CN105441433B - 参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电离辐射敏感的长链非编码RNA，具体是一种参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA及其应用。所述长链非编码RNA转录本具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA，为进一步开发人体受到电离辐射后检测的生物标志物提供了目标RNA片段，也为研究人体细胞受到辐射后发生损伤的信号通路研究提供了候选lncRNA，在肿瘤治疗方面可能也有一定的应用前景。

Description

参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种电离辐射敏感的长链非编码RNA，具体是一种参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA及其应用。

(二)背景技术

随着人类对自身细胞中的DNA和RNA功能的深入研究，以前被认为不具有编码蛋白功能的“垃圾”RNA片段被逐渐揭示出在人体生理机能中的重要功能。有一类不具有编码蛋白质能力的RNA片段，每个片段大于200个碱基，被定义为长链非编码RNA，即lncRNA。lncRNA的表达受到发育调控，是组织和细胞特异的。相当一部分lncRNA只位于细胞核内。它们包含许多类型的转录本，在结构上类似mRNA，有时也转录成编码基因的反义转录本。lncRNA被认为执行了重要的调控功能，也与疾病发展息息相关。lncRNA可通过与DNA或RNA结合或与蛋白结合而行使其功能。一些lncRNA实际上是某些调控RNA(如microRNA或piwiRNA)的前体。与miRNA不同的是，lncRNA没有一种普遍的作用模式，它以许多不同的方式来调控基因表达和蛋白合成。研究发现，一些lncRNA参与了基因调控的基本过程，包括染色质修饰和结构以及直接的转录调控。基因调控可能以顺式(cis)或反式(trans)发生。lncRNA的转录后功能包括调控RNA加工事件，如剪接、编辑、定位、翻译和降解。近几年，越来越多的lncRNA被科学家发现并进行研究。现在，生物科学领域已经确认lncRNA参与了细胞凋亡，表观遗产，X染色体失活，癌症的发生和转移，间充质干细胞转化等多个重要的生物学过程。此外，研究还发现lncRNA在多种癌症中差异表达，包括白血病、乳腺癌、肝癌、结肠癌和前列腺癌。lncRNA失调的其他疾病还包括心血管疾病、神经系统疾病和免疫介导的疾病。但是，在人体细胞受到电离辐射后产生的应激反应这个重要的生物学过程中是否也有lncRNA的参与，还没有被证明。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种新发现的参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA，其转录本具有如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1序列如下：

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO：1所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能，则均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其功能。

本发明还涉及所述的长链非编码RNA作为人体电离辐射检测标志物的应用。本发明的核苷酸片段在人体细胞中普遍存在，可以根据核苷酸序列设计引物，使用PCR仪扩增出这个核苷酸片段，在细胞受到电离辐射后提取细胞的总RNA，进行定量PCR实验可以检测出这个核苷酸片段的表达水平变化。

具体的，所述长链非编码RNA用于制备鉴别不同辐照类型的生物学探测器。

本发明还涉及所述的长链非编码RNA在制备抗肿瘤药物中的应用。由于lncRNA在多种癌症中差异表达，包括白血病、乳腺癌、肝癌、结肠癌和前列腺癌，因此本发明长链非编码RNA可能。

具体的，所述长链非编码RNA可用于制备诱导肿瘤细胞凋亡或抑制肿瘤细胞增殖的药物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA，为进一步开发人体受到电离辐射后检测的生物标志物提供了目标RNA片段，也为研究人体细胞受到辐射后发生损伤的信号通路研究提供了候选lncRNA，在肿瘤治疗方面可能也有一定的应用前景。

(四)附图说明

图1为4种lncRNA在HeLa细胞受到2Gy X射线辐照后的表达水平变化；

图2为4种lncRNA在HeLa细胞受到2Gy碳离子辐照后的表达水平变化。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、实验方法

1)细胞培养

选用稳定的宫颈癌细胞系HeLa细胞(购自美国ATCC)，用1640培养基培养，放在37℃恒温、5％二氧化碳的细胞培养箱中培养；传代时先用无菌PBS洗两遍，再用1％胰酶消化1分钟，待细胞从培养皿上消化下来后，用1640培养基重悬；分入新的培养皿中，加入1640培养基进行扩大培养。

2)辐照处理

把培养的HeLa细胞分为对照组和实验组，每组约有1×10⁸个细胞；采用生物学实验用电能激发X射线辐照仪(型号Faxitron RX-650)进行电离辐照实验，电压为50KV，剂量率为0.675Gy/分钟，实验组接受2Gy X射线辐照，对照组不辐照；辐照后重新把实验组和对照组放入细胞培养箱中培养4小时收集细胞。

3)提取RNA

把两组细胞从细胞培养箱中取出，吸出培养基，用无菌PBS洗两次，把PBS全部吸出；往细胞培养皿里加入Trizol试剂，约每5×10⁶个细胞加入1mL试剂，用移液器吹打几次，使细胞全部裂解；把用Trizol试剂裂解的细胞转入无RNA酶的EP管中，在管壁上作好标记。

4)RNA测序

把实验组和对照组的实验样品放入装满干冰的泡沫箱里，送到华大基因公司上海分公司进行lncRNA全序列测序，并统计两组实验样品之间lncRNA的差异表达。得到原始数据后，我们使用转录组数据比对软件TopHat2将过滤完核糖体的阅读框比对到参考基因组上，TopHat支持不依赖参考基因注释的分段比对，更有利于我们发现新的转录本。TopHat利用BowtieBowtie作为比对“引擎”，把不能比对上的阅读框打断成小段，并推断阅读框分段及分段的位置。对于最初未比对上的阅读框，TopHat会在不依赖已知基因注释的前提下构建一个splice位点的参考集。RNA-seq序列的比对不仅有助于发现可变剪切及新转录本，还可以用于鉴定表达的基因及其定量。阅读框比对到基因组后，将会用Cufflinks进行组装，考虑到覆盖度存在间隙而导致转录本组装不完全的情况，我们更倾向于用基于参考序列的组装方式(reference annotation based transcripts，BRAT)。Cufflinks会根据参考转录本构建出人工阅读框，来弥补测序中低覆盖度的影响，这些阅读框将会与比对上的序列一起用于组装。最后一步组装出来的转录片段将会与参考基因进行比较，与已知转录本大致一致的片段将会被去掉。Cuffdiff是Cufflinks配套的一款定量差异分析软件，它用两个样品作为对照和实验组，计算基因或转录本在两样品中的表达量FPKM值，并检测是否存在差异表达。Cuffdiff先统计每个基因所有转录本的fragment数目，转化为转录本的表达量，再将它们累加到对应的基因上。像其他工具一样，cuffdiff也用到负二项分布模型来估量基因或转录本差异表达的程度。

5)分析测序结果和验证

根据测序的结果，分析出实验组和对照组之间具有显著性差异表达的lncRNA序列，共得到26种；根据26种lncRNA的序列设计定量PCR的引物；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成；重复前面培养细胞和裂解细胞的方法，得到2Gy X射线辐照实验组细胞Trizol裂解液和对照组细胞Trizol裂解液。

6)实时荧光定量PCR实验

每1mL Trizol裂解液加入200uL氯仿，剧烈震荡30秒，静置3分钟，12000转/分钟，4℃低温离心15分钟；吸取上清400uL转入新的EP管中，加入等量的异丙醇，冰上静置10分钟；12000转/分钟，4℃低温离心15分钟；弃去上清，得到的沉淀即为RNA，用配制好的75％的DEPC酒精0.8mL洗沉淀；12000转/分钟，4℃低温离心10分钟；弃去上清，待沉淀自然风干后，加入60℃DEPC水进行溶解；测定提取的总RNA的浓度；采用GeneCopoeia公司的mRNA反转录试剂盒进行总RNA反转录，每25uL体系里加入2ug总RNA；反转录采用的程序为45℃一个小时，85℃5分钟，4℃保存；把反转录得到的cDNA稀释5倍作为定量PCR的模板；引物稀释为2uM的浓度；采用GeneCopoeia公司mRNA荧光定量PCR试剂盒并根据说明书配制体系和设定程序；根据荧光定量PCR实验的Ct值计算出实验组和对照组之间目标lncRNA转录本的表达变化倍数，并根据三次独立实验的结果进行作图。

7)碳离子辐射验证

重复X射线辐照实验的步骤，HeLa细胞接受2Gy碳离子辐照后4小时提取RNA，再次进行定量PCR实验，验证26种lncRNA在受到碳离子辐照后的表达变化；碳离子射线由兰州重离子加速器国家实验室实验环浅层终端提供。

2、实验结果：

找出了与人体细胞电离辐射应激表达相关的lncRNA，在受到电离辐射后这26种lncRNA具有显著的表达水平的变化，其中有4种为新发现的lncRNA转录本，分别命名为XLOC_012077、XLOC_012764、XLOC_014016和XLOC_023611，4种lncRNA在HeLa细胞受到2Gy X射线辐照后的表达水平变化参见图1；其中XLOC_012764即SEQ ID No.1所示核苷酸序列，其引物为：5’-GCAGGTGTCAACCACAAGAA-3’和5’-GGGTGTCAGGTAGAGGTGGA-3’。

4种lncRNA在HeLa细胞受到2Gy碳离子辐照后的表达水平变化参见图2。由图1、图2可见，在受到电离辐射后这4种lncRNA具有显著的表达水平的变化，提示4种lncRNA均可作为人体受到电离辐射后检测的生物标志物。

Claims (3)

1.一种参与人体细胞电离辐射应激反应的长链非编码RNA，其转录本核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.如权利要求1所述的长链非编码RNA作为人体电离辐射检测标志物的应用，其特征在于：所述长链非编码RNA用于制备鉴别不同辐照类型的生物学探测器，所述辐照类型为X射线辐照或碳离子辐照。

3.如权利要求1所述的长链非编码RNA在制备抗宫颈癌药物中的应用。