CN105384753A - 一种用于神经保护的柠檬苦素化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于神经保护的柠檬苦素化合物，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物，可以从干燥的枳壳中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物具有减轻Aβ25-35诱导海马神经元细胞毒性损伤的作用，对Aβ25-35诱导胎鼠海马神经元损伤具有神经保护作用，可以用来开发成神经保护的药物。

Description

一种用于神经保护的柠檬苦素化合物
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从干燥的枳壳中分离得到的一种柠檬苦素类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
枳壳为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。味苦、辛、酸。性微寒。归脾、胃经。具有理气宽中，行滞消胀之功效。用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂。枳壳是中药典型的理气药之一，广泛应用于中医临床。
枳壳所含化学成分较为复杂，目前已知的有效成分主要有黄酮类、挥发油类、生物碱类、香豆素类和一些微量元素等。枳壳中黄酮类成分主要有：橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、柚皮芸香苷、异柚皮苷、陈皮素、柚皮素、川陈皮素、红橘素、5-O-去甲基川陈皮素、去甲川陈皮素、橙黄酮、4',5,7,8-四甲氧基黄酮、4-O-甲基黄芩素、3-羟基-3',4',5,6,7,8-六甲氧基黄酮和5,6-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮等。挥发油主要有柠檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、γ-松油烯。枳壳中所含的生物碱类活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麦芽碱等。枳壳中所含的香豆素类成分主要有葡萄内酯、伞形花内酯、异前胡素、马明丙酮化合物、泼朗弗林、异米拉素、花椒毒酚、5-异戊烯氧基线呋喃香豆素、5-甲氧基线呋喃香豆素等。
枳壳中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎镇痛、降血糖等作用；川陈皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等药理作用；川陈皮素具有很好的抗肿瘤的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠学习记忆障碍、抗血小板聚集的作用。枳壳挥发油的主要成分是柠檬烯。在临床上，柠檬烯胶囊已上市，主要用于胆囊炎、胆管炎、胆结石和胆道术后综合征等的治疗。在枳壳挥发油中，另一重要成分为芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和镇静等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从干燥的枳壳中分离得到的一种柠檬苦素类化合物，含其的药物组合物及其制备方法和应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将干燥的枳壳粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、50:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤(a)中，用75％乙醇热回流提取，合并提取液。
进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备神经保护的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)计算ECD和实验ECD图；
图3为化合物(Ⅰ)对培养不同时间海马神经元细胞活力的影响；
图4为化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导海马神经元细胞活力的影响；
图5为化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导的海马神经细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
主要材料、试剂来源及仪器类型：
乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
(a)干燥的枳壳(10kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(30L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(6L)，依次用石油醚(6L×3次)、乙酸乙酯(6L×3次)和水饱和的正丁醇(6L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(381g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物(131g)；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积)、50:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、10:1(10个柱体积)和1:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1(8个柱体积)、10:1(8个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(18g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(230mg)。
结构确证：白色无定形粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z605.2014，结合核磁特征可得分子式为C31H34O11，不饱和度为15。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，400MHz)：H-3(4.99，s)，H-5(2.88，t，J＝6.7)，H-6(2.23，dd，J＝6.7)，H-6(2.01，dd，J＝6.7)，H-11(6.27，s)，H-14(1.73，dd，J＝12.3，6.9)，H-15(2.67，dd，J＝18.4，6.9)，H-15(2.98，dd，J＝18.4，12.3)，H-17(5.06，s)，H-18(0.95，s)，H-19(1.19，s)，H-21(7.26，br，s)，H-22(6.18，br，s)，H-23(7.33，t，J＝1.7)，H-28(0.81，s)，H-29(0.73，s)，H-30(2.61，s)，H-2’(5.89，dq，J＝15.5，1.7)，H-3’(7.09，dq，J＝15.5，7.0)，H-4’(1.92，dd，J＝7.0，1.7)，8-OH(3.95，br，s)，7-OCH3(3.61，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，100MHz)：209.4(C，1-C)，72.1(C，2-C)，84.2(CH，3-C)，38.7(C，4-C)，46.9(CH，5-C)，30.6(CH2，6-C)，172.7(C，7-C)，70.3(C，8-C)，162.5(C，9-C)，50.6(C，10-C)，126.3(CH，11-C)，202.7(C，12-C)，57.9(C，13-C)，38.7(CH，14-C)，28.6(CH2，15-C)，169.0(C，16-C)，81.2(CH，17-C)，22.6(CH3，18-C)，13.9(CH3，19-C)，121.2(C，20-C)，140.1(CH，21-C)，108.8(CH，22-C)，143.1(CH，23-C)，19.7(CH3，28-C)，23.2(CH3，29-C)，63.8(CH，30-C)，164.6(C，1’-C)，120.7(CH，2’-C)，147.5(CH，3’-C)，18.1(CH3，4’-C)，51.7(CH3，7-OCH3)；碳原子标记参见图1。红外光谱显示该化合物含有羟基和羰基基团(3436cm-1和1732cm-1)。该化合物在231nm处有紫外吸收带，说明含有α,β-不饱和酮羰基基团。1H和13CNMR数据的分析表明该化合物为柠檬苦素类化合物，包含四个叔甲基，一个甲氧基，一个三取代的环氧乙烷，一个2-丁烯酸乙酯基团，一个α,β-不饱和羰基，一个酮羰基，两个酯羰基以及一个β-取代呋喃环。HMBC谱中，Me-19(δH1.19，s)和H-30(δH2.61，s)与C-1(δC209.4)的相关性表明C-1为酮羰基。两个碳信号(δC72.1，2-C；63.8，30-C)以及质子信号(δH2.61，s，H-30)表明该化合物含有一个30,2-环氧基团。此外，C-3(δC84.2)位上连有一个2-丁烯酸乙酯结构。HMBC谱中，H-3(δH4.99，s)，H-2’(δH5.89，dq，J＝15.5，1.7)和H-3’(δH7.09，dq，J＝15.5，7.0)与C-1’(δC164.6)的相关性验证了上述推论。烯烃质子H-2’和H-3’之间的耦合常数(J＝15.5Hz)表明2-丁烯酸乙酯结构为E构型。HMBC谱中，-OCH3(δH3.61，s)与C-7(δC172.7)，H-6(δH2.23，dd，J＝6.7Hz；2.01，dd，J＝6.7Hz)与C-5(δC46.9)和C-7的相关性表明C-6(δC30.6)连有一个甲氧羰基片段。根据HMBC谱中H-17(δH5.06，s)与C-20(δC121.2)，C-21(δC140.1)和C-22(δC108.8)的相关性，可推断呋喃环位于C-17位上。ROESY谱中，H-5与Me-29，以及H-5与H-17的相关性表明这些质子为β构型。此外，H-14与Me-18的交叉峰表明Me-18和H-14是α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
健康雌性SD大鼠由上海第二军医大学实验动物中心提供。化合物(Ⅰ)制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。二甲基亚砜、银杏提取物(EGb761，阳性药)、MTT、Aβ25-35、L-多聚赖氨酸均购于美国SIGMA公司。DMEM高糖培养基、Neurobasal、B27购于美国GIBCO公司。NSE购于英国ABCOM公司。Tunel购于武汉Boster公司。LDH试剂盒购于南京建成生化试剂公司。
电子天平，北京赛多利斯。1815TCCO2恒温孵育箱(美国Shel-Lab公司)，TH-2C恒温震荡器(江苏太仓实验设备厂)，解剖显微镜(日本OLYMPUS公司)，台式离心机(德国Heraeus公司)，酶标仪(日本DynaTtech公司)，J2-HS全自动高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。
二、试验方法
1、海马神经细胞的原代培养
1.1海马组织取材的具体过程
(1)将16-18d孕龄的健康雌性SD大鼠常规麻醉并消毒，解剖后取出胎鼠，放入D-Hank’s平衡盐溶液中。
(2)将其放置于解剖显微镜下缓慢剥离胎鼠的头部皮肤与颅骨，然后看到暴露的大脑双侧半球。
(3)于大脑半球外侧面小心分离脑膜和大脑皮层，即可见海马组织。
(4)用解剖镊小心夹取海马组织，将其放于D-Hank’s平衡盐溶液中反复漂洗三遍，彻底去除脑膜和表面血管。
(5)分离血丝和脑膜，即得海马组织，用于海马神经细胞的原代培养。
1.2海马神经细胞原代培养的具体过程
(1)将所取得的海马组织用眼科剪充分剪碎。
(2)用浓度为0.125％的胰酶消化25min，然后用含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基完全培养液终止消化。
(3)于离心机中以800rpm的速度离心10min。
(4)弃去上清并加入培养基(NeurobasalMedium/B27)后，用尖端已被火焰抛光的弯头吸管缓慢的吹打，反复吹打直至吹打均匀后，静置5min，所得的上液即为所需的海马神经细胞悬液。
(5)用计数板计数，按所需细胞密度分别植入预先包被L-多聚赖氨酸的96孔板或6孔培养板中。其中96孔培养板中每孔约100μL，6孔培养板中每孔约1.5mL。
(6)放入37℃的CO2孵育箱中，培养3d后用于实验。
2、化合物(Ⅰ)最佳效应时间和最佳作用浓度的筛选
设计如下七组分组：①10μg/mL组；②20μg/mL组；③40μg/mL组；④60μg/mL组；⑤80μg/mL组；⑥100μg/mL组；⑦0μg/mL组(即空白对照组)。将化合物(Ⅰ)各剂量组分别作用24h，48h和72h，分别每孔加入二甲基亚砜100μL，充分溶解后，在波长为570nm的全自动酶标仪下观察并测定其光密度值(OD值)，取光密度最高处的药物浓度及对应的作用时间作为本实验筛选的化合物(Ⅰ)的最佳作用条件。采用MTT比色法进行最佳作用条件的筛选。
3、化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导损伤情况下海马神经元的影响
采用已配制好在37℃下聚合7d的Aβ25-35建立海马神经细胞损伤的模型。实验分组如下：A：空白对照组Control组，B：Aβ组，C：化合物(Ⅰ)+Aβ组，D：化合物(Ⅰ)+I(inhibitor)+Aβ组(在化合物(Ⅰ)+Aβ组基础上加入BDNF的拮抗剂K252a)，E：EGB+Aβ组，F：化合物(Ⅰ)组，G：EGB组；海马神经细胞原代培养3d后，在培养液中加入25μg/mL的Aβ25-35，4h后再按照分组分别给药。
3.1化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导海马神经元细胞毒性的影响
3.1.1MTT比色法检测海马神经细胞活力的步骤
(1)将海马神经细胞原代培养3d后，分别加入化合物(Ⅰ)：40μg/mL，EGb761：150μg/mL及空白对照组什么都不加。48h后进行MTT比色法。
(2)分别在96孔板中每孔加入配制好的MTT10μL。
(3)将其置于37℃的CO2培养箱中孵育4h。
(4)缓慢吸去上清后每孔加入100μL的二甲基亚砜作用10min，使之充分溶解。
(5)在波长为570nm的全自动酶标仪下测定每孔的光密度值。
3.2化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导的海马神经细胞凋亡的影响
3.2.1实验分组
通过检测海马神经细胞凋亡过程中的关键蛋白酶Caspase-3的活性，观察化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡的影响。实验共分为七个组：A：Control组，B：Aβ组，C：化合物(Ⅰ)+Aβ组，D：化合物(Ⅰ)+I+Aβ组，E：EGB+Aβ组，F：化合物(Ⅰ)组，G：EGB组。
3.2.2实验步骤
(1)按分组分别给予药物48h后，小心收集细胞并以400rpm的转速离心5min后，吸弃上清。
(2)将海马神经细胞重悬于裂解缓冲液中，放置于冰上孵育10min。
(3)4℃离心机离心，细胞碎片去除，收集上清(胞浆提取液)并转移至新的离心管中。
(4)将离心管放于冰上，缓慢加入含二硫苏糖醇的反应缓冲液。
(5)给每个离心管加中加入caspase-3底物1mM，于37℃水浴中孵育60min。
(6)将96孔板放置于酶标仪内，用双蒸水调零，调节检测波长为405nm，仪器分析并记录光密度值。
4、统计学分析
统计学分析采用SPSS10.0软件包，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，实验数据采用方差分析和Fisher'sPLSD检验。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
三、结果及结论
1、海马神经元的原代培养
观察培养的海马神经细胞，发现当接种6-12h的时候，海马神经细胞开始贴壁，细胞突起生长明显，当海马神经细胞生长到第3d时，细胞体的生长状态最佳，未见神经细胞的退化与空泡形成。
2、化合物(Ⅰ)最佳效应时间和最佳作用浓度的筛选(MTT比色法)
将化合物(Ⅰ)各剂量组分别作用24h，48h和72h，观察其光密度的改变，取光密度最高处对应的药物浓度及时间做为筛选的化合物(Ⅰ)的最佳作用浓度和效应时间。
如图3可见，48h各组海马神经元的细胞活力明显优于24h和72h各组。24h，48h及72h各组海马神经元的细胞活力均以40μg/mL组的细胞活力为最佳。所以，筛选出的化合物(Ⅰ)最佳作用浓度为40μg/mL，最佳效应时间是48h。
3、化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导损伤情况下海马神经元的影响
3.1化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导海马神经元细胞毒性的影响
各组药物分别作用48h以后，观察化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导的海马神经元细胞活力的影响。
如图4可见，当给予Aβ25-35造模后，Aβ组海马神经元细胞活力较空白组细胞活力明显下降(P＜0.01)，这说明神经损伤模型造模成功；通过对各给予Aβ25-35组的比较发现，化合物(Ⅰ)+Aβ组较Aβ组细胞活力显著增加(P＜0.01)；化合物(Ⅰ)+Aβ组与EGB+Aβ组比较无明显统计学意义(P＞0.05)；当加入拮抗剂后，细胞活力介于化合物(Ⅰ)+Aβ组和Aβ组之间(P＜0.05)；这说明化合物(Ⅰ)可以减轻Aβ25-35诱导的神经细胞毒性。
3.2化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导的海马神经元凋亡的影响
在Aβ25-35诱导的海马神经细胞损伤的情况下caspase-3活性被激活。OD值越高表明海马神经细胞凋亡程度越高。实验结果显示，当海马神经细胞受损的情况下caspase-3活性被激活，所以caspase-3活性会显著增加，细胞凋亡的程度增高。图5中可见，Aβ组较空白对照组caspase-3活性明显增加(P<0.01)，这说明神经损伤模型造模成功；而化合物(Ⅰ)+Aβ组较Aβ组细胞外caspase-3活性显著下降(P<0.01)；当加入拮抗剂后，caspase-3的活性介于化合物(Ⅰ)+Aβ组和Aβ组之间(P<0.05)；化合物(Ⅰ)+Aβ组和EGB+Aβ组差异不明显(P﹥0.05)；这说明化合物(Ⅰ)对损伤情况下的海马神经元有显著的抗Aβ25-35诱导的凋亡作用。
本试验从不同角度多个层面探讨了化合物(Ⅰ)对Aβ25-35诱导胎鼠海马神经元损伤的神经保护作用。首先发现当化合物(Ⅰ)浓度为40μg/mL且作用时间为48h时，海马神经细胞形态学及细胞活力最佳，进行了MTT比色法发现化合物(Ⅰ)对正常情况下海马神经细胞具有促进生长的作用；然后，通过细胞活力检测发现化合物(Ⅰ)还具有减轻Aβ25-35诱导海马神经元细胞毒性损伤的作用。接着，通过对凋亡相关蛋白酶检测也证实了化合物(Ⅰ)对损伤情况下的海马神经元有显著的抗Aβ25-35诱导的凋亡作用。化合物(Ⅰ)的作用与阳性药银杏叶提取物EGb761相似。
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)：
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将干燥的枳壳粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、50:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用75％乙醇热回流提取，合并提取液。
4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备神经保护的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。
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