小分子，即药物分子。优选的多巴胺转运体配体如莨菪烷、脂肪酸、多巴胺D-2受体配体、苯甲酰胺、苯丙胺、苄基胍、碘西尼、苯并呋喃(IBF)或马尿酸。
在BTM为肽时，优选此类肽包括以下限定的肽A、肽B、肽C和肽D，以及：
- 生长抑素、奥曲肽和类似物，
- 结合到ST受体的肽，其中ST指由大肠杆菌和其它微生物产生的热稳定毒素；
- 铃蟾肽；
- 血管活性肠肽；
- 神经降压素；
- 层粘连蛋白片段，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG，
- 用于白细胞积累靶向部位的N-甲酰基趋化肽，
- 血小板因子4(PF4)及其片段，
- α2-抗溶纤酶、纤连蛋白或β-酪蛋白、纤维蛋白原或血小板反应蛋白的肽片段。α2-抗纤溶酶、纤连蛋白、β-酪蛋白、纤维蛋白原和血小板反应蛋白的氨基酸序列可见于以下参考文献：α2-抗纤溶酶前体[M.Tone等, J.Biochem, 102, 1033, (1987)]；β-酪蛋白[L.Hansson等, Gene, 139, 193, (1994)]；纤连蛋白[A.Gutman等, FEBS Lett., 207,145, (1996)]；血小板反应蛋白-1前体[V.Dixit等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83,5449, (1986)]；R.F.Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984)；
- 作为血管紧张素的底物或抑制剂的肽，例如：血管紧张素II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (E. C. Jorgensen等, J. Med. Chem., 1979, Vol 22, 9, 1038-1044)
[Sar, Ile]血管紧张素II：Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Ile(R.K. Turker等.,Science, 1972, 177, 1203)；
- 血管紧张素I：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu。
更优选的BTM肽选自以下限定的肽A、肽B、肽C和肽D：
(i)肽A=Arg-Gly-Asp肽；
(ii)肽B=Arg-Gly-Asp肽，其包括片段
(iii)肽C=c-Met结合环肽，包括氨基酸序列：
-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；
并且Cysa-d分别为半胱氨酸残基，使得残基a和b及c和d环化形成两个单独的二硫键；
(i)肽D=下式的羊毛硫抗菌肽：
Cysa-Xaa-Gln-Serb-Cysc-Serd-Phe-Gly-Pro-Phe-Thrc-Phe-Val-Cysb-
(HO-Asp)-Gly-Asn-Thra-Lysd
其中Xaa为Arg或Lys；
Cysa-Thra、Serb-Cysb和Cysc-Thrc通过硫醚键共价连接；
Serd-Lysd通过赖丙氨酸键共价连接；
HO-Asp为β-羟基天冬氨酸。
尤其优选的BTM肽为肽B、肽C和肽D。
最优选的此类肽B为式(A)的肽：
其中X1为-NH2或
其中a为1至10的整数。
在式A中，a优选为1。
优选的c-Met结合环肽具有以下序列：
Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。
在BTM为肽时，肽的一个或两个末端(优选两个末端)已缀合到代谢抑制基(MIG)。具有以此方式受保护的两个肽末端对体内成像应用重要，因为否则预料会快速代谢，并具有随后的对BTM肽的选择性结合亲和性损失。术语“代谢抑制基”(MIG)是指抑制或阻止BTM肽在氨基末端或羧基末端的酶(尤其是肽酶，如羧肽酶)代谢的生物相容基团。此类基团对体内应用特别重要并且为本领域的技术人员所熟悉，对于肽胺端，适合选自：
N-酰化基团-NH(C=O)RG，其中酰基-(C=O)RG具有选自C1-6烷基、C3-10芳基的RG，或者包括聚乙二醇(PEG)结构单元。优选的此类氨基末端MIG基团为乙酰基、苄基氧基羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。
用于肽羧基末端的适合代谢抑制基包括：甲酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。用于BTM肽的羧基末端氨基酸残基的适合MIG基团是在氨基酸残基的末端胺用C1-4烷基(优选甲基)N-烷基化的位置。优选的此类MIG基团为甲酰胺或PEG，最优选的此类基团为甲酰胺。
在式IA中，X1基团适合地结合到BTM的官能团，如下所述。因此，N-(1-乙氧基乙叉基)-2-氨基氧基乙酸N-羟基琥珀酰亚氨基酯(Eei-AOAc-OSu)购自Iris Biotech GmbH(Waldershofer Str. 49-51, 95615 Marktredwitz, Germany)。那种Eei-保护的氨基氧活性酯可直接缀合到含胺的BTM(例如，具有Lys残基)，以得到式IA的受保护化合物。氨基氧官能化马来酰亚胺Mal-AO已由Padilla de Jesus等[US 7,902,332 和Mol.Imaging Biol.,10, 177-181 (2008)]描述：
通过所述硫醇与Mal-AO的马来酰亚胺官能的选择性反应，可用双官能接头Mal-AO使氨基氧官能基结合到含硫醇的BTM。Padilla de Jesus(以上提到)将此用于HER2选择性亲和体的缀合。
到Eei-保护肽的其它路线由Dulery等[Tetrahedron, 63, 11952-11958 (2007)]和Foillard等[J.Org.Chem., 73, 983-991 (2008)]描述。Dulery和Foillard也描述用于使Eei保护基去保护的适合条件。
在第二个方面，本发明提供一种冻干组合物，所述冻干组合物包含第一个方面的步骤(iii)中限定的式IIA的冻干氨基氧化合物。
第二个方面中式IIA的纯化氨基氧化合物的优选实施方案如第一个方面(以上)中所述。
第二个方面的冻干组合物不包含醛和酮。
第二个方面的冻干组合物优选不包含残余TFA，因为残余TFA可降低式IIA的一些氨基氧化合物的稳定性。
第二个方面的冻干组合物是重要的，因为对于进一步反应，特别对于第三个方面中所述的放射性标记，需要浓得多的形式。冻干组合物也可无菌得到，在要由其制备放射性药物组合物时，这是重要的。这描述于第三个方面(以下)中。冻干组合物可有利用于自动合成器和相关的盒，如第四、第五和第六个方面(以下)中所述。
冻干组合物可任选包含一种或多种另外的辅料，选自促进冻干的填料或增溶剂。
术语“填料”是指可帮助在制备和冻干期间材料处理的药学上可接受的填充剂。适合的填料包括无机盐(如氯化钠)和水溶性糖或糖醇(如蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或海藻糖)。
术语“增溶剂”是指在组合物中存在的增加重组溶剂中剂的溶解度的添加剂。优选的此类溶剂为含水介质，因此，增溶剂优选提高在水中的溶解度。适合的此类增溶剂包括：C1-4醇、甘油、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单油酸酯、聚山梨酯、聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(PluronicsTM)、环糊精(例如，α、β或γ环糊精、羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精)和卵磷脂。
在第三个方面，本发明提供一种用18F放射性标记生物靶向分子的方法，所述方法包括：
(a)进行第一个方面的方法，以得到第二个方面的冻干组合物；
(b)使来自步骤(a)的所述冻干组合物与式IIIA的羰基化合物在适合溶剂中缩合：
Q-[接头]-(C=O)Y1　　(IIIA);
以得到式(IVA)的放射性标记缀合物：
[BTM]-O-N=(CY1)-[接头]-Q　　(IVA)
其中：
Q为包含放射性同位素18F的基团；
[BTM]为生物靶向分子，如在第一个方面中所限定；
Y1为H、C1-6烷基或C4-10芳基，
[接头]为接头基团。
第三个方面中式IIA的氨基氧化合物、BTM、Y1和[接头]的优选实施方案如第一个方面(以上)中所述。第三个方面中冻干组合物的优选实施方案如第二个方面(以上)中所述。
术语“包含放射性同位素的基团”是指官能基包含放射性同位素，或者放射性同位素作为另外的物类连接。在官能基包含放射性同位素时，这意味化学结构已包含所讨论的化学元素，并且那种元素的放射性同位素以显著高于所述同位素自然丰度水平的水平存在。这种提高或富集水平的同位素适合以所讨论的同位素自然丰度水平至少5倍存在，优选至少10倍，最优选至少20倍，理想至少50倍，或者以其中所讨论的同位素富集水平为90至100%的水平存在。这种官能基的实例包括具有提高水平的18F的氟烷基，使得18F原子在化学结构内。
术语“接头基团”是指式-(A)m-的二价基团，其中各A独立为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基或C3-12亚杂芳基，
其中各R独立选自：H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟烷基；并且
m为数值1至20的整数。
在第三个方面，Y1优选为H，即，式IIIA的羰基化合物为醛。式IIIA的优选羰基化合物为18F-4-氟苯甲醛。
第三个方面的缩合步骤(b)优选在苯胺或其盐(例如，盐酸苯胺)存在下进行。在肟配位中使用苯胺已显示有效提高总反应速率，并允许这些反应在较小酸性pH值进行[Dirksen,等., Angew. Chem. Int. Ed.Engl., 45, 7581-7584 (2006)]。在第三个方面的方法的步骤(b)后，式IVA的产物缀合物可优选用标准技术分离和/或纯化，例如层析。
进行第三个方面的制备方法优选使18F-标记生物靶向分子作为适用于哺乳动物给药形式的放射性药物组合物得到，所述组合物包含所述18F-标记生物靶向分子以及生物相容性载体。18F的优点是适用于正电子发射断层照相法(PET)成像。
短语“以适用于哺乳动物给药的形式”是指无菌、无热原、没有产生毒性或不利作用的化合物并且在生物相容pH(约pH 4.0至10.5)配制的组合物。此类组合物没有可能导致体内栓塞风险的颗粒，并经配制，以便在与生物流体(例如，血液)接触时不出现沉淀。此类组合物也只包含生物相容辅料，并且优选是等渗的。
“生物相容载体”为其中放射性缀合物可悬浮或优选溶解，使得组合物在生理学上可耐受(即，可给予哺乳动物体而没有毒性或过度不适)的流体，尤其是液体。生物相容载体适合为可注射载体液体，如用于注射的无菌无热原水；水溶液，如盐水(可有利地被平衡，使得用于注射的最终产物为等渗性)；包含生物相容缓冲剂的缓冲水溶液(例如，磷酸盐缓冲剂)；一种或多种渗胀度调节物质(例如，血浆阳离子与生物相容反离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如，聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选生物相容载体为注射用的无热原水、等渗盐水或磷酸盐缓冲剂。
放射性标记缀合物和生物相容载体在包括密封容器的适合管瓶或器皿中提供，密封容器允许保持无菌完整性和/或放射安全性与任选的惰性顶部空间气体(例如，氮或氩)，同时允许由注射器或插管加入和抽取溶液。优选的此容器为隔膜密封管瓶，其中气密闭合体用顶封(一般为铝)卷边。闭合体适合用皮下注射针头单次或多次穿刺(例如，被卷边的隔膜密封闭合体)，同时保持无菌完整性。此类容器的另外优点是，如果需要，盖能够经受真空(例如，为了改变顶部空间气体或使溶液脱气)，并且经受压力变化，如减压，而不允许外部大气气体进入，如氧或水蒸气。
优选的多剂量容器包含单一大管瓶(例如10至50cm3体积)，这种瓶含有多患者剂量，从而为了适合临床情况，在制剂的实际使用期限期间以不同时间间隔将单患者剂量抽入临床级注射器。预填充注射器设计成含有单人剂量或“单位剂量”，因此优选为适合临床使用的一次性或其它注射器。
放射性药物组合物可包含任选的另外的辅料，如抗微生物防腐剂、pH调节剂、填料、辐射防护剂、增溶剂或渗透压调节剂。术语“填料”和“增溶剂”如在第二个方面(以上)中限定。术语“辐射防护剂”是指通过捕获高反应性自由基(例如从水辐解产生的含氧自由基)阻止降解反应(例如氧化还原过程)的化合物。本发明的辐射防护剂适合选自：抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即，4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即，2,5-二羟基苯甲酸)及其与生物相容阳离子的盐。术语“生物相容阳离子”(Bc)是指与离子化带负电荷的基团形成盐的带正电荷的反离子，其中所述带正电荷的反离子也为非毒性，因此适合哺乳动物体给药，尤其是人体。适合的生物相容阳离子的实例包括碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。优选的生物相容阳离子为钠和钾，最优选钠。
术语“抗微生物防腐剂”是指抑制潜在有害微生物(如细菌、酵母或霉菌)生长的药剂。根据所用剂量，抗微生物防腐剂也可显示一些杀菌性质。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制药物组合物中任何此类微生物的生长。然而，抗微生物防腐剂也可任选用于抑制在给药前制备所述组合物所用试剂盒的一种或多种组分中潜在有害微生物的生长。适合的抗微生物防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯类，即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或其混合物；苄醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂为对羟基苯甲酸酯类。
术语“pH调节剂”是指可用于保证组合物的pH在用于人或哺乳动物给药的可接受限度(约pH 4.0至10.5)内的化合物或化合物混合物。适合的此类pH调节剂包括药学上可接受的缓冲剂，如曲辛、磷酸盐或TRIS[即，三(羟基甲基)氨基甲烷]；和药学上可接受的碱，如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。在组合物以试剂盒形式使用时，pH调节剂可任选在单独的管瓶或容器中提供，以便试剂盒的使用者能够调节pH，作为多步骤过程的一部分。
为了得到放射性药物组合物，第三个方面的方法可以多种方式进行：
a)其中各步骤在洁净室环境进行的无菌生产技术；
b)终端灭菌，其中第一个方面的步骤(i)-(iii)不用无菌生产进行，然后作为最后步骤灭菌[例如，通过γ照射、压热处理、干热或化学处理(例如，利用环氧乙烷)]；
c)试剂盒方法，其中使包含第二个方面的冻干组合物与任选辅料的无菌、非放射性试剂盒制剂与式IIIA的放射性化合物反应；
d)其中步骤用自动合成器装置进行的无菌生产技术。
方法(d)是优选的。因此，第三个方面的方法优选用自动合成器装置进行。此类自动合成器在第四个方面(以下)中描述。
式IIIA的羰基化合物可如下得到。18F-氟化醛可以为18F-氟苯甲醛或对-(二-叔丁基-18F-氟甲硅烷基)苯甲醛(18F-SiFA-A)。式18F(CH2)2O[CH2CH2O]qCH2CHO(其中q为3)的18F-标记的脂族醛可通过Glaser等[Bioconj.Chem., 19(4), 951-957 (2008)]的方法得到。18F-氟苯甲醛可通过Glaser等[J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]的方法得到。18F-氟苯甲醛的前体，即Me3N+-C6H4-CHO.CF3SO3 -，可通过Haka等[J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)]的方法得到。
通过使适合的受保护衍生物去保护，可任选原位产生式IIIA的羰基化合物。羰基保护基的使用描述于“Protective Groups in Organic Synthesis”(有机合成中的保护基), 第4版, Theorodora W. Greene和Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell,(2006)]。
在第四个方面，本发明提供一种包含第二个方面的冻干组合物的自动合成器装置。
在第四个方面中，式IIA的纯化氨基氧化合物和冻干组合物的优选实施方案分别如第一个方面和第二个方面(以上)中所述。
术语“自动合成器”是指基于单元操作原理的自动模块，如Satyamurthy等[Clin.Positr.Imag., 2(5), 233-253 (1999)]所述。术语“单元操作”是指复杂过程减少到可应用于一定范围材料的一系列简单操作或反应。此类自动合成器优选用于本发明的方法，尤其在需要放射性药物组合物时。它们可购自一系列供应商[Satyamurthy等，以上]，包括GE Healthcare、CTI Inc、Ion Beam Applications S.A.(Chemin du Cyclotron 3, B-1348 Louvain-La-Neuve, Belgium)、Raytest(Germany)和Bioscan(USA)。
市售自动合成器还对作为放射性药物制备的结果产生的液体放射性废弃物提供合适的容器。自动合成器通常不提供有辐射屏蔽，因为它们设计用于适宜地设置的放射性工作间。放射性工作间提供合适的辐射屏蔽，以保护操作者免受潜在的辐射剂量，以及提供通风，以除去化学和/或放射性蒸气。自动合成器优选包括盒。
术语“盒”是指设计使得可移除和可交换地将整个单元装配到自动合成器装置(如上限定)上的装置单元部件，采用使得合成器的活动部分的机械移动从盒外侧(即，外部)控制盒操作的方式。适合的盒包括阀的线性阵列，阀分别连接到孔口，在此可通过针刺倒置的隔膜密封瓶或通过气密配合接头来连接试剂或瓶。各阀具有与自动合成器的相应活动臂界面连接的凸-凹接头。因此，在盒连接到自动合成器时，臂的外部旋转控制阀的打开或关闭。自动合成器的另外的活动部分设计成夹在注射器柱塞端上，并因此提起或压下注射器筒。
盒是通用的，一般具有可连接试剂的数个位置，并且有数个位置适用于连接试剂的注射瓶或层析管(例如，固相萃取或SPE)。盒始终包括反应容器。这样的反应容器优选1-10 cm3，最优选2-5 cm3体积，并且经构造，使得盒的3或更多个孔口与其连接，以允许从盒上的不同孔口转移试剂或溶剂。优选盒在线性阵列中具有15至40个阀，最优选20至30个，25个尤其优选。优选盒的阀分别是相同的，最优选为三通阀。盒设计成适合放射性制药制造，因此，由药物级并且理想地为抗辐解的材料制造。
本发明的自动合成器优选包含一次性或单次使用的盒，盒包括进行放射氟化放射性药物的指定批料制备所必需的所有试剂、反应容器和装置。盒意味着自动合成器具有能够通过简单地调换盒以最小交叉污染风险制备多种不同放射性药物的灵活性。盒方法也具有以下优点：简化装配，因此减小操作者失误的风险；提高GMP(良好作业规范)顺应性；多示踪剂能力；在生产过程之间快速改变；盒和试剂的预试自动诊断检查；化学试剂相对于要进行的合成的自动条形码交叉检查；试剂可追溯性；单次使用，因此没有交叉污染风险、防篡改和滥用。
在第五个方面，本发明提供自动合成器装置用于进行第一个方面的制备方法或第三个方面的放射性标记方法的用途。
第五个方面中式IIA的纯化氨基氧化合物和纯化方法的优选实施方案如第一个方面(以上)中所述。第五个方面中放射性标记的方法的优选实施方案如第三个方面(以上)中所述。
在第六个方面，本发明提供适用于第四个方面的自动合成器的单次使用、一次性盒，其中所述盒包含第二个方面的冻干组合物。
第六个方面中自动合成器和盒的优选方面如第四个方面(以上)中所述。第六个方面中式IIA的氨基氧化合物的优选方面如第一个方面中所述。第六个方面中冻干组合物的优选方面如第二个方面(以上)中所述。
本发明通过以下详述的非限制实施例说明：
实施例1提供本发明的c-Met靶向肽(“肽1”)的合成。
实施例2提供氨基氧官能化肽1(“化合物2”)的合成，其中氨基氧官能基用保护基(Eei)保护。
实施例3提供双官能氨基氧马来酰亚胺接头(化合物4)的合成。
实施例4通过亲和体与化合物4反应，提供氨基氧官能化亲和体(“化合物6”)的合成、纯化和冻干。
实施例5提供化合物6的18F标记，显示本发明的方法提供可行的放射性标记前体。
实施例6显示，本发明的方法(方法2)提供与使用前述方法(方法1)时比较，提高纯度的化合物2。方法2也提供更容易溶于放射性标记所用溶剂的冻干材料。后者的影响是，关于化合物3的纯化时间减少31%(1287秒，对比使用FastLabTM放射合成器装置的885秒)。通过方法2制备前体时得到的化合物3的RCP与方法1一样好，且化合物3中的非放射性肽杂质(总肽含量)减少26%。
本发明的化合物
其中：
化合物1、2和3在肽1的羧基末端Lys的ε胺基官能化；
亲和体1对HER2有选择性；
化合物5、6和7的S原子来自亲和体1的末端Cys残基。
缩略语
使用常规单字母或3字母氨基酸缩写。
Ac: 乙酰基
Acm:　　　 乙酰氨基甲基
ACN:　　　 乙腈
AcOH:　　　 乙酸
Boc:　　　　 叔丁基氧基羰基
tBu:　　　　 叔丁基
DCM:　　　 二氯甲烷
DIPEA:　　　 　N,N-二异丙基乙基胺
DMF:　　　　 　二甲基甲酰胺
DMSO:　　　 　二甲亚砜
Eei:　　　　 　乙氧基乙叉基；
Eei-AOAc-OSu:　N-(1-乙氧基乙叉基)-2-氨基乙酸N-羟基琥珀酰亚氨酯；
Fmoc:　　　　　9-芴基甲氧基羰基；
HBTU:　　　 　六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N'N'-四甲基脲；
HPLC:　　　　　高效液相色谱；
MW:　　　　 　分子量；
NHS:　　　　 　N-羟基琥珀酰亚胺；
NMM:　　　　 　N-甲基吗啉；
NMP:　　　 　　1-甲基-2-吡咯烷酮；
Pbf:　　　 　　2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；
RP-HPLC:　 　反相高效液相色谱法；
SPE:　　　 　　固相萃取；
tBu:　　　 　　叔丁基；
TFA:　　　 　　三氟乙酸；
THF:　　　 　　四氢呋喃；
TIS:　　　　 　三异丙基硅烷；
Trt:　　　　 　三苯甲基。
实施例1：合成肽1
步骤(a)：合成受保护的前体线形肽
前体线形肽具有以下结构：
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2
以0.1mmol Rink Amide Novagel树脂开始，用Fmoc化学反应在Applied Biosystems433A肽合成器上装配肽基树脂H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψMe,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物。在偶联步骤加过量1mmol预活化氨基酸(使用HBTU)。依次结合Glu-Thr假脯氨酸(Novabiochem05-20-1122)。将树脂转移到氮鼓泡器装置，并用乙酸酐(1mmol)和NMM(1mmol)溶于DCM(5mL)的溶液处理60分钟。过滤除去酐溶液，树脂用DCM洗涤，并在氮气流下干燥。
在含2.5%TIS、2.5%4-巯基甲苯和2.5%水的TFA(10mL)中经2小时30分钟同时进行侧链保护基的去除和肽从树脂的断裂。过滤除去树脂，在真空中除去TFA，并将乙醚加入到残余物。将生成的沉淀用乙醚洗涤，并经空气干燥，得到264mg粗肽。
通过制备型HPLC(梯度：20-30%B，经40min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μ C18(2) 250x21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：30min)纯化粗肽，得到100mg纯肽1线形前体。通过分析型HPLC(梯度：10-40%B经历10min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2) 50x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)分析纯产物。其它产物表征用电喷雾质谱进行(计算MH2 2+：1464.6，实测MH2 2+：1465.1)。
步骤(b)：形成单环Cys4-16二硫桥
Cys4-16;Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2.
使来自步骤(a)的线形前体(100mg)溶于5%DMSO/水(200mL)，并用氨将溶液调节至pH6。将反应混合物搅拌5天。然后用TFA将溶液调节至pH 2，通过在真空中蒸发除去大部分溶剂。将残余物(40mL)分批注射到制备型HPLC柱上，用于产物纯化。
通过制备型HPLC(梯度：0%B经历10min，然后0-40%B经历40min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μ C18(2) 250x21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：44min)纯化残余物，得到72mg纯肽1单环前体。通过分析型HPLC(梯度：10-40%B经历10min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：5.37min(P1)；5.61min(P2)；6.05min(P3))分析纯产物(作为异构体P1至P3的混合物)。其它产物表征用电喷雾质谱进行(计算MH2 2+：1463.6，实测MH2 2+：1464.1(P1)；1464.4(P2)；1464.3(P3))。
步骤(c)：形成第二Cys6-14二硫桥(肽1)
在氮气层下，使来自步骤(b)的单环前体(72mg)溶于75%AcOH/水(72mL)。按顺序加入1MHC1(7.2mL)和AcOH中的0.05M I2(4.8mL)，并搅拌混合物45分钟。加入1M抗坏血酸(1mL)，得到无色混合物。在真空中蒸发大部分溶剂，残余物(18mL)用水/0.1%TFA(4mL)稀释，产物用制备型HPLC纯化。通过制备型HPLC(梯度：0%B经历10min，然后20-30%B经历40min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μ C18(2)250x21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：43-53min)纯化残余物，得到52mg纯肽1。通过分析型HPLC(梯度：10-40%B经历10min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18(2) 50x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)分析纯产物。其它产物表征用电喷雾质谱进行(计算MH2 2+：1391.5，实测MH2 2+：1392.5)。
实施例2：合成、纯化和冻干化合物2
使化合物1(0.797g)和Eei-AOAc-OSu(IRIS Biotech; 127mg)溶于DMF(12mL)。加入DIPEA(100µL)，并摇动反应混合物26min。加入第二等份DIPEA(80µL)，并摇动反应混合物2小时。然后用10%ACN/水/0.1%乙酸铵(40mL)稀释反应混合物，产物通过制备型HPLC用A=0.1%TFA/水和B=ACN以20-40%B经历40min梯度洗脱纯化。将包含纯产物的部分(这些为化合物1和化合物2的混合物)集中到烧瓶中，并用氩吹洗烧瓶。将溶液搅拌过夜，达到Eei保护基完全去除。将去保护的产物冻干，得到550mg(69%产率)化合物2。
通过分析型LC-MS(梯度：10-40%B经历5min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN TFA，流速：0.6mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18(2) 20x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.00min，计算MH2 2+：1428.1，实测MH2 2+：1427.9)分析纯产物。
实施例3：合成双官能接头(化合物4)
在环境温度在NMP(2mL)中搅拌N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺TFA-盐(Sigma-Aldrich;151mg)和Eei-AOAc-OSu (IRIS Biotech; 77mg)。加入三甲基吡啶(80µL)，并在环境温度搅拌反应混合物70min。通过用0.1%乙酸(7mL)稀释猝灭反应。产物通过制备型HPLC如下纯化：
检测 UV，在214nm和254nm
柱类型和尺寸 Luna C-18 (2), 5µm, 100Å, 20 x 250 mm, 购自Phenomenex
洗脱剂A 0.1%体积乙酸，溶于水，1mL/L
洗脱剂B 乙腈(Lichrosolv)
梯度 15-30% B，在40min期间
流速 10ml/min，在梯度洗脱期间
冻干纯化化合物4。产量43mg(75%)，纯度>97%，以面积计。
通过分析型LC-MS(梯度：10-40%B经历5min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：0.6mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18(2) 20x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：1.93min，计算MH+：284.1，实测MH+：284.1)分析纯产物。
实施例4：合成、纯化和冻干化合物6
步骤(a)：合成化合物5
使亲和体1(亲和体AB; 1.00g)和化合物4(81mg)溶于30%含水乙腈。加入乙酸铵，以将pH调节至6。然后在环境温度搅拌混合物34min，到此时间反应完成(通过LC-MS监测)。
步骤(b)：纯化化合物5
用水(20mL)稀释来自步骤(a)的反应混合物。经稀释混合物通过制备型HPLC如下纯化：
参数 条件
检测 UV，在214nm和254nm
柱 Luna C-18 (2), µm, 100Å, 50 x 250 mm Axia 填充, 得自Phenomenex
洗脱剂A 0.1%(体积) TFA，在水中，1ml/l
洗脱剂B 乙腈(Lichrosolv)
平衡 15-20min，在50ml/min(不是梯度方法的一部分)
梯度 15-35%B(在50min期间)，35-95%B(在2min期间)，95%B(等度洗涤，在8-15min期间)
流速 50ml/min，在梯度洗脱期间
通过应用所需梯度洗脱化合物5，显示约35分钟保留时间。
步骤(c)：化合物5去保护得到化合物6
合并来自步骤(b)的纯化部分(约0.5L)。这些为化合物5和化合物6的混合物。加入TFA(5mL)，并在氩下在环境温度搅拌反应混合物，通过HPLC监测。去保护在105分钟内完成。
步骤(d)：冻干纯化化合物6
然后，冷冻来自步骤(c)的经去保护化合物6溶液，同时用和缓氩流吹洗烧瓶。然后冻干经冷冻化合物6溶液。产量：1.01g(98%)，纯度：89%面积HPLC。
通过分析型HPLC(梯度：10-40%B经历5min，其中A=H2O/0.1%TFA，B=ACN/0.1%TFA，流速：0.6mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18(2) 20x2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.13min)和MS(计算MH8 8+：906.2，实测MH8 8+：906.3)分析纯产物。
实施例5：放射合成化合物7
步骤(a)：合成[18F]-氟苯甲醛(18F-FBA)
利用银靶，用GEMS PETtrace回旋加速器通过[18O](p,n) [18F]核反应制备[18F]-氟化物。使用1.5-3.5mL总靶体积。使放射性氟化物截留在Waters QMA柱(用碳酸盐预处理)上，氟化物用水(80μL)和乙腈(320μL)中Kryptofix2.2.2(4mg, 10.7μM)和碳酸钾(0.56mg, 4.1μM)的溶液洗脱。用氮将溶液从QMA柱驱离到反应容器。将[18F]-氟化物在120℃在稳定氮流和真空下干燥9分钟。将DMSO(1.1mL)中的苯甲醛三氟甲磺酸三甲铵[Haka等,J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)](3.3mg, 10.5μM)加入到经干燥[18F]-氟化物，并在105℃加热混合物7分钟，以产生4-[18F]-氟苯甲醛。
步骤(b)：18F-FBA缀合到化合物6
使用来自步骤(a)的18F-FBA和FastLabTM放射合成器装置(GE Healthcare Ltd)，用18F放射性标记来自实施例4(d)的冻干化合物6，以25%产率和95%RCP得到化合物7。
实施例6：合成、冻干和放射性氟化化合物2，以得到化合物3 -本方法与之前方法 的比较
根据现有方法(方案1)和本发明的方法(方案2)制备准备用于放射性氟化的作为最终中间体(“FI”)的化合物2的冻干组合物，并比较结果。两种方法总结于方案1和2中。
方案1：先前过程方法流程图(方法1)
方案2：本发明方法流程图(方法2)
在方案1和2中，“受保护FI”相当于化合物1，“FI”相当于化合物2。
检测方法1和2的经冻干产物的纯度和水和TFA含量。然后，用方法1和方法2的经冻干材料根据实施例5的方法用18F-FBA放射性氟化，并测定化合物3的放射化学纯度。也通过分析型HPLC测定化合物3产物的放射性肽含量。
产生的数据总结于表1中：
表1：方法1和方法2数据
*这是对从FASTlab洗脱的产物
其中m/m指质量/质量。

Claims (15)

1.一种制备氨基氧官能化生物靶向分子冻干组合物的方法，所述方法包括：
(i)用流动相反相层析纯化式(IA)的受保护化合物：
[BTM]-X1　　(IA)
以在所述流动相得到纯化化合物IA；
(ii)使来自步骤(i)的纯化化合物IA去保护，以得到式(IIA)的氨基氧化合物的溶液：
[BTM]-O-NH2　　(IIA)
(iii)冻干来自步骤(ii)的溶液，以得到式(IIA)的所述氨基氧化合物的冻干组合物；
其中：
[BTM]为生物靶向分子；
X1为下式的受保护氨基氧基：
其中R1和R2独立选自C1-3烷基、C1-3氟烷基或C4-6芳基。
2.权利要求1的方法，其中R1和R2独立为C1-2烷基。
3.权利要求1或2的方法，其中BTM包括单氨基酸、3-100聚体肽、酶底物、酶拮抗剂、酶激动剂、酶抑制剂或受体结合化合物。
4.权利要求3的方法，其中BTM包括AffibodyTM。
5.权利要求3的方法，其中BTM包括选自以下限定的肽A、肽B、肽C和肽D的3-100聚体肽：
(i)肽A=Arg-Gly-Asp肽；
(ii)肽B=Arg-Gly-Asp肽，包括片段
(iii)肽C=c-Met结合环肽，包括氨基酸序列：
-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；并且
Cysa-d分别为半胱氨酸残基，使得残基a和b及c和d环化形成两个单独的二硫键；
(iv)肽D=下式的羊毛硫抗菌肽：
Cysa-Xaa-Gln-Serb-Cysc-Serd-Phe-Gly-Pro-Phe-Thrc-Phe-Val-Cysb-
(HO-Asp)-Gly-Asn-Thra-Lysd
其中Xaa为Arg或Lys；
Cysa-Thra、Serb-Cysb和Cysc-Thrc通过硫醚键共价连接；
Serd-Lysd通过赖丙氨酸键共价连接；
HO-Asp为β-羟基天冬氨酸。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中步骤(i)的反相层析纯化包括HPLC。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述流动相包括含水三氟乙酸。
8.一种冻干组合物，所述冻干组合物包含在权利要求1至5中任一项的步骤(iii)中限定的式(IIA)的冻干氨基氧化合物。
9.一种用18F放射性标记生物靶向分子的方法，所述方法包括：
(a)进行权利要求1至7中任一项的方法，以得到权利要求8的冻干组合物；
(b)使来自步骤(a)的所述冻干组合物与式(IIIA)的羰基化合物在适合溶剂中缩合:
Q-[连接基]-(C=O)Y1　　(IIIA);
以得到式(IVA)的放射性标记缀合物：
[BTM]-O-N=(CY1)-[连接基]-Q　　(IVA)
其中：
Q为包含放射性同位素18F的基团；
[BTM]为权利要求1至5中任一项的生物靶向分子；
Y1为H、C1-6烷基或C4-10芳基，
[连接基]为连接基团。
10.权利要求9的放射性标记方法，其中18F-标记生物靶向分子作为适用于哺乳动物给药形式的放射性药物组合物得到，所述组合物包含所述18F-标记生物靶向分子以及生物相容性载体。
11.权利要求9或10的方法，所述方法用自动合成器装置进行。
12.一种自动合成器装置，所述自动合成器装置包含权利要求8的冻干组合物。
13.权利要求12的自动合成器装置，所述自动合成器装置包括包含所述冻干组合物的单次使用的一次性盒。
14.自动合成器装置用于进行权利要求1至7中任一项的制备方法或权利要求10的放射性标记方法的用途。
15.一种适用于权利要求12的自动合成器的单次使用的一次性盒，其中所述盒包含权利要求8的冻干组合物。
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