CN105368959A - Anxa10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及ANXA10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用。所述的分子标记由ANXA10基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：2所述。在序列表SEQ？ID？NO：2的第275bp处有1个C275-T275的碱基替换，该突变导致Dpn？I-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增ANXA10基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

ANXA10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体涉及一种ANXA10基因作为绵羊免疫性状相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记克隆自ANXA10基因。
背景技术
在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
长远来看，从抗病力的遗传基础研究出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决这一问题的重要途径。抗病育种潜在的巨大经济效益以及某些疾病可作为研究人类疾病动物模型的诱人前景，正有力地推动着这项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基因有以下几个：
(1)天然抗性巨噬结合蛋白1(Naturalresistance‐associatedmacrophageprotein1，Nramp1)，Nramp是一个基因家族，是目前研究较多的宿主抗性基因之一，至少包括2～3个成员，现已发现有Nramp1和Nramp2。国内外学者对Nramp1基因与抗病力的相关性进行了大量的研究，把Nramp1基因作为功能基因研究其结构与动物抗病性状的报道也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上(陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nramp1基因抗病作用的研究进展.畜牧与饲料科学，2012，33(7)∶79‐81.)。绵羊的Nramp1基因定位在1号染色体2q41‐q42的区域(PitelF.E.P.Cribiu，M.Yerle，etal.RegionallocalizationoftheovineNRAMPgenetochromosome2q41‐q42byinsituhybridization.CytogenetCellGenet，1995，70(1‐2)：116～118.)，山羊的Nramp1基因定位于2号常染色体上长臂q12.2(VaccaG.M.M.Pazzola，C.Pisano，etal.ChromosomallocalisationandgeneticvariationoftheSLC11A1geneingoats(Caprahircus).VetJ，2011.190(1)：60～65.)。研究发现，绵羊Nramp1基因多态性与伤寒沙门氏菌易感性和抗性有关(姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医杂志，2014,44(5)：40～43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大(吴宏梅等，NRAMPl基因研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005，32(4)：26～28.)。
(2)主要组织相容性复合物(MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研究成为家畜抗病育种研究中的前沿部分(孙东晓，张沅.反刍家畜主组织相容性复合物的研究进展.中国畜牧杂志，2002，38(5)：46～47.)。绵羊的MHC称为OLA(绵羊白细胞抗原)，位于第20号染色体上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分为classⅠ型classⅡ型和classⅢ型。一般认为绵羊MHCclassⅡ的多态性和遗传性是为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，OLAⅡ类分子的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区(抗原结合区)具有丰富的多态性，它组成Ⅱ类抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研究才能应用于家畜的遗传标记。
此外，其它有研究的与抗病力有关的基因是TLR(Toll‐likereceptor，Toll样受体)MX1(Myxovirus(influenza)resistance1，粘液病毒(流感)抗性因子1)、IL1(Interleukins1，白细胞介素1)、PPARG(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。
膜联蛋白(Annexins，ANX)是一类钙依耐性，能够结合带负电荷膜磷脂的蛋白超家族，与20世纪70年代末发现广泛存在真核细胞中，分为A、B、C、D、E、组，其中A组对应脊椎动物中的ANX，有13个成员，即ANX1‐13(PrasadNB,BiankinAV,FukushimaN,etal.GeneexpressionprofilesinpancreaticintraepithelialneoplasiareflecttheeffectsofHedgehogsignalingonpancreaticductalepithelialcells.CancerRes,2005,65(5):1619‐26.vanBaalJW,MilanoF,RygielAM,etal.AcomparativeanalysisbySAGEofgeneexpressionprofilesofBarrett'sesophagus,normalsquamousesophagus,andgastriccardia.Gastroenterology,2005,129(4):1274‐81.YehSH,ChenPJ,LaiMY,etal.Alleliclossonchromosomes4qand16pinHepatocellularcarcinoma:associationwithelevatedalpha‐fetoproteinproduction.Gastroenterology1996,110:184‐192.)。目前已有研究发现膜联蛋白超家族各成员与肿瘤的发生发展有着紧密的联系。相关研究发现在乳腺癌和肝细胞癌中ANXA1过度表达(BandoK,NagaiH,MatsumotoS,etal.Identificationofa1‐cMregionofcommondeletionon4q3assciatedwithprogressionofhepatocellularcarcinama.GenesChromosomCancer1999,25:284‐289.WongN,LaiP,LeeSW,etal.Assessmentofgeneticchangesinhepatocellularcarcinomadetectedbycomparativegenomichybrizationshiptodiseasestage,tumorsize,andcirrhosis.AmJPathol1999,154:37‐43.)，在大脑神经胶质瘤和胰腺癌中ANXA2高表达(PengSY,OuYH,ChenWJ,etal.AberrantexpressionsofannexinA10shortisoform,osteopontinandalpha‐fetoproteinatchromosome4qcooperativelycontributetoprogressionandpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma.IntJOncol2005,26(4):1053‐61.)、在急性早幼粒细胞性白血病中ANXA8高表达(彭小东，肖恭卫，刘小辉，等.膜联蛋白A10与基质金属蛋白酶‐9、血管内皮生长因子VEGF在人肝癌组织中表达的相关性及与临床病理特征的关系.中华实验外科杂志，2010，27(12)：1844‐1846.)，ANXA1的过度表达与乳腺癌的潜在转移性呈正相关(LIUXiao‐hui，PENGXiao‐dong.EffectsofOver‐expressionofANXA10GeneonProliferationandApoptosisofHepatocellularCarcinomaCellLineHepG2.JHuazhongUnivSciTechnol.2012,32(5):669‐674.)，并且促进裸鼠皮下移植瘤瘤体生长(HsuHC,JengYM,MaoTL,etal.CateninmutationsareassociatedwithasubsetoflowstagehepatocellularcarcinomanegativeforhepatitisBvirusandwithfavorableprognosis.AmJPathol2000,157:763‐770.)。膜联蛋白A10基因(ANXA10)是膜联蛋白(annexins)家族的新成员，定位于4号染色体长臂33区，其功能尚不明确(陈红，曹丽华，王述森，等.遗传性弥漫性胃癌相关基因表达及突变分析.解剖科学进展，2010,16(3):193‐196.)。Liu等应用RT‐PCR检测原发性肝癌患者癌组织的ANXA10mRNA表达，在成人肝和肝细胞癌中有表达，在多个成人、胎儿组织、胆管细胞癌和其他肿瘤中不表达，在182例单病灶的原发性肝癌患者中有121例癌组织中ANXA10mRNA表达急剧下调，并且这种下调与P53基因突变、早期肝内肿瘤复发以及低的4年生存率有关，ANXA10在大肝癌中表达下调的幅度更大，是小肝癌的两倍，II、III级肝癌比I级肝癌表达下调幅度大，IIIA、IV级肝癌比I、II级肝癌表达下调幅度大，且ANXA10表达的下调和P53的突变的协同作用暗示着肝癌的分期更高，预后更差；结果显示ANXA10在肝脏中有表达并且其表达有一定的组织特异性，它可能是肝细胞分化和生长停止的标记，ANXA10的下调和肝癌细胞的恶性表型、血管侵袭以及肿瘤进展有关(KimJ,KimMA,JeeCD,etal.ReducedexpressionandhomozygousdeletionofannexinA10ingastriccarcinoma.Int.J.Cancer，2009，125,1842–1850.)。目前在绵羊上尚未发现有关ANXA10对免疫性状调控影响的研究报道。
通过以上资料我们可以得出ANXA10基因参与动物肿瘤等疾病的发生和免疫调控。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊ANXA10基因完整cDNA序列的克隆和SNP筛查、检测及与免疫性状关联分析。
发明内容
本发明的目的在于克隆绵羊ANXA10基因的完整cDNA序列，寻找ANXA10基因的突变位点以及基因的多态性的检测方法，建立一种非诊断目的的适用于绵羊免疫性状的分子标记，筛选方法方法及在关联分析中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
从绵羊ANXA10基因片段中克隆得到一种非诊断目的的绵羊免疫性状相关的分子标记，它的完整cDNA序列如序列表SEQIDNO：1和图1所示，它的部分DNA序列如序列表SEQIDNO:2和图2所示。在SEQIDNO：2所示序列的第275位碱基处有一个C/T碱基突变，该突变位于第3外显子内，导致DpnI‐RFLP多态性。
申请人设计了一对克隆绵羊ANXA10基因完整cDNA的引物序列，扩增得到的完整cDNA序列如SEQIDNO：1所述。同时申请人设计了一对包含第3外显子的用于扩增绵羊ANXA10基因组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQIDNO：2所述。
申请人提供了一种筛选上述分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：
以成年湖羊瘤胃、脾脏、肾脏等组织总RNA为模板，进行RT‐PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQIDNO：1所述cDNA序列；从绵羊血液基因组中提取DNA，设计引物(该引物的序列为：正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG，反向引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG)，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。通过序列比对，筛查SNP，再利用上述引物的序列：正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG，反向引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行DpnI酶切分型及检测。
应用常规的PCR‐RFLP的方法对序列表SEQIDNO：2的第275位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
附图说明
序列表SEQIDNO：1是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA序列。序列长度为1101bp。其中第262‐262bp处为等位基因突变。
序列表SEQIDNO：2是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因ANXA10用于PCR‐RFLP部分DNA序列(即本发明筛选的分子标记序列)。序列长度为345bp。其中第275‐275bp处为等位基因突变(C/T碱基替换)。
序列表SEQIDNO：3是扩增绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA序列的正向引物。
序列表SEQIDNO：4是扩增绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA序列的反向引物。
序列表SEQIDNO：5是扩增本发明筛选的分子标记的正向引物。
序列表SEQIDNO：6是是扩增本发明筛选的分子标记的反向引物。
图1：是本发明中绵羊ANXA10基因用于克隆的cDNA片段。序列长度为1101bp。该序列的下划线部分是设计的引物。
图2：是本发明中绵羊ANXA10基因用于PCR‐RFLP检测的DNA片段。序列长度为345bp。该序列的下划线部分是设计的引物。
图3：是本发明中绵羊ANXA10基因用于克隆的cDNA片段的凝胶电泳图。附图标记说明：1‐7泳道为ANXA10基因1101bp的片段；M泳道为DNA分子量标准(DL2000ladder)。
图4：是本发明中绵羊ANXA10基因用于PCR‐RFLP检测的DNA片段的凝胶电泳图。附图标记说明：1‐6泳道为ANXA10基因345bp的片段；M泳道为DNA分子量标准(DL2000ladder)。
图5：是本发明中绵羊ANXA10基因DpnI‐RFLP的三种基因型(TTCCCT)电泳结果。附图标记说明，图中：1泳道为CT；2‐6,8泳道为CC；7泳道为TT；M泳道：DNA分子量标准(DL2000ladder)。
图6：是本发明中绵羊ANXA10基因第3外显子筛查SNP位点测序峰图(反向互补链测序，正向应为C/T突变)。
具体实施方式
实施例1、ANXA10基因的克隆
(1)引物序列设计
根据绵羊ANXA10基因序列(GenBank收录号：XM_012159138.1)，利用Primer5.0软件设计一对引物M‐F和M‐R，具体的DNA序列如下：
ANXA10：M‐F：5＇‐TTGAGTTCTTTCTAGGGACA‐3＇，(即：SEQIDNO:3所示的序列)；
M‐R：5＇‐GACGGCATACTCCAGGTT‐3＇；(即：SEQIDNO:4所示的序列)。
(2)PCR产物的克隆和测序
将纯化后的PCR产物与pMD‐18T载体(购自宝生物工程大连有限公司)在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100～120μL感受态细胞于1.5mLEpendorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3～4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于异丙基硫代－β‐D－半乳糖苷(IPTG)X‐gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2－3mLLB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mLEP管12000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成，得到一条长度为1101bp的cDNA序列(见SEQIDNO：1所述)。
DNA序列同源性检索鉴定：
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，NationalCenterforBiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊ANXA10基因cDNA(GenBank收录号：XM_012159138.1)的部分序列同源性达100％。
实施例2、PCR‐RFLP诊断方法的建立
(1)、引物序列设计
ANXA10:M‐F：5＇‐GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG‐3＇，(即：SEQIDNO:5所示的序列)；
M‐R：5＇‐CAGAAGTTCGCATGGAAACG‐3＇；(即：SEQIDNO:6所示的序列)。
(2)PCR扩增条件
PCR反应总体积20μL，其中绵羊基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，58℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到345bp特异扩增片段，该片段位于第3外显子(如图2)。测序的结果发现在该345bp片段中存在一个DpnI酶切位点(GA↓TC)，其中第273bp处为多态性切点，位于第3外显子中(见图3)。
(3)PCR‐RFLP检测条件
PCR产物酶切反应体积是10μL，其中1×buffer1μL，PCR产物3～5μL，限制性内切酶DpnI为0.3μL(10U)，用H2O补足至10μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子测序结果显示，当第275bp位置为T时，则该DpnI酶切位点不存在，DpnI酶切后只有1个片段，长度是375bp(定为等位基因T)；但存在T275→C275的替换时，其结果导致第275bp处一个DpnI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为273bp和72bp(定为等位基因C)，三种基因型TT、CC和CT如图4所述。
(4)本发明的分子标记在绵羊免疫性状标记性状关联分析中的应用
试验共检测了132只湖羊和49只湖杜湖羊(湖♂×(杜泊羊♂×湖羊♀)♀)的多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状(白细胞计数(WBC)，红细胞计数(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，血小板计数(PLT)，红细胞分布宽度(RDW)，血小板体积分布宽度(PDW)，平均血小板体积(MPV)，血小板压积(PCT))的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijlk＝μ+Genotypei+Breedi+Sexl+Pk+Combinationm+εijlkm
其中，Yijkl是性状观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Breedj为品种效应，Sexl为性别效应，Pk为批次效应，Combinationm为组合的效应，εijlmk为随机误差，假定εijlmk相互独立，服从N(0，σ2)分布。基因型检测结果表明在181个个体中TC基因型有50个，CC基因型有130个个体，TT型个体只有1个，在进行基因型与性状关联分析时提出TT型个体。基因型与性状关联分析的结果是：ANXA10基因与平均红细胞血红蛋白浓度呈显著相关。
表1绵羊ANXA10基因g.275C>TDpnI酶切位点的多态性与部分免疫性状的关联分析
由表1可知，ANXA10基因SNP位点对红细胞计数有显著影响(P<0.05)，其中CC基因型个体的平均红细胞计数显著高于TC基因型个体的对应值。

Claims (5)

1.一种用于非诊断目的的与绵羊免疫性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如下所示：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGGGGAGACAGAAGGCACCTCGGCCACGGCAGGGGTACCCTGAAACTTCCACTCAAGCTGGGCCTTCTCCCTCCACTGAGAACACCAGGGGACGAGCTGGCCCACTGGCCTGACCGCTGCACCGTGGGCCCTCCCTACCTGCAGCGTGGCACTCACAGCACTCACTCACTCGCCGACACAACTCTCTTCCAGGCTGTGACAAGGACCTGCTGATTGACATCCTGACCCAGCGCTGCAACACCCAGAGGCTGCTGATYGCCGAGGCTTACCTGGGTGCCTTCAGCCGGGTGAGCCCCCCAACCCCTCTCGTTTCCATGCGAACTTCTG
上述序列第275bp处的Y是C或T，该突变导致PCR-DpnI-RFLP多态性。
2.一种检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，其特征在于，该引物对的序列如下所示：
正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG，
反向引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG。
3.一种筛选与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:
从绵羊湖羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊ANXA10基因突变位点附近设计一对引物对，该引物对的序列如权利要求2所示，对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如SEQIDNO：2所示的序列，通过序列比对，筛查SNP，再利用权利要求2所示的引物对进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行DpnI酶切分型及检测。
4.权利要求1所述的分子标记在绵羊免疫性状体外检测中的应用。
5.权利要求2所述的PCR引物对在绵羊免疫性状体外检测中的应用。
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