CN105420090B - 基于纳米金dna探针的基因检测系统及方法 - Google Patents

基于纳米金dna探针的基因检测系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于纳米金DNA探针的基因检测系统及方法，该检测系统包括电流检测装置、用于盛放电解液的电解池、置于电解液中的三电极组，三电极组包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极、参比电极和对电极分别通过引线与电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端电连接，工作电极为掺石墨烯玻碳电极，其中，掺石墨烯玻碳电极中的石墨烯质量百分含量为10‰～15‰，包覆金纳米颗粒的Poly(EGDMA‑co‑VPy)微球自组装在掺石墨烯玻碳电极表面形成包覆Poly(EGDMA‑co‑VPy)微球纳米金层，DNA探针结合于包覆Poly(EGDMA‑co‑VPy)微球纳米金层上。

Description

基于纳米金DNA探针的基因检测系统及方法
技术领域
本发明涉及一种基因检测系统，特别涉及一种DNA电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
众所周知，DNA传感器是以DNA为敏感元件，通过换能器将DNA与DNA、DNA与RNA、DNA与其它有机无机离子之间的作用的生物学信号转变为可检测的光、电、声波等物理信号的电化学生物传感器。它们是基于探针DNA变化发展而来的一种新型的DNA传感器。其中，探针DNA是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可以是线状或者环状DNA，可用来快速检测病原体。探针DNA一般一端修饰巯基，一端修饰已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等指示剂。通过金-硫键的作用自组装到金电极表面。与固定的靶DNA互补杂交后，探针DNA的构型会改变，使得探针DNA指示剂与电极表面的电子传递效率改变，从而改变电信号，完成指示杂交，可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。探针DNA利用了DNA分子杂交原理，可以用来诊断寄生虫病，现场调查及虫种鉴定，可用于病毒性肝炎的诊断，遗传性疾病的诊断，可用于检测饮用水病毒含量。
目前，这种简单的传感器被广泛地应用于DNA、酶、金属离子和有机小分子的研究。但是有些DNA的构象改变非常复杂，而对于简单的传感器，其灵敏度和选择性还需要进一步提高。
如中国专利公开第102286371号提供的一种基于探针DNA控制组装界面的交流阻抗型DNA电化学传感器，包括电极和捕获探针DNA，电极采用金电极，捕获探针DNA采用巯基修饰的DNA，其特征是巯基修饰的DNA在室温下与金电极通过Au-S键的化学键合作用以及探针碱基部分与金的吸附作用而修饰到金电极表面使捕获探针DNA平躺于金电极表面形成捕获探针DNA组装层；在捕获探针DNA组装层的表面有牛血清白蛋白作为封闭剂和保护剂。通过杂交前后阻抗值的变化作为指示信号，该方法利用表面组装化学技术构建“平躺”型DNA探针识别界面，同时使探针的形态不受空白杂交条件的影响而保持平躺于电极表面。然而，该发明提供的DNA电化学传感器的DNA探针是平躺在电极表面，并没有形成具有高灵敏性的DNA探针弓装结构，“平躺”型DNA探针遮盖电化学传感器面积较大，传感器所结合的DNA探针数量少。
又如中国专利公开第103048369号提供的一种基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料的金黄色葡萄球菌无标记电化学适配体传感器，基于还原氧化石墨烯-纳米金复合材料结合适配体检测金黄色葡萄球菌的方法，其基本原理是利用还原氧化石墨烯-纳米金复合材料，用层层自组装的方法修饰巯基化的金黄色葡萄球菌全菌捕获探针。当探针在金黄色葡萄球菌菌液中孵育，它的有效结合位点会与金黄色葡萄球菌结合，将其包裹在三维空间结构中，实现对目标菌的全菌“捕获”。由于结合目标菌后会阻碍电极表面的电子传输，使电化学阻抗值增大，利用阻值的变化实现对金黄色葡萄球菌的定量检测。但该电化学适配体传感器中纳米金颗粒直接自组装在玻碳电极表面的石墨烯膜上，这使得玻碳电极包覆石墨烯膜的工艺复杂成本高；此外，所选用DNA探针为一端修饰有巯基的DNA探针，不能形成弓形构造，不利于提高检测灵敏度。
再如中国专利公开第102788824号提供的一种DNA生物传感器制备方法，DNA生物传感器中硅片基底和金膜基底由石墨烯自组装薄膜组成，其中硅片基底为通过十八烷基三甲氧基硅烷自组装上石墨烯薄膜，而金膜基底为通过1-十八硫醇自组装上石墨烯薄膜。通过各种电学测试表明，自组装前后及DNA固定杂交前后电性能、元素组成及结构有明显的变化，并能明显观察到目标DNA浓度的变化对其峰值的影响。然而，该DNA生物传感器制备方法提供的DNA生物传感器未采用三电极系统，其DNA探针也并没有形成具有高灵敏性的弓装结构。
还如中国专利第104569101号公开的一种DNA电化学生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目的DNA序列互补的互补DNA、导电纳米颗粒以及可溶性电化学活性试剂，其中一段互补的单链DNA作为捕获探针组装于金电极上，并利用该单链DNA与导电纳米颗粒的结合作为电化学信号的转换单元，对DNA杂交事件进行电化学响应。该方法将吸附了导电纳米颗粒的巯基化DNA修饰金电极作为信号转换电极，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应，基于DNA序列之间的碱基互补配对作用，对目标物DNA进行电化学响应和检测。然而，该DNA电化学生物传感器提供的DNA电化学传感器并没有形成具有高灵敏性的DNA探针弓装结构，而且是用金电极电解的方式制得纳米金颗粒，造价高而灵敏度低。
综上所述，尽管对DNA电化学生物传感器已经进行了大量的研究，但是提高检测灵敏度和选择性、降低DNA电化学生物传感器的成本依然是目前研究的重要方向。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上现有技术的不足，提供一种基于纳米金DNA探针的基因检测系统及方法，该系统能够提供更多DNA探针结合位点，灵敏测得系统电路电流变化，减少成本、节约材料。
根据本发明的一个方面，提供一种基于纳米金DNA探针的基因检测系统，包括：电流检测装置、用于盛放电解液的电解池、置于电解液中的三电极组，三电极组包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极、参比电极和对电极分别通过引线与电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端电连接，工作电极为掺石墨烯玻碳电极，其中，掺石墨烯玻碳电极中的石墨烯质量百分含量为10‰～15‰，包覆金纳米颗粒的Poly(EGDMA-co-VPy)微球自组装在掺石墨烯玻碳电极表面形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层，DNA探针结合于包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层上。
优选地，电流检测装置控制电极电势在一定范围内以恒定的变化速率扫描，使得电极电势从第一电势变化至第二电势，再按相同速率从第二电势变化至第一电势，同时记录相应的响应电流，得到伏安特性曲线。
可选择地，使用的电流检测装置可为电化学工作站，型号为CHI600E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)，或者选用型号为RST5200电化学工作站(郑州世瑞思仪器科技有限公司)。
可选择地，电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端分别对应于电化学工作站的工作电极接入端、参比电极接入端和对电极接入端。
可选择地，DNA探针的两端分别修饰有亚甲基蓝和巯基，巯基与纳米金层通过金-硫键结合，通过纳米金层对DNA探针上修饰的亚甲基蓝的表面吸附力使DNA探针弯曲形成弓型结构，形成DNA探针层。
可选择地，DNA探针层和金电极表面有序组装一层牛血清蛋白分子层，作为封闭剂和保护剂，封闭非特异性位点，减少非特异性结合。
根据本发明的另一方面，提供一种基于纳米金DNA探针的基因检测系统的制备方法，包括：(1)、按质量比20～30:1准备聚丙烯腈树脂和石墨烯，将准备好的聚丙烯腈树脂在氩气气氛中缓慢加热至1200摄氏度～1800摄氏度得到玻碳，将玻碳降温至800摄氏度～1000摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳；(2)、根据所需尺寸切割掺石墨烯玻碳获得掺石墨烯玻碳电极；(3)、将得到的掺石墨烯玻碳电极依次在硝酸溶液、二次蒸馏水、丙酮中超声洗涤5～10分钟；(4)、准备粒径350～550纳米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球；(5)、按体积比1～3:1准备柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液，将准备好的氯金酸溶液按体积比为0.001～0.01:1加入到超纯水中加热，沸腾后加入准备好的柠檬酸钠溶液，充分搅拌反应液并保持沸腾态30～50分钟，当溶液颜色变成酒红色时停止加热，反应液自然冷却至室温后冷冻分离提纯，得到纳米金颗粒溶液；(6)、将步骤(4)准备的Poly(EGDMA-co-VPy)微球加入到步骤(5)制得的纳米金颗粒溶液中震荡30～50分钟，得到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液；(7)、将掺石墨烯玻碳电极放入到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液中，密封浸泡2～5小时，取出掺石墨烯玻碳电极后用去离子水冲洗，氮气吹干，完成纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球与掺石墨烯玻碳电极的自组装，在掺石墨烯玻碳电极上形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的纳米金层；(8)、将装配有巯基和亚甲基蓝的DNA探针溶液滴涂在掺石墨烯玻碳电极的纳米金层上，晾干后用二次水(二次蒸馏水)清洗，氮气吹干，得到DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极。
其中，Poly(EGDMA-co-VPy)微球加入到纳米金颗粒溶液中震荡是在气浴振荡器中进行的，温度设定为20～50摄氏度，优选30～40摄氏度。
可选择地，Poly(EGDMA-co-VPy)微球加入到纳米金颗粒溶液中震荡可以采用其他方式进行。
可选择地，准备Poly(EGDMA-co-VPy)微球可包括步骤：(4.1)、准备乙腈和4-乙烯吡啶，4-乙烯吡啶的体积为乙腈体积的2％～4％，将准备好的4-乙烯吡啶加入到乙腈中，配制成反应液；(4.2)、反应液加入二甲基丙烯酸二醇酯(EGDMA)做为交联剂，交联剂投入量为反应液总体积的1.5％～8.5％，并且，反应液加入偶氮二异丁腈AIBN做为引发剂，引发剂的投入量为反应液总体积的1％～5％；以及(4.3)、在步骤(4.2)配置好的混合液中加入沸石，缓慢加热混合液，加热温度设定为70～90摄氏度，加热时间设定为60～90分钟，过滤溶液得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球后分别用四氢呋喃和无水乙醇浸泡三十分钟，真空干燥至恒重得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球，真空干燥温度设定为40～60摄氏度。
其中，交联剂二甲基丙烯酸二醇酯投入量优选为反应液总体积的2.5％～7.5％，更优选3％～5％。
其中，引发剂偶氮二异丁腈的投入量优选为反应液总体积的2％～4％。
其中，制备Poly(EGDMA-co-VPy)微球的混合液加热时，为避免反应生成副产物，控制反应温度使混合液25～30分钟内沸腾并开始蒸出溶剂乙腈。
可选择地，Poly(EGDMA-co-VPy)微球也可以直接从商家购买，其中文名称为“聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯-共-4-乙烯吡啶)”。
优选的，准备的石墨烯是0.4-0.6纳米厚的单层石墨烯粉末。
可选择地，准备的石墨烯也可以是单层石墨烯、双层石墨烯和多层石墨烯的一种或几种混合物。
可选择地，洗涤石墨烯玻碳电极的硝酸溶液由体积比0.5～3:1的硝酸与去离子水混合制得。
可选择地，纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液用乙醇-水混合溶液离心洗涤3～5次后，用乙醇-水混合溶液保存，其中，乙醇-水混合溶液体积比为3～5:1。
可选择地，包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层表面组装一层牛血清蛋白分子层以覆盖包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层上未与DNA探针结合的区域。
可选择地，电解液选用0.1～0.3摩尔/升的硫酸。氯金酸溶液的浓度可选择性设为0.01～0.1毫摩尔/升，柠檬酸钠溶液的浓度可选择性设为0.1～0.4毫摩尔/升。
可选择地，本发明制得的纳米金的粒径为20～50纳米。
本发明的有益效果是：(1)、采用Poly(EGDMA-co-VPy)微球作为载体与纳米金颗粒自组装，纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球提供更多DNA探针结合位点，纳米金颗粒与Poly(EGDMA-co-VPy)微球结合紧密、牢固、不易脱落；(2)、本发明所选用的DNA探针两端分别有巯基和亚甲基蓝修饰，纳米金颗粒吸附亚甲基蓝使得DNA探针弯曲成弓形，弓型DNA探针与待检测DNA结合时，DNA探针由弓形变成直立，导致工作电极电阻变化，通过电流检测装置测得的响应电流可以确定溶液中是否含有靶DNA；(3)、用掺石墨烯玻碳电极作为工作电极，可以利用石墨烯良好的导电性对系统电流变化记录准确、灵敏，采用掺石墨烯玻碳电极作为工作电极而非石墨烯膜包覆工作电极的方式，降低了生产成本，节约了生产材料；(4)、在DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极上涂敷牛血清蛋白溶液，自组装一层牛血清蛋白分子层，可以封闭未结合DNA探针的金纳米颗粒的结合位点，防止非靶DNA与金纳米颗粒发生非特异性结合，影响测试结果的准确性。
附图说明
图1示出了本发明制备基于纳米金DNA探针的基因检测系统的工作电极的流程示意图。
图2为基于纳米金DNA探针的基因检测系统的构造示意图。
图3为DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极与靶DNA结合前状态示意图。
图4为DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极与靶DNA结合后状态示意图。
图5为包覆金纳米颗粒的Poly(EGDMA-co-VPy)微球与DNA探针自组装的构造示意图。
具体实施方式
下面通过参考附图和实施例对本发明作进一步详细阐述，但这些阐述并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语具有本发明所属和相关技术领域的一般技术人员通常理解的含义。
实施例1
请参照附图1，本发明的基于纳米金DNA探针的基因检测系统的工作电极的制备方法，包括如下制备步骤。
在步骤S1中，按质量比25:1准备聚丙烯腈树脂和石墨烯，将准备好的聚丙烯腈树脂在氩气气氛中缓慢加热至1200摄氏度得到玻碳，玻碳降温至900摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳，其中，石墨烯是0.4-0.6nm厚的单层石墨烯粉末。
在步骤S2中，按所需尺寸切割掺石墨烯玻碳获得掺石墨烯玻碳电极。
在步骤S3中，将得到的掺石墨烯玻碳电极依次在硝酸溶液、二次蒸馏水、丙酮中超声洗涤各5分钟，其中，硝酸溶液由体积比1:1的硝酸与去离子水混合制得。
在步骤S4中，准备粒径约500纳米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球。
在步骤S5中，准备氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液，将准备好的氯金酸溶液加入到超纯水中加热至沸腾后加入柠檬酸钠溶液，充分搅拌溶液并使溶液保持沸腾态40分钟，当溶液颜色变成酒红色后停止加热，溶液自然冷却至室温后冷冻分离提纯，得到纳米金颗粒溶液，其中，氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液体积比为1:1，氯金酸溶液与超纯水体积比为0.005:1，其中，氯金酸溶液的浓度选用0.2毫摩尔/升，柠檬酸钠溶液的浓度选用0.35毫摩尔/升，制得的纳米金粒径约为30～35纳米。
在步骤S6中，将准备好的Poly(EGDMA-co-VPy)微球分散到纳米金颗粒溶液，在气浴振荡器震荡，时间设定为30分钟，温度设定为40摄氏度，得到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液，用体积比为4:1的乙醇-水混合溶液离心洗涤自组装溶液3次后，用乙醇-水混合溶液保存。
在步骤S7中，将掺石墨烯玻碳电极放入到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液中，密封浸泡3小时，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干，完成纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球与掺石墨烯玻碳电极的自组装，在掺石墨烯玻碳电极上形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的纳米金层。
在步骤S8中，将装配有巯基和亚甲基蓝的DNA探针溶液滴涂在掺石墨烯玻碳电极的纳米金层上，晾干后用二次水清洗，氮气吹干后涂敷牛血清蛋白溶液，使牛血清蛋白分子层自组装在DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极上。
其中，准备Poly(EGDMA-co-VPy)微球包括步骤：
准备乙腈和4-乙烯吡啶，4-乙烯吡啶的体积为乙腈体积的约3％，将准备好的4-乙烯吡啶加入到乙腈中，配制成反应液。
反应液中加入二甲基丙烯酸二醇酯，投入量为反应液总体积的4％，加入偶氮二异丁腈AIBN，投入量为反应液总体积的3％。
在配置好的混合液中加入沸石，缓慢加热混合液至80摄氏度，加热70分钟，控制反应温度使混合液30分钟内沸腾并开始蒸出溶剂乙腈，过滤溶液得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球，得到的Poly(EGDMA-co-VPy)微球分别用四氢呋喃和无水乙醇浸泡三十分钟，再分别用四氢呋喃、丙酮和无水乙醇分别洗涤一遍，50摄氏度条件下真空干燥得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球。
实施例2
除了步骤S1中聚丙烯腈树脂和石墨烯质量比调整为30:1外，其它条件同实施例1。
实施例3
除了步骤S1中聚丙烯腈树脂在氩气中加热稳定至调整1500摄氏度、玻碳降温至800摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳外，其它条件同实施例1。
实施例4
除了步骤S1中聚丙烯腈树脂在氩气中加热稳定至调整1800摄氏度外、玻碳降温至1000摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳，其它条件同实施例1。
实施例5
除了步骤S5中在反应釜内的温度调整为200摄氏度外，其它条件同实施例1。
实施例6
作为一种非限制性实施例，本发明的基于纳米金DNA探针的基因检测系统的工作电极的制备方法包括如下制备步骤。
按质量比20:1准备聚丙烯腈树脂和石墨烯，将准备好的聚丙烯腈树脂在氩气气氛中缓慢加热至1200摄氏度得到玻碳，玻碳降温至900摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳，其中，石墨烯是0.4-0.6nm厚的单层石墨烯粉末。
切割掺石墨烯玻碳获得直径约1厘米、长度约15厘米的掺石墨烯玻碳电极。
将得到的掺石墨烯玻碳电极依次在硝酸溶液、二次蒸馏水、丙酮中超声洗涤各5分钟，其中，硝酸溶液由体积比1:1的硝酸与去离子水混合制得。
准备粒径约500纳米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球约5克。
准备1毫升氯金酸溶液和1毫升柠檬酸钠溶液，将准备好的氯金酸溶液加入到100毫升超纯水中加热至沸腾后加入柠檬酸钠溶液，充分搅拌溶液并使溶液保持沸腾态40分钟，当溶液颜色变成酒红色后停止加热，溶液自然冷却至室温后冷冻分离提纯，得到纳米金颗粒溶液，其中，氯金酸溶液是由1克氯金酸一次溶解于1000毫升去离子水配制的水溶液，柠檬酸钠溶液是由1克柠檬酸钠一次溶解于1000毫升去离子水配制的水溶液，制得的纳米金粒径约为30～35纳米。
将准备好的Poly(EGDMA-co-VPy)微球分散到纳米金颗粒溶液，在气浴振荡器震荡，时间设定为30分钟，温度设定为40摄氏度，得到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液，用体积比为4:1的乙醇-水混合溶液离心洗涤自组装溶液3次后，用乙醇-水混合溶液保存。
将掺石墨烯玻碳电极放入到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液中，密封浸泡3小时，取出后用去离子水冲洗，氮气吹干，完成纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球与掺石墨烯玻碳电极的自组装，在掺石墨烯玻碳电极上形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的纳米金层。
将装配有巯基和荧光素的DNA探针溶液滴涂在掺石墨烯玻碳电极的纳米金层上，晾干后用二次水清洗，氮气吹干后涂敷牛血清蛋白溶液，使牛血清蛋白分子层自组装在DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极上。
其中，准备Poly(EGDMA-co-VPy)微球包括步骤：
准备100毫升乙腈和0.8毫升4-乙烯吡啶，将准备好的4-乙烯吡啶加入到乙腈中，配制成反应液。
反应液中加入二甲基丙烯酸二醇酯1.7毫升，加入偶氮二异丁腈AIBN24毫摩尔。
在配置好的混合液中加入沸石，缓慢加热混合液至80摄氏度，加热70分钟，控制反应温度使混合液30分钟内沸腾并开始蒸出溶剂乙腈，过滤溶液得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球，得到的Poly(EGDMA-co-VPy)微球分别用四氢呋喃和无水乙醇浸泡三十分钟，再分别用四氢呋喃、丙酮和无水乙醇分别洗涤一遍，50摄氏度条件下真空干燥得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球。
在使用过程中，实施例1～6制得的自组装DNA探针的玻碳电极作为基于纳米金DNA探针的基因检测系统的工作电极101，基于纳米金DNA探针的基因检测系统的工作电极101、参比电极102和对电极103分别通过引线与电流检测装置104的第一接线端、第二接线端和第三接线端电连接，工作电极101、参比电极102和对电极103置于电解池105中，电解池中装有电解液106，并且，工作电极101、参比电极102和对电极103互相不接触。其中，基于纳米金DNA探针的基因检测系统的参比电极102是甘汞电极，对电极103是铂丝。
基于纳米金DNA探针的基因检测系统采用循环伏安法检测靶DNA的存在，电流检测装置104控制电极电势在一定范围内以恒定的变化速率扫描，使得电极电势从第一电势变化至第二电势，再按相同速率从第二电势变化至第一电势，若工作电极101上自组装的DNA探针与靶DNA结合，DNA探针由弯曲的弓形变成直立导致工作电极101电阻半径变化，进一步引起工作电极101电阻变化，记录相应的响应电流，由得到的伏安特性曲线判断是否有靶DNA存在。
在该非限制性实施方式中，电流检测装置104包括恒电位仪，通过设定恒电位仪的起始电势、峰值电势和扫描速率，可使电极电势在一定范围内以恒定的变化速率扫描，电势扫描讯号为对称三角波，电极电势以恒定的变化速率从起始电势变化至峰值电势，再按相同速率从峰值电势变化至起始电势，如此循环变化，同时记录相应的响应电流。由于DNA探针与靶DNA结合，DNA探针由弯曲的弓形变成直立的双链DNA，DNA探针直立增加了工作电极101的半径，工作电极101电阻表面积增大，工作电极电阻变大，恒电位仪电极电势在一定范围内以恒定的变化速率扫描，记录相应的响应电流形成伏安特性曲线，将得到的伏安特性曲线与结合靶DNA前所测得伏安特性曲线比较，根据峰电流信号变化确定纳米金DNA探针是否与靶DNA结合。
具体地，记录工作电极插入待检测溶液前测得的伏安特性曲线A，并记录工作电极从电解池取出插入待检测溶液反应1小时后再插入电解池测得的伏安特性曲线B，比较曲线A和B，若两条曲线没有实质的差异，则确定待检测溶液中不含靶DNA；若伏安特性曲线B的峰值电流相比伏安特性曲线A的峰值电流显著降低，则能够确定待检测溶液中含有靶DNA。
作为一种非限制性示例，电解液选用0.15摩尔/升的硫酸。选择如下序列为DNA探针，5’-F-T6-GCGGGCAGGC A/G GGC-T6-SH-3’，其中F代表亚甲基蓝。选择如下序列为靶DNA：5’-AAA CCATTAGCTCCTCCACGCC C/TGCCTGCCCGC-3’，以上人工序列由北京赛百盛有限公司提供。
尽管在此已详细描述本发明的优选实施方式，但要理解的是本发明并不局限于这里详细描述和示出的具体结构，在不偏离本发明的实质和范围的情况下可由本领域的技术人员实现其它的变型和变体。例如，工作电极采用诸如石墨电极或其它材料的电极。此外，系统各处的温度、时间或压力等参数可以根据具体使用条件在本发明所公开的范围内适当选取。

Claims (5)

1.一种用在基于纳米金DNA探针的基因检测系统中的工作电极的制备方法，所述基于纳米金DNA探针的基因检测系统包括电流检测装置、用于盛放电解液的电解池、置于所述电解液中的三电极组，所述三电极组包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极、所述参比电极和所述对电极分别通过引线与所述电流检测装置的第一接线端、第二接线端和第三接线端电连接，其特征在于，所述工作电极的制备方法包括：
(1)、按质量比20～30:1准备聚丙烯腈树脂和石墨烯，将准备好的聚丙烯腈树脂在氩气气氛中缓慢加热至1200摄氏度～1500摄氏度得到玻碳，将玻碳降温至800摄氏度～1000摄氏度加入准备好的石墨烯搅拌混合后冷却得到掺石墨烯玻碳；
(2)、根据所需尺寸切割掺石墨烯玻碳获得掺石墨烯玻碳电极；
(3)、将得到的掺石墨烯玻碳电极依次在硝酸溶液、二次蒸馏水、丙酮中超声洗涤5～10分钟；
(4)、准备粒径350～500纳米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球，该步骤包括：(4.1)、准备乙腈和4-乙烯吡啶，4-乙烯吡啶的体积为乙腈体积的2％～4％，将准备好的4-乙烯吡啶加入到乙腈中，配制成反应液；(4.2)、反应液加入二甲基丙烯酸二醇酯(EGDMA)做为交联剂，所述交联剂投入量为所述反应液总体积的1.5％～8.5％，并且，反应液加入偶氮二异丁腈AIBN做为引发剂，所述引发剂的投入量为所述反应液总体积的1％～5％；以及(4.3)、在步骤(4.2)配置好的混合液中加入沸石，缓慢加热混合液，加热温度设定为70～90摄氏度，加热时间设定为60～90分钟，过滤溶液得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球后分别用四氢呋喃和无水乙醇浸泡三十分钟，真空干燥至恒重得到Poly(EGDMA-co-VPy)微球，真空干燥温度设定为40～60摄氏度；
(5)、按体积比1:1准备柠檬酸钠溶液和氯金酸溶液，将准备好的氯金酸溶液按体积比为0.001～0.01:1加入到超纯水中加热，沸腾后加入准备好的柠檬酸钠溶液，充分搅拌反应液并保持沸腾态40～50分钟，当溶液颜色变成酒红色时停止加热，反应液自然冷却至室温后冷冻分离提纯，得到纳米金颗粒溶液；
(6)、将步骤(4)准备的Poly(EGDMA-co-VPy)微球加入到步骤(5)制得的纳米金颗粒溶液中震荡30～50分钟，得到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液；
(7)、将掺石墨烯玻碳电极放入到纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液中，密封浸泡2～5小时，取出掺石墨烯玻碳电极后用去离子水冲洗，氮气吹干，完成纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球与掺石墨烯玻碳电极的自组装，在掺石墨烯玻碳电极上形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的纳米金层；以及
(8)、将装配有巯基和亚甲基蓝的DNA探针溶液滴涂在掺石墨烯玻碳电极的纳米金层上，晾干后用二次水清洗，氮气吹干，得到DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极作为所述的基于纳米金DNA探针的基因检测系统中的工作电极，并且进一步在所制备的DNA探针修饰的掺石墨烯玻碳电极上涂敷牛血清蛋白溶液，自组装一层牛血清蛋白分子层作为封闭剂和保护剂，以便封闭非特异性位点以减少非特异性结合；
其中，在步骤(4.3)中，制备Poly(EGDMA-co-VPy)微球的混合液加热时，为避免反应生成副产物，控制反应温度使混合液25～30分钟内沸腾并开始蒸出溶剂乙腈；
由此获得的所述工作电极为掺石墨烯玻碳电极，其中，所述掺石墨烯玻碳电极中的石墨烯质量百分含量为10‰～15‰，包覆金纳米颗粒的Poly(EGDMA-co-VPy)微球自组装在所述掺石墨烯玻碳电极表面形成包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层，DNA探针结合于所述包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层上，所述DNA探针的两端分别修饰有亚甲基蓝和巯基，所述巯基与所述包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层通过金-硫键结合，通过所述包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球纳米金层对所述DNA探针上修饰的亚甲基蓝的表面吸附力使所述DNA探针弯曲形成弓型结构，形成DNA探针层。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，交联剂二甲基丙烯酸二醇酯投入量优选为反应液总体积的2.5％～7.5％；引发剂偶氮二异丁腈的投入量为反应液总体积的2％～4％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述石墨烯是0.4-0.6纳米厚的单层石墨烯粉末。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述硝酸溶液为硝酸与去离子水体积比为0.5～3:1混合配制。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述纳米金颗粒包覆Poly(EGDMA-co-VPy)微球的自组装溶液用乙醇-水混合溶液离心洗涤3～5次后用乙醇-水混合溶液保存，其中，所述乙醇-水混合溶液中乙醇和水的体积比为3～5:1。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106442464B (zh) * 2016-09-19 2019-03-08 宁波大学 一种硅片/还原石墨烯/金纳米复合材料的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286371A (zh) * 2011-07-04 2011-12-21 福建医科大学 基于探针dna控制组装界面的交流阻抗型dna电化学传感器
CN102559790A (zh) * 2012-02-07 2012-07-11 清华大学 一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法
CN103698374A (zh) * 2013-12-23 2014-04-02 邢士超 一种基于荧光素和巯基修饰的dna探针的电化学传感器
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102286371A (zh) * 2011-07-04 2011-12-21 福建医科大学 基于探针dna控制组装界面的交流阻抗型dna电化学传感器
CN102559790A (zh) * 2012-02-07 2012-07-11 清华大学 一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法
CN103698374A (zh) * 2013-12-23 2014-04-02 邢士超 一种基于荧光素和巯基修饰的dna探针的电化学传感器
CN104681127A (zh) * 2015-02-16 2015-06-03 宿迁学院 微电极材料、微电极的制作方法、应用该材料的检测装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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"荧光DNA探针微结构控制研究";陈小雨;《万方数据知识服务平台学位论文数据库》;20110824;第1-73页 *

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