CN105385656A

CN105385656A - 一种ecce-cik细胞培养方法及ecce-cik细胞制剂

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Publication number: CN105385656A
Application number: CN201510882204.7A
Authority: CN
Inventors: 王利利
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明公开了一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂，在激活PBMC步骤中首先加入IFN-γ、ECCE细胞，培养温度37℃、CO₂体积浓度为5%、湿度100%下培养；然后再加入anti-CD3单克隆抗体、IL-2继续培养。加入IFN-γ使其终浓度为1000-2000U/mL，加入ECCE细胞至其终浓度为10⁵-10⁶个ECCE细胞/mL。本发明在传统CIK细胞培养方法的基础上，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，使ECCE-CIK细胞比传统CIK细胞增殖能力强、杀伤活性高，有望提高自体CIK细胞治疗肿瘤的疗效。

Description

一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂

技术领域

本发明涉及一种细胞的培养方法。具体涉及一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercells，CIK）是指经IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2等细胞因子体外有序激活人外周血单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCells，PBMC）而获得的异质免疫细胞群，于1991年被美国斯坦福大学Schmidt-Wolf首次发现并命名。因其具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点，被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选细胞群。然而，由于肿瘤病人的免疫功能处于抑制或免疫耗竭状态，传统CIK细胞培养技术在临床应用时个体差异较大，迫切需要建立新的培养技术，提高CIK细胞的扩增效率和杀伤活性。

人工抗原递呈细胞（artificialantigenpresentingcells，aAPC）通过模拟T细胞活化的双重信号机制，在一定的载体表面表达抗原肽-MHC分子复合物及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体，能有效活化和扩增抗原特异性T细胞，且效率高、可行性好。ECCE（EngineeredCellsforCostimulatoryEnhancement）是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9（humantumornecrosisfactorsuperfamilymember9，CD137L）的逆转录病毒感染K562细胞，并使其稳定表达而形成的新型aAPC。K562细胞不表达MHC分子，能够避免异体移植物的免疫排斥反应，因此ECCE细胞不同于其他的aAPC系统，能够应用于临床级别免疫细胞的制备。此外，ECCE细胞在进入CIK细胞培养体系前，经过100Gy伽马射线30分钟的灭活照射，因此，将ECCE细胞应用于制备临床级别的CIK细胞是安全的。

目前大多数的研究都尝试通过增加细胞因子（如IL-21等）刺激或通过与自体DC细胞共培养提高CIK细胞的增殖效率和杀伤活性，然而，对于经过放化疗、免疫功能低下的患者，其效果并不是很明显。利用aAPC激活免疫细胞，在制备临床级别的NK细胞、抗原特异性T细胞、γδT细胞有广泛的研究。本发明首次将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，明显增加了CIK细胞的增殖活性并提高了CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，有望扩大自体CIK细胞治疗肿瘤的临床应用范围并提高其疗效。

发明内容

本发明是为了解决传统CIK细胞培养个体差异大，无法获得足够数量高杀伤活性的CIK细胞的问题，提供一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，大大提高传统CIK细胞的增殖活性和细胞毒活性，为临床自体CIK细胞治疗肿瘤提供了一种新的高效的CIK细胞培养方法，我们将这种高效能的CIK细胞简称为ECCE-CIK细胞。本发明有望提高自体CIK细胞治疗肿瘤的疗效。

本发明采用的技术手段为：

一种ECCE-CIK细胞培养方法，包括如下步骤：

1）分离人外周血单核细胞（PBMC）；

2）制备PBMC细胞悬液；

3）激活PBMC；

4）培养激活后的细胞；

5）收集细胞；

步骤1）中所述的分离人PBMC是采用Ficoll密度梯度离心法。

步骤2）中所述的制备PBMC细胞悬液是用无血清淋巴细胞培养液将PMBC浓度调整到1.0*10⁶个/mL浓度接种于培养瓶中。

步骤2）中所述的无血清淋巴细胞培养液为：德国美天旎公司的TexMACSGMPMedium。

步骤3）中所述的激活PBMC的方法如下：

①在步骤2）制备的细胞悬液中加入IFN-γ（终浓度1000-2000U/mL）、经伽马射线灭活的ECCE细胞（终浓度为10⁵-10⁶个ECCE细胞/mL），置于37℃、5%CO₂、湿度100%培养箱内培养24小时；

②加入anti-CD3单克隆抗体（终浓度50-100ng/mL）、IL-2（终浓度300-1000U/mL），置于37℃、5%CO₂、湿度100%培养箱内继续培养；

步骤4）中所述的培养激活后的细胞是指根据细胞增殖的速度，每2-3天添加含有IL-2（终浓度300-1000U/mL）的无血清淋巴细胞培养液。

步骤5）中所述的收集细胞是指培养至14-21天后，1600转/分钟，4℃，离心5分钟，弃上清，用含有10%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）、90%（v/v）胎牛血清（FBS）的冻存液冻存细胞，置于液氮中保存。

步骤3）中所述ECCE细胞是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9（CD137L）的逆转录病毒感染K562细胞系，稳定表达CD137L分子，用于体外诱导CIK的人工抗原递呈细胞；

步骤3）中所述经伽马射线灭活的ECCE细胞按如下步骤制备：

①体外扩增ECCE：

RPMI-1640培养基加入10%（v/v）FBS、1%（v/v）青霉素、1%（v/v）链霉素配制完全培养基；将ECCE细胞按2.0*106的浓度接种于完全培养基，置于37℃、5%（v/v）CO₂、湿度培养箱内培养；根据细胞增殖的速度，每2-3天加入新鲜的完全培养基。

②伽马射线照射ECCE细胞：

将培养的ECCE细胞收集起来，用100Gy的伽马射线照射30min。

一种ECCE-CIK细胞制剂，包括由上述ECCE-CIK细胞培养方法培养得到的ECCE-CIK细胞。

本发明的有益效果：

与传统的CIK细胞培养技术相比，本发明的关键因素是在培养体系中引入了ECCE细胞。一方面，ECCE细胞表面的粘附分子ICAM-1(CD54)、LFA-1(CD58)及B7-H3等，能够增加ECCE与T细胞的相互作用。另一方面，ECCE细胞表面的CD137L与T细胞表面的CD137结合激活T细胞的协同刺激信号，促进T细胞的增殖及细胞因子的分泌。此外，CD137信号的激活还可以预防激活诱导的T细胞死亡、延长CD8⁺T细胞的生存时间并促进记忆性T细胞的分化。

本发明在传统CIK细胞培养方法的基础上，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，使ECCE-CIK细胞比传统CIK细胞增殖能力强、杀伤活性高，有望使更多的肿瘤患者能够从CIK细胞治疗获益并提高整体疗效。

附图说明

图1：动态监测CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞的增殖能力，#2号患者不同时间CIK细胞的增殖数目，如图所示ECCE能够明显提高CIK细胞的扩增速度。

图2：培养第21天，CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞平均扩增倍数（n=20），经配对t检验，p<0.01，差异具有明显的统计学意义，说明ECCE能够明显提高CIK的扩增倍数；

图3：不同效靶比时，CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞对肝癌细胞系SMMC7721的杀伤效率的流式检测结果，如图所示，当效靶比为40:1时，P6组CON-CIK细胞的杀伤效率是28.4%，E5P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是84.6%，E6P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是90.8%，说明ECCE能够明显增强CIK细胞对SMMC7721的杀伤作用；

图4：不同效靶比时，20组CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞对肝癌细胞系SMMC7721的平均杀伤效率，经配对t检验，p值均小于0.01，说明ECCE能够明显增强CIK细胞对SMMC7721的杀伤效率；

图5：CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞表型的变化：E6P6组CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD56^-CIK细胞明显增多（84.6±2.6%vs81.7±3.7%，P<0.05；54.3±4.2%vs44±3.5%，P<0.01），而CD3⁺CD56⁺明显降低（33.2±4.1%vs21.2±3.5%，P<0.01）。

图6：比较CON-CIK和ECCE-CIK组CIK细胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌情况，结果显示ECCE能够明显增强CIK细胞IFN-γ和TNF-α的分泌。

具体实施方式

实施例1经放射灭活的ECCE细胞的制备

1、ECCE细胞来源：

ECCE细胞由美国波特兰肿瘤研究中心胡红铭教授惠赠。ECCE细胞是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9（CD137L）的逆转录病毒感染K562细胞系，稳定表达CD137L分子的新型aAPC。

2、ECCE细胞的培养方法：

RPMI-1640培养基加入10%（v/v）FBS、1%（v/v）青霉素、1%（v/v）链霉素配制完全培养基；将ECCE细胞按2.0*10⁶的浓度接种于完全培养基，置于37℃、5%CO₂、湿度培养箱内培养；根据细胞增殖的速度，每2-3天加入新鲜的完全培养基。其中，所述的百分比为体积百分比。

3、ECCE细胞灭活的方法：

将培养的ECCE细胞收集起来，用100Gy的伽马射线照射30min。

实施例2ECCE-CIK细胞的培养方法

采用Ficoll密度梯度离心法分离晚期肿瘤患者（20人）外周血单核细胞（PBMC）；用无血清淋巴细胞培养液（德国美天旎公司的TexMACSGMPMedium）将PMBC浓度调整到1.0*10⁶个/mL浓度，将其等分为三份，分别接种于三个培养瓶中；第1天向瓶1细胞悬液中加入IFN-γ（1000U/mL，购自德国BoehringerIngelheim公司），设为传统CIK（CON-CIK）组，命名为P6组；向瓶2细胞悬液中加入IFN-γ（1000U/mL）、经放射灭活的ECCE（1.0*10⁵个/mL），设为ECCE-CIK组，命名为E5P6组；向瓶3细胞悬液中加入IFN-γ（1000U/mL）、经放射灭活的ECCE（1.0*10⁶个/mL），设为ECCE-CIK组，命名为E6P6组。三者均置于37℃、5%（v/v）CO₂、湿度100%培养箱内培养24小时；第2天再加入anti-CD3单克隆抗体（100ng/mL，购自德国美天旎公司）、IL-2（1000U/mL，购自德国Proleukin公司），置于37℃、5%（v/v）CO₂、湿度100%培养箱内继续培养；根据细胞增殖的速度，每2-3天添加含有IL-2（1000U/mL）的新鲜无血清淋巴细胞培养液，置于37℃、5%CO₂、湿度100%培养箱内培养14-21天，即得到CON-CIK细胞和ECCE-CIK细胞。

实施例3考察CON-CIK细胞和ECCE-CIK细胞的扩增效率和杀伤活性

1、动态监测CON-CIK和ECCE-CIK细胞的增殖能力：

不同时间点对三组CIK细胞进行计数，发现ECCE细胞能够明显增强CIK细胞的增殖能力，提高其扩增倍数，结果见图1和图2。图1显示的是2号患者不同时间点CON-CIK和ECCE-CIK细胞的增殖数量，图中可见E5P6和E6P6组CIK的增殖速度明显高于CON-CIKP6组。图2显示的是培养第21天20例患者CON-CIK和ECCE-CIK组的平均扩增倍数：其中P6组的扩增倍数为265.53±62.81，而E5P6组的扩增倍数为1175.43±94.18，E6P6组的扩增倍数为1924.76±158.55（经配对t检验，p<0.01，差异具有明显的统计学意义）。可见ECCE-CIK的增殖能力明显优于CON-CIK。

2、比较CON-CIK和ECCE-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力：

选择第14-21天的相配对的P6、E5P6、E6P6组CIK细胞，通过CFSE/PI（CarboxyfluoresceinDiacetate/Propidiumiodide）CON-CIK和ECCE-CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，具体方法如下：

1）以肝癌细胞系SMMC7721作为靶细胞。胰酶消化贴壁生长良好的SMMC7721，PBS洗一次；选取5*10⁶个SMMC7721细胞，重悬于含有1%FBS的PBS中，加入CFSE（终浓度2μM；购自Sigma-Aldrich公司），37℃、避光，染色10分钟；加入5mL预冷的含有10%FBS的RPMI1640培养基终止染色；4℃、1000rpm，离心5分钟；弃上清，用1mL含有10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞备用；

2）选择第14-21天的相配对的P6、E5P6、E6P6组CIK细胞做为效应细胞，分别以效靶比5:1、10:1、20:1、40:1将效应细胞和靶细胞进行混合培养4小时；

3）4℃、2000rpm，离心5分钟，弃上清，用1μLPI（购自Sigma公司）染色细胞沉淀1分钟；

4）用含有1%FBS的PBS冲洗细胞2次，4℃、2000rpm，离心5分钟，弃上清，500μL含有1%FBS的PBS重悬细胞；

5）流式检测CIK细胞对靶细胞SMMC7721杀伤作用（见图3）。

如图3所示，当效靶比为40:1时，P6组CON-CIK细胞的杀伤效率是28.4%，E5P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是84.6%，E6P6组ECCE-CIK细胞的杀伤效率是90.8%。20组CIK细胞分别做同样的检测，发现E6P6组杀伤能力最强，其次是E5P6组，P6组CIK细胞杀伤能力最弱，配对T检验p<0.01，差异具有明显的统计学意义（如图4）。这就说明ECCE-CIK细胞比CON-CIK细胞杀伤肿瘤细胞能力强。

3、分析两组CIK细胞的表型：

流式细胞术分别检测培养第21天的P6组CON-CIK和E6P6组ECCE-CIK细胞的表型。分别用抗体CD3-allophycocyanin、CD4-fluoresceinisothiocyanate、CD8-Peridininchlorophyllprotein和CD56-Phycoerythrin-Cy7（所有抗体均购自BD公司）对两组CIK进行染色，上流式进行检测，结果如图5所示：E6P6组CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD56^-CIK细胞明显增多（84.6±2.6%vs81.7±3.7%，P<0.05；54.3±4.2%vs44±3.5%，P<0.01），而CD3⁺CD56⁺明显降低（33.2±4.1%vs21.2±3.5%，P<0.01）。

4、比较两组CIK细胞因子分泌情况：

ELISA检测两组CIK细胞上清中IFN-γ和TNF-α的分泌情况，具体方法如下：

1）分别将P6和E6P6组CIK细胞与SMMG7721细胞以40:1的效靶比混合培养4小时；

2）4℃、2000rpm，离心5分钟，收集上清；

3）参照ELISA试剂盒（购自R&D公司）中操作说明书，完成实验。

结果如图6所示，ECCE能明显增强CIK细胞IFN-γ和TNF-α分泌。

Claims

1.一种ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）分离人外周血单核细胞；

2）制备PBMC细胞悬液；

3）激活PBMC；

4）培养激活后的细胞；

5）收集细胞；

所述步骤3）激活PBMC的方法为：在步骤2）制备的PBMC细胞悬液中加入IFN-γ、ECCE细胞，培养；然后再加入anti-CD3单克隆抗体、IL-2继续培养。

2.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤3）中加入IFN-γ使其终浓度为1000-2000U/mL，加入ECCE细胞至其终浓度为10⁵-10⁶个ECCE细胞/mL。

3.权利要求1所述的ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，所加入的ECCE细胞经伽马射线灭活，所述伽马射线灭活为用100Gy的伽马射线照射ECCE细胞30min。

4.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤3）中anti-CD3单克隆抗体终浓度50-100ng/mL、IL-2终浓度300-1000U/mL。

5.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤3）中所述培养条件为：培养温度37℃、CO₂体积浓度为5%、湿度100%。

6.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤1）中所述的分离人外周血单核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法。

7.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤2）中所述的制备PBMC细胞悬液是用无血清淋巴细胞培养液将PMBC浓度调整到1.0*10⁶个/mL浓度接种于培养瓶中。

8.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤4）中所述的培养激活后的细胞是指根据细胞增殖的速度，每2-3天添加含有IL-2的无血清淋巴细胞培养液，IL-2终浓度为300-1000U/mL。

9.根据权利要求1所述ECCE-CIK细胞培养方法，其特征在于，步骤5）中所述的收集细胞是指培养至14-21天后，离心，弃上清，用冻存液冻存细胞，置于液氮中保存。

10.一种ECCE-CIK细胞制剂，包括由权利要求1至9中任意一项所述ECCE-CIK细胞培养方法培养得到的ECCE-CIK细胞。