CN105368925A - 用于肺癌预后的生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肺癌预后的生物标志物。本发明人通过分析来自多个国家的总计2738例肺癌的基因表达芯片(GEP)数据,采用统计学分析方法,从中筛选出95个肺癌预后特异性基因,其中有85个基因为首次报道与肺癌的生存概率及术后复发概率相关。对所述95个基因进一步进行单因素分析、多因素分析和生存曲线分析,最终更精确地筛选出有代表性的7个基因。经多个国家肺癌临床数据检验证明,这些特异性的基因标志物可非常有效地用于预测肺癌患者的生存和复发率,可据此将患者划分为低、中和高风险组。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌预后领域,主要是肺癌生存概率和术后复发概率预测。更具体地,本发明涉及用于肺癌预后的生物标志物及其用途。
背景技术
根据世界最权威的医学杂志CA:ACancerJournalforClinicians(2013;63:11-30)报道,美国2013年肿瘤新发病例高达166万,死于肿瘤的人数为58万。其中肺癌的病死率排在第一位,每年有16万3千人死于肺癌,每年新发生的肺癌病例亦高达24万6千。按美国3.1亿人口每年新发生的肺癌病例24万6千估算,中国13.8亿人口每年新发生的肺癌病例数应为109万5千。
《2012中国肿瘤登记年报》表明,中国每年新发癌症病例约312万,因癌症死亡超过200万。中国人患病最多的癌症分别为肺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌,死亡最多的癌种亦是肺癌。过去30年间,肺癌死亡率在中国上升了465%,已取代肝癌成为中国首位恶性肿瘤死亡原因。按中国13.8亿人口发病率为51.71每十万人计算,中国每年新发生的肺癌病例数为71万4千。此数低于109万5千,有可能出现了部分漏诊,尤其在农村地区。
据世界卫生组织统计,2008年的癌症死亡人数高达760万(约占所有死亡人数的13%),其中肺癌(137万例死亡)亦排在第一位。
肺癌可分为小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌。非小细胞性肺癌占全部肺癌的85%以上,包括腺癌(ADC),鳞状细胞癌(SCC)和大细胞肺癌(LC)等。肺癌的发病与预后机制复杂,涉及多个基因与环境因素共同作用。其治疗方案通常包括手术,加术后化疗(ACT)或放射治疗(ART)。但对不同患者采取何种方式更好,术后是否加化疗,医生缺乏有效的根据。其后果是给很多患者带来了过度的不恰当的治疗,既增加了很多副作用,又增加了患者不必要的额外的经济负担,尤其加速了部分肺癌患者的死亡。患者亦对其预后毫不知情。
非小细胞性肺癌患者的5年生存率平均不到20%。然而生存期差异很大,生存最短的只有零个月,最长的则达180个月以上。只有用现代基因或基因表达检测技术才有可能揭示其本质。在这个基因表达时代,预测肺癌生存期及肺癌的个性化治疗都迫切需要一种经过广泛验证且容易操作的基因表达模型。
自2001发表第一篇有关非小细胞性肺癌的基因表达芯片(GEP)研究数据(Bhattacharjee,A.etal.PNAS98,13790-13795,(2001))以来,14年来已经有许多项研究提出了预测肺癌生存期的基因表达模型。这些基因表达模型少则一个基因,多则数百个基因不等。绝大部分都是基于小样本或者局限于单一研究机构的数据,最终并不能在不同国家不同数据中得到广泛验证。而且有相当一部分作者明明有10年以上的随访资料,却只比较5年的生存期变化,这无疑会带来更大的偏差。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷,本发明人收集了全世界9个国家和地区迄今为止14年来公开发布的17大研究总计2738例肺癌的基因表达芯片(GEP)数据,采用最先进最科学的分析计算方法,筛选肺癌预后相关的基因。因此,本发明的目的是提供用于对肺癌患者进行预后和/或治疗监控的生物标志物,预测肺癌患者的生存率和术后复发概率,提高肺癌患者的生存率和节约治疗费用。
在本发明的第一方面,提供了一种用于肺癌预后的多核苷酸集,所述多核苷酸集包括编码以下蛋白质的多核苷酸中的一种或多种:
Argonaute蛋白RISC催化组分4(AGO4);锚蛋白重复结构域11(ANKRD11);锚蛋白重复结构域40(ANKRD40);适配器相关蛋白复合物1,Σ1亚基(AP1S1);共济失调类似蛋白1(ATXN1L);大脑表达,X连锁蛋白-5(BEX5);联苯水解酶样蛋白(丝氨酸水解酶)(BPHL);染色体盒同源蛋白8(CBX8);55kDa的中心体蛋白(CEP55);软骨素聚合因子(CHPF);氯离子通道5(CLIC5);胱抑素C(CST3);胱抑素A(胱抑蛋白A)(CSTA);组织蛋白酶B(CTSB);组织蛋白酶D(CTSD);DEAH(天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸–组氨酸)盒多肽37(DHX37);DnaJ/Hsp40同源物亚家族C成员27(DNAJC27);蓬片段极性蛋白1(DVL1);上皮膜蛋白2(EMP2);序列相似性111家庭蛋白,成员B(FAM111B);Fc受体样蛋白(FCRL);Fc受体样蛋白A(FCRLA);甲酰肽受体1(FPR1);胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶1(GLT25D1);胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶(GLT25D2);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),q多肽(GNAQ);含有糖基转移酶样结构域1(GTDC1);GTP酶,非常大的干扰素诱导蛋白1(GVIN1);组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4);组蛋白去乙酰化酶5(HDAC5);135/155kDa的内着丝粒蛋白抗原(INCENP);40kDa的肌醇多磷酸-5-磷酸酶(INPP5A);肌醇聚磷酸盐多激酶(IPMK);肌醇四磷酸激酶1(ITPK1);1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(ITPR1);JunB蛋白(JUNB);3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶(KDSR);丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9(KIAA0101);Kruppel样因子8(KLF8);Kelch样家族成员6(KLHL6);溶血磷脂酸受体1(LPAR1);亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1(LRRFIP1);有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1;MARVEL结构域包含蛋白3(MARVELD3);赖氨酸特异性甲基转移酶2A(MLL);髓鞘零样蛋白1(MPZL1);肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白(MYLIP);Myozenin1蛋白(MYOZ1);非平滑肌细胞浓缩复合体1亚单位G(NCAPG);核受体共激活因子2(NCOA2);核受体共激活因子3(NCOA3);NIPA样结构域包含蛋白3(NPAL3);骨质疏松症相关跨膜蛋白1(OSTM1);肌丙酮酸激酶(PKM2);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶3(PLOD3);蛋白磷酸酶1,调节亚基15A(PPP1R15A);蛋白磷酸酶4,催化亚基(PPP4C);刺痒同源蛋白2(果蝇)(PRICKLE2);前列腺素还原酶1(PTGR1);酪氨酸蛋白磷酸酶,非受体类型5(纹状体-富集的)(PTPN5);RalGEF与PH域和SH3结合基序蛋白2(RALGPS2);RNA结合基序蛋白12B(RBM12B);RNA结合基序蛋白17(RBM17);G蛋白的调节信号2(RGS2);G蛋白的调节信号10(RGS10);G蛋白的调节信号19(RGS19);RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A(RIC8A);受体(TNFRSF)-相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1(RIPK1);
无名指蛋白166(RNF166);色素性视网膜炎蛋白2(X连锁隐性)(RP2);RUN和FYVE结构域包含蛋白3(RUFY3);林-12样3(线虫)SEL-1抑制子(SEL1L3);SH2结构域包含蛋白1B(SH2D1B);溶质载体家族7(氨基酸转运轻链,L系列),成员8(SLC7A8);脾病灶形成病毒(SFFV)前病毒基因整合原癌基因1蛋白(SPI1);血影α非红细胞1型蛋白(SPTAN1);转录适配器3(TADA3);T-箱子21(TBX21);THAP结构域包含蛋白8(THAP8);Aly/REF输出因子(THOC4);跨膜emp24蛋白运输结构域包含蛋白4(TMED4);三方结合基序包含蛋白28(TRIM28);泛素结合酶E2O(UBE2O);空泡蛋白分选37同源结构D(VPS37D);锌指蛋白331(ZNF331)。
在一个优选实施例中,本发明的多核苷酸集除了包括编码上述蛋白质的多核苷酸中的一种或多种之外,还包括编码以下蛋白质的多核苷酸:
α-1微球蛋白/bikunin前体(AMBP);钙调蛋白1(磷酸激酶)(CALM1);胱抑素B(胱抑B)(CSTB);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),α-抑制活性多肽3(GNAI3);生长抑制家族成员3(ING3);基质金属肽酶14(膜插入)(MMP14);PDZ结合激酶(PBK);增殖细胞核抗原(PCNA);多嘧啶通道结合蛋白3(PTBP3);VANGL平面细胞极性蛋白1(VANGL1)。
在一个优选实施例中,本发明的多核苷酸集包括编码以下蛋白质的多核苷酸:
锚蛋白重复结构域11(ANKRD11);组织蛋白酶B(CTSB);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),α-抑制活性多肽3(GNAI3);肌醇三磷酸3-激酶B(ITPKB);丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9(KIAA0101);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2);VANGL平面细胞极性蛋白1(VANGL1)。在本发明的另一方面,提供了所述的多核苷酸集在用于制备肺癌预后检测试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的另一方面,提供了一种用于肺癌预后的蛋白质组,所述蛋白质组包括以下蛋白质的一种或多种:
Argonaute蛋白RISC催化组分4(AGO4);锚蛋白重复结构域11(ANKRD11);锚蛋白重复结构域40(ANKRD40);适配器相关蛋白复合物1,Σ1亚基(AP1S1);共济失调类似蛋白1(ATXN1L);大脑表达,X连锁蛋白-5(BEX5);联苯水解酶样蛋白(丝氨酸水解酶)(BPHL);染色体盒同源蛋白8(CBX8);55kDa的中心体蛋白(CEP55);软骨素聚合因子(CHPF);氯离子通道5(CLIC5);胱抑素C(CST3);胱抑素A(胱抑蛋白A)(CSTA);组织蛋白酶B(CTSB);组织蛋白酶D(CTSD);DEAH(天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸–组氨酸)盒多肽37(DHX37);DnaJ/Hsp40同源物亚家族C成员27(DNAJC27);蓬片段极性蛋白1(DVL1);上皮膜蛋白2(EMP2);序列相似性111家庭蛋白,成员B(FAM111B);Fc受体样蛋白(FCRL);Fc受体样蛋白A(FCRLA);甲酰肽受体1(FPR1);胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶1(GLT25D1);胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶(GLT25D2);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),q多肽(GNAQ);含有糖基转移酶样结构域1(GTDC1);GTP酶,非常大的干扰素诱导蛋白1(GVIN1)(GTPase,verylargeinterferoninducible1);组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4);组蛋白去乙酰化酶5(HDAC5);135/155kDa的内着丝粒蛋白抗原(INCENP);40kDa的肌醇多磷酸-5-磷酸酶(INPP5A);肌醇聚磷酸盐多激酶(IPMK);肌醇四磷酸激酶1(ITPK1);1,4,5-三磷酸肌醇1型受体(ITPR1);JunB蛋白(JUNB);3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶(KDSR);丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9(KIAA0101);Kruppel样因子8(KLF8);Kelch样家族成员6(KLHL6);溶血磷脂酸受体1(LPAR1);亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1(LRRFIP1);有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1;MARVEL结构域包含蛋白3(MARVELD3);赖氨酸特异性甲基转移酶2A(MLL);髓鞘零样蛋白1(MPZL1);肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白(MYLIP);Myozenin1蛋白(MYOZ1);非平滑肌细胞浓缩复合体1亚单位G(NCAPG);核受体共激活因子2(NCOA2);核受体共激活因子3(NCOA3);NIPA样结构域包含蛋白3(NPAL3);骨质疏松症相关跨膜蛋白1(OSTM1);肌丙酮酸激酶(PKM2);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶3(PLOD3);蛋白磷酸酶1,调节亚基15A(PPP1R15A);蛋白磷酸酶4,催化亚基(PPP4C);刺痒同源蛋白2(果蝇)(PRICKLE2);前列腺素还原酶1(PTGR1);酪氨酸蛋白磷酸酶,非受体类型5(纹状体-富集的)(PTPN5);RalGEF与PH域和SH3结合基序蛋白2(RALGPS2);RNA结合基序蛋白12B(RBM12B);RNA结合基序蛋白17(RBM17);G蛋白的调节信号2(RGS2);G蛋白的调节信号10(RGS10);G蛋白的调节信号19(RGS19);RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A(RIC8A);受体(TNFRSF)-相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1(RIPK1);无名指蛋白166(RNF166);色素性视网膜炎蛋白2(X连锁隐性)(RP2);RUN和FYVE结构域包含蛋白3(RUFY3);林-12样3(线虫)SEL-1抑制子(SEL1L3);SH2结构域包含蛋白1B(SH2D1B);溶质载体家族7(氨基酸转运轻链,L系列),成员8(SLC7A8);脾病灶形成病毒(SFFV)前病毒基因整合原癌基因1蛋白(SPI1);血影α非红细胞1型蛋白(SPTAN1);转录适配器3(TADA3);T-箱子21(TBX21);THAP结构域包含蛋白8(THAP8);Aly/REF输出因子(THOC4);跨膜emp24蛋白运输结构域包含蛋白4(TMED4);三方结合基序包含蛋白28(TRIM28);泛素结合酶E2O(UBE2O);空泡蛋白分选37同源结构D(VPS37D);锌指蛋白331(ZNF331)。
在一个优选实施例中,本发明的蛋白质组除了包括上述蛋白质中的一种或多种,还包括以下蛋白质:
α-1微球蛋白/bikunin前体(AMBP);钙调蛋白1(磷酸激酶)(CALM1);胱抑素B(胱抑B)(CSTB);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),α-抑制活性多肽3(GNAI3);生长抑制家族成员3(ING3);基质金属肽酶14(膜插入)(MMP14);PDZ结合激酶(PBK);增殖细胞核抗原(PCNA);多嘧啶通道结合蛋白3(PTBP3);VANGL平面细胞极性蛋白1(VANGL1)。
在一个优选实施例中,本发明的蛋白质组包括以下蛋白质:
锚蛋白重复结构域11(ANKRD11);组织蛋白酶B(CTSB);鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),α-抑制活性多肽3(GNAI3);肌醇三磷酸3-激酶B(ITPKB);丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9(KIAA0101);原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2);VANGL平面细胞极性蛋白1(VANGL1)。
在本发明的另一方面,提供了所述的蛋白质组在用于制备肺癌预后检测试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的另一方面,提供了一种用于测定肺癌预后的检测试剂,所述的试剂是特异性扩增检测上述多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的引物对;或是特异性识别测定上述多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的探针;或是特异性识别测定上述蛋白质组中的各蛋白质的抗体。
在本发明的另一方面,提供了一种用于测定肺癌预后的试剂盒,所述的试剂盒中包含有助于特异性识别测定上述多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的表达的核酸探针;和/或有助于特异性识别测定上述蛋白质组中的各蛋白质的抗体。
在一个优选实施例中,所述的试剂盒中含有基因芯片,所述的基因芯片包括:固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的探针,所述的探针特异性识别所述的多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链。
本发明的数据来自全世界9个国家和地区迄今为止公开发布的所有大型肺癌研究,通过对本发明肺癌预后基因或蛋白标志物进行检测分析后得到的肺癌预后预测指数(LCPI),能够很好地将肺癌患者划分为低风险、中风险和高风险三组。该LCPI在多个国家多套独立的临床研究数据中得到了广泛的验证,说明依据本发明生物标志物得出的LCPI指数更可靠,适用范围更广。该LCPI能筛选出大于1/4的低风险病人,其15年生存机会高达80%,任何手术后辅助化疗实际上会降低患者的生存概率或缩短患者的寿命,使其提前死亡。因此,利用本发明可以节省昂贵的不必要的化疗费用,以及由此带来的副作用。
附图说明
图1:多个非小细胞性肺癌研究数据用批处理误差消除程序(COMBAT)预处理前后批处理误差比较。a:表达比较稳定的β-肌动蛋白(ACTB)基因表达水平显示出模型训练组8个不同研究机构的数据之间存在极大的批处理误差。b:表明模型训练组8个不同研究机构的数据之间的批处理误差被COMBAT完全消除了。c:ACTB基因表达水平显示出5个不同研究机构的健康对照组数据之间存在极大的批处理误差。d:表明5个不同研究机构的健康对照组数据之间的批处理误差被COMBAT完全消除了。e:测试组5个不同研究机构的数据(数据识别号:DFCI、GSE4573、HLH、MI、MSKCC)之间亦存在极大的批处理误差。f:表明测试组5个不同研究机构数据之间的批处理误差亦被COMBAT完全消除了。
图2:非小细胞性肺癌生存时间分布图。柱状图为模型训练组306例在研究结束前已死亡的患者的生存时间频率分布图。曲线为3个正态分布的拟合曲线。箭头显示3个生存期不同组之间最佳分割值为16个月和60个月。
图3:基因表达筛选策略图。利用基因表达显著性差别分析法(Siggenes)进行3个两两比较和2个三三比较,假阳性率设定为0.05或0.01。将各组结果进行交叉分析,发现95个具有高度重复性的共同基因。对以上95个共同基因进一步做单因素、多因素分析和生存曲线分析,最终更精确地筛选出有代表性的7个基因。
图4:模型训练组生存概率分析(Kaplan-Meieranalysis)。a:使用7个基因得分预测肺癌生存概率(包括I-III期腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌未接受化疗者)。b:使用年龄预测肺癌生存概率(包括I-III期腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌未接受化疗者)。c:使用临床分期预测肺癌生存概率(包括I-III期腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌未接受化疗者)。d:使用细胞类型预测肺癌生存概率(包括I-III期腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌未接受化疗者)。e:使用肺癌预后指数(LCPI,包含7个基因,年龄和临床分期)预测肺癌生存概率(包括I-III期腺癌,鳞状细胞癌和大细胞肺癌未接受化疗者)。横轴为生存时间(月),纵轴为生存概率。在a,e,f中,图中上部、中间和下部的曲线分别代表低、中度和高风险。
图5:化疗(ACT)或者放疗(ART)对非小细胞性肺癌模型训练组和测试组生存概率的影响及使用肺癌预后指数(LCPI)预测术后复发的概率。a:在模型训练组中化疗(由上至下曲线3)和未知是否化疗(由上至下曲线2)的患者生存概率显著低于未化疗的患者(由上至下曲线1)。b:在测试组中放疗(由上至下曲线1)、化疗(由上至下曲线2)、放疗加化疗(由上至下曲线4)和未知是否放疗化疗(由上至下曲线3)的患者生存概率显著低于未放疗化疗的患者(由上至下曲线1)。c:在测试组中被LCPI定义为低风险的亚组中,未化疗的患者(由上至下曲线1)15年生存概率高达100%,而化疗(由上至下曲线2)和未知是否化疗(由上至下曲线3)的患者生存概率显著下降。d:在测试组中被LCPI定义为中度风险的亚组中,接受化疗组(由上至下曲线2)与未接受化疗组(由上至下曲线1)比较并无好处,且随着随访时间的延长还显示出有害的作用。e:在测试组中被LCPI定义为高风险的亚组中,化疗(由上至下曲线3)和未知是否化疗(由上至下曲线2)的患者生存概率类似于未化疗的患者(由上至下曲线1),亦未见化疗的好处。f:在非小细胞性肺癌模型训练组中改用手术后复发的概率,使用肺癌预后指数(LCPI)亦可将患者划分为低,中度和高风险3个组。横轴为生存或未复发时间(月),纵轴为生存概率或未复发概率。
图6:肺癌预后指数(LCPI)在多个国家多套大型数据(包括I至IV期,多种细胞类型的非小细胞性肺癌)中的验证。a:生存概率预测,176例患者来自美国,包括I至IV期,两种细胞类型和49例已接受化疗的患者,数据识别号为:GSE42127。b:生存概率预测,274例患者来自美国,包括I至IV期,7种细胞类型和49例已接受化疗的患者,数据识别号为:GSE41271。c:生存概率预测,271例患者来自法国,包括I至IV期,7种细胞类型的患者,数据识别号为:GSE30219。d:生存概率预测,659例患者来自美国和加拿大,包括I至III期,3种细胞类型,137例已接受化疗和64例已接受放疗的患者。e:复发概率预测,136例患者来自韩国,包括I至IV期,两种细胞类型的患者,数据识别号为:GSE8894。f:复发概率预测,274例患者来自美国,包括I至IV期,7种细胞类型和49例已接受化疗的患者,数据识别号为:GSE41271。g:双频道数据生存概率预测,149例患者来自日本,包括I至III期,5种细胞类型的患者,数据识别号为:GSE11969。在图a-g中,由上至下曲线1、2和3分别代表LCPI定义的低、中度和高风险组。横轴为生存或未复发时间(月),纵轴为生存或未复发概率。
具体实施方式
下面将结合具体实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的,决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
对于相关领域普通技术人员已知的技术和方法可能不作详细讨论,但在适当情况下,所述技术行业方法和当被视为授权说明书的一部分。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
本发明人收集了全世界9个国家和地区迄今为止14年来公开发布的17大研究总计2738例肺癌的基因表达芯片(GEP)数据,采用最先进最科学的分析计算方法,从中筛选出95个肺癌预后特异性基因,其中有85个基因为首次报道与肺癌的生存概率及术后复发概率相关。
数据来源和误差消除
本发明选用了包括美国、加拿大、德国、西班牙、荷兰、瑞典、日本和台湾等在内的多个国家或地区的肺癌数据,并消除了这些国家或地区多套数据之间的批处理误差。如图1所示,管家基因β-肌动蛋白(ACTB)的表达表明,在模型训练组不同研究机构的数据之间存在较大的批处理误差(图1a,c)。其中研究1(GSE3141(Bildetal.,2006))与研究5(GSE29013(Xieetal.,2011))之间差异最大,相差32倍以上。在测试组各数据之间(图1e)亦观察到类似的批处理误差。应用批处理误差消除程序COMBAT处理后,批处理误差完全被消除了(图1b,d,f)。
肺癌死亡时间分布规律
如图2所示,在研究结束前已经死亡的306例非小细胞性肺癌(NSCLC)患者中,生存期分布图显示出三峰分布。我们可以很好地用三个正态分布来拟合其数据,用两个分割值将患者划分到三个不同的群体:预后较好的(>60个月),预后一般或中间的(16~60个月)和预后较差的(<16个月)。此种分布亦表明生存期或生存概率(OS)是受多基因控制的。由于每一个正态分布都是由2个以上的基因决定,因此我们可以预测可能会有至少六个或更多个基因与肺癌的生存概率相关。
基因标志物筛选
如图3所示,利用基因表达显著性差别分析法(Siggenes)进行3个两两比较和2个三三比较,假阳性率设定为0.05或0.01。将各组结果进行交叉分析,发现95个具有高度重复性的共同基因。其中有85个基因(参见表1)为首次报道与肺癌的生存概率及术后复发概率相关,其中10个基因(参见表2)已经有人报道过与非小细胞性肺癌患者的术后复发概率相关(Kimetal.,美国专利号:7,585,634)。对所述95个基因进一步进行单因素分析、多因素分析和生存曲线分析,最终更精确地筛选出有代表性的7个基因(参见表3)。
表1:85个基因的名称,识别号,染色体位置及编码蛋白描述
名称 | 识别号 | 染色体 | 编码的蛋白描述 |
AGO4 | 192670 | 1 | Argonaute蛋白RISC催化组分4 |
ANKRD11 | 29123 | 16 | 锚蛋白重复结构域11 |
ANKRD40 | 91369 | 17 | 锚蛋白重复结构域40 |
AP1S1 | 1174 | 7 | 适配器相关蛋白复合物1,西格玛1亚基 |
ATXN1L | 342371 | 16 | 共济失调类似蛋白1 |
BEX5 | 340542 | X | 大脑表达,X连锁蛋白-5 |
BPHL | 670 | 6 | 联苯水解酶样蛋白(丝氨酸水解酶) |
CBX8 | 57332 | 17 | 染色体盒同源蛋白8 |
CEP55 | 55165 | 10 | 55kDa的中心体蛋白 |
CHPF | 79586 | 2 | 软骨素聚合因子 |
CLIC5 | 53405 | 6 | 氯离子通道5 |
CST3 | 1471 | 20 | 胱抑素C |
CSTA | 1475 | 3 | 胱抑素A(胱抑蛋白A) |
CTSB | 1508 | 8 | 组织蛋白酶B |
CTSD | 1509 | 11 | 组织蛋白酶D |
DHX37 | 57647 | 12 | DEAH(天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸–组氨酸)盒多肽37 |
DNAJC27 | 51277 | 2 | DnaJ/Hsp40同源物亚家族C成员27 |
DVL1 | 1855 | 1 | 蓬片段极性蛋白1 |
EMP2 | 2013 | 16 | 上皮膜蛋白2 |
FAM111B | 374393 | 11 | 序列相似性111家庭蛋白,成员B |
FCRLA | 84824 | 1 | Fc受体样蛋白A |
FPR1 | 2357 | 19 | 甲酰肽受体1 |
GLT25D1 | 79709 | 19 | 胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶1 |
GLT25D2 | 23127 | 1 | 胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶2 |
GNAQ | 2776 | 9 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白),q多肽 |
GTDC1 | 79712 | 2 | 含有糖基转移酶样结构域1 |
GVIN1 | 387751 | 11 | GTP酶,非常大的干扰素诱导蛋白1 |
HDAC4 | 9759 | 2 | 组蛋白去乙酰化酶4 |
HDAC5 | 10014 | 17 | 组蛋白去乙酰化酶5 |
INCENP | 3619 | 11 | 135/155kDa的内着丝粒蛋白抗原 |
INPP5A | 3632 | 10 | 40kDa的肌醇多磷酸-5-磷酸酶 |
IPMK | 253430 | 10 | 肌醇聚磷酸盐多激酶 |
ITPK1 | 3705 | 14 | 肌醇四磷酸激酶1 |
ITPR1 | 3708 | 3 | 1,4,5-三磷酸肌醇1型受体 |
JUNB | 3726 | 19 | Jun B蛋白 |
KDSR | 2531 | 18 | 3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶 |
KIAA0101 | 9768 | 15 | 丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9 |
KLF8 | 11279 | X | Kruppel样因子8 |
KLHL6 | 89857 | 3 | Kelch样家族成员6 |
LPAR1 | 1902 | 9 | 溶血磷脂酸受体1 |
LRRFIP1 | 9208 | 2 | 亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1 |
MAD2L1 | 4085 | 4 | 有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1 |
MARVELD3 | 91862 | 16 | MARVEL结构域包含蛋白3 |
MLL | 4297 | 11 | 赖氨酸(K)特异性甲基转移酶2A |
MPZL1 | 9019 | 1 | 髓鞘零样蛋白1 |
MYLIP | 29116 | 6 | 肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白 |
MYOZ1 | 58529 | 10 | Myozenin1蛋白 |
NCAPG | 64151 | 4 | 非平滑肌细胞浓缩复合体1亚单位G |
NCOA2 | 10499 | 8 | 核受体共激活因子2 |
NCOA3 | 8202 | 20 | 核受体共激活因子3 |
NPAL3 | 57185 | 1 | NIPA样结构域包含蛋白3 |
OSTM1 | 28962 | 6 | 骨质疏松症相关跨膜蛋白1 |
PKM2 | 5315 | 15 | 肌丙酮酸激酶 |
PLOD2 | 5352 | 3 | 原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2 |
PLOD3 | 8985 | 7 | 原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶3 |
PPP1R15A | 23645 | 19 | 蛋白磷酸酶1,调节亚基15A |
PPP4C | 5531 | 16 | 蛋白磷酸酶4,催化亚基 |
PRICKLE2 | 166336 | 3 | 刺痒同源蛋白2(果蝇) |
PTGR1 | 22949 | 9 | 前列腺素还原酶1 |
PTPN5 | 84867 | 11 | 酪氨酸蛋白磷酸酶,非受体类型5(纹状体-富集的) |
RALGPS2 | 55103 | 1 | Ral GEF与PH域和SH3结合基序蛋白2 |
RBM12B | 389677 | 8 | RNA结合基序蛋白12B |
RBM17 | 84991 | 10 | RNA结合基序蛋白17 |
RGS10 | 6001 | 10 | G蛋白的调节信号10 |
RGS19 | 10287 | 20 | G蛋白的调节信号19 |
RGS2 | 5997 | 1 | G蛋白的调节信号2 |
RIC8A | 60626 | 11 | RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A |
RIPK1 | 8737 | 6 | 受体(TNFRSF)-相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1 |
表2:10个基因的名称,识别号,染色体位置及编码蛋白描述
名称 | 识别号 | 染色体 | 编码蛋白质描述 |
AMBP | 259 | 9 | α-1微球蛋白/bikunin前体 |
CALM1 | 801 | 14 | 钙调蛋白1(磷酸激酶) |
CSTB | 1476 | 21 | 胱抑素B(胱抑B) |
GNAI3 | 2773 | 1 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,α-抑制活性多肽3 |
ING3 | 54556 | 7 | 生长抑制家族成员3 |
MMP14 | 4323 | 14 | 基质金属肽酶14(膜插入) |
PBK | 55872 | 8 | PDZ结合激酶 |
PCNA | 5111 | 20 | 增殖细胞核抗原 |
PTBP3 | 9991 | 9 | 多嘧啶通道结合蛋白3 |
VANGL1 | 81839 | 1 | VANGL平面细胞极性蛋白1 |
表3:7个基因的名称,识别号,染色体位置及编码蛋白描述
风险评分
将多因素分析(多元coxph模型)中取得的每个基因系数乘以各自基因表达值之和即可生成7基因得分(7基因得分=系数1x基因1+系数2x基因2+...+系数7x基因7)。在模型训练组中,只有477例患者具有所有临床参数。同时为了避免术后化疗(ACT)的影响,去掉了已接受ACT或未知是否ACT的患者(N=159)。故在模型训练组中最终只有318例拥有所有临床参数且未接受ACT的患者。将此7基因得分应用于此患者组的生存曲线分析,可以有效地将其分为不同的三组(低风险、中风险和高风险)(图4a,n=318)。
对临床参数(包括年龄,性别,临床分期和细胞类型)进行多因素分析后结果表明,患者的年龄,临床分期和细胞类型有可能是独立的生存概率预测因子(表4)。然而,进行生存曲线分析时,利用患者的年龄,临床分期和细胞类型只能够将患者分成两个不同的组(图4b-d)。当我们引入7基因得分进行多因素分析时,我们发现,虽然年龄和临床分期仍为独立的预测因子,但细胞类型不再是独立的预测因子。另外,风险比值(HR)和p值均表明七基因得分是最强有力的独立预测因子(参见表4)。其中,HR为风险比值(hazardratio),Coef为系数(coefficient)。
表4.对318例肺癌患者生存概率与临床资料包括或不包括7基因得分进行多因素分析
肺癌预后指数(LCPI)
7个基因评分与年龄和临床分期共同构成肺癌预后指数(LCPI)。
在确定了7个基因得分,年龄和临床分期均为生存概率的独立预测因子,我们就可以生成以下生存概率函数:
S(t)=e-λt(1)
LCPI=λ=b1x基因1+b2x基因2+...+b7x基因7+b8x年龄+b9x分期(2)
其中S(t)是时间t之前的生存概率;λ是风险比值HR;LCPI是肺癌预后指标;系数b1到b9用coxph在模型训练组中计算得来,分别为:0.45(VANGL1),0.36(GNAI3),0.30(CTSB),-0.44(ANKRD11),-0.49(ITPKB),0.03(KIAA0101),0.05(PLOD2),0.03(年龄)和0.69(分期),在所有LCPI计算中保持恒定;基因1至基因7是基因表达的对数值;年龄为实际年龄(岁);分期值为0至3(IA期=0,IB-IIB=1,IIIA-IV=3)。使用上述函数(2),我们可以给任何患者计算出LCPI得分并预测他或她的生存概率(方程(1))。LCPI越低,生存概率越高;LCPI越高,生存概率越低,死亡和癌症复发的可能性越高。对来自相同检测平台的数据,采取相同的分割值;对不同平台的数据,采用该组本身的最佳分割值。
使用LCPI可以将模型训练组划分为三个明显不同的亚组(N=318,图4e)。低风险组在手术后10年的生存概率为100%,甚至在手术后15年仍然保持不变。中等风险组,手术后15年生存概率为53±10%(p<0.001)。高风险组的15年生存概率小于20%。从模型训练组获得最佳分割值,可以直接应用于相同平台的测试组。对于不同平台的数据,调整为相应的最佳分割值。LCPI在包括美国,德国,西班牙,荷兰,瑞典,日本和台湾在内的模型训练组中,能够有效地将患者划分为低风险(约27%),中度风险(约38%)和高风险(约35%)三组。
化疗影响
术后化疗(ACT)对LCPI定义的高风险组患者的生存概率无提高,但显著降低低风险或中度风险组的生存概率。
为了辨别ACT是否影响生存概率,我们将已经接受了ACT或未知处理的患者也包括在内,对477例患者应用LCPI进行了分析。事实证明,包括已经接受了ACT或未知处理的患者在内,LCPI亦能有效地将肺癌患者划分为三个显著不同的风险组(图4f)。但在手术后的第15年,LCPI定义的低风险组和中度风险组其生存概率分别只有80±5%和30±10%(p<0.05),相较于手术后未接受治疗的患者,生存概率显著下降(80±5%比100%,p<0.001;30±10%比53±10%,p<0.05)。这表明ACT对LCPI定义的低风险组或中度风险组的患者具有显著的负面影响。
为了进一步探讨ACT对生存概率的影响,我们将测试组的患者(N=477)分为未接受任何ACT(非ACT组),已接受ACT(ACT组)和不知是否已接受ACT(未知组)三组。非ACT组生存概率最高,而ACT组或未知组生存概率显著下降(图5a;p<0.001)。这一结果在529例的测试组中亦得到了验证。此测试组还包括了术后进行放射治疗(ART)或放疗加化疗组(ACT+ART),但化疗对生存概率亦体现出类似的负面影响,尤其是放疗对生存概率的负面影响最大(图5b,p<0.001)。
鉴于以上结果,我们想了解ACT对LCPI定义的不同风险组的患者是否产生相同的影响,所以我们在模型训练组中分析了LCPI定义的各风险组的生存概率与ACT的关系。ACT并不影响高风险组的生存概率,但却显著降低低风险组和中度风险组的生存概率(图5c-e)。
复发概率预测
LCPI亦适用于术后复发概率的预测。
因为生存概率有时会受到其他因素的影响,而计算复发概率比计算生存概率更可靠,且肺癌手术切除后复发是患者过早死亡的主要原因,所以我们进一步分析了复发概率。在477例模型训练组中只有377例患者具有术后复发的数据,使用LCPI我们同样可以将他们区分为复发风险显著不同的三个组(图5f;p<0.001)。计算复发概率的结果亦证实了我们在生存概率数据分析中获得的LCPI模型。
生存概率验证
LCPI预测生存概率,在来自美国和加拿大的多个研究所的最大的临床数据中得到了验证。
整合“雅各布-00182“(Director'sChallengeConsortiumfortheMolecularClassificationofLung,A.etal.,2008),GSE14814(Zhuetal.,2010)和GSE4573(Raponietal.,2006)的数据后,生成了非小细胞性肺癌的第二大多机构数据,包括了来自美国和加拿大七家研究机构的所有临床分期,三种细胞类型和部分术后ACT或ART的659例患者。由于本组数据是采用Affymetrix的GPL96平台,它所检测的基因数及灵敏度与模型训练组的GPL570平台不同,所以我们使用LCPI时,仍然采用来自本组的最佳分割值进行不同风险组的划分。图6d显示,在此来自不同平台的检测数据中使用最佳分割值,LCPI可以将659例肺癌患者划分为三个显著不同的亚组。5年和10年的生存概率,高风险组分别为28%和9.5%。该组所有患者生存期均未超过130个月。中等风险组5年,10年,15年的生存概率分别为64%,39%和23%。上述结果与模型训练组包含ACT的结果非常类似。但低风险亚组5年,10年和15年的生存概率分别为80%,76%和63%,这比模型训练组包含ACT患者的结果还低。基于我们之前的分析(图4,图5),可知这些负面影响可能来自放疗和/或化疗(图5b),但尚需进一步研究证实。上述结果表明,LCPI模型适用于预测来自多个研究机构包括所有临床分期,三种细胞类型和不同术后辅助放疗或和化疗的非小细胞性肺癌的临床数据。
LCPI预测生存概率,在来自美国德州癌症中心的临床数据GSE42127中得到了验证。
测试组数据GSE42127(Tangetal.,2013)的样本来自美国德州安德森癌症中心。此独立的测试组包括133例腺癌(ADC)和43例鳞状细胞癌(SCC)。其中49例已经接受过ACT,127例未接受ACT。临床分期包括I,II,III和IV期。由于此测试组数据来自不同的检测平台,我们仍然采用本组的最佳分割值划分不同的风险组。图6a表明LCPI可以将此组患者分离成三个不同的亚组(低,中度和高风险组),非常类似于模型训练组。低风险组80个月的生存概率高达100%,中度风险组10年的生存概率亦超过40%,而高风险组患者在10年以内全部死亡。
LCPI预测生存概率,在来自美国单一研究机构最大的临床数据GSE41271中得到了验证。
到目前为止测试组数据GSE41271(Satoetal.,2013)是来自美国单一研究机构最大的非小细胞性肺癌数据(N=275)。其中包括176例来自GSE42127的样本(Tangetal.,2013)。这个测试组患者来自四个不同的种族(白人,非洲裔,拉美裔和亚裔),包括所有临床分期(IA至IV)。共有184例ADC,80例SCC,10例属于五个罕见的细胞类型。有一例患者资料不全,未包括在分析之内。对此来自不同检测平台的数据,通过调整到最佳分割值,使用LCPI进行了生存曲线分析。图6b显示的结果非常相似于测试组数据GSE42127。低风险组80个月的生存概率高达100%,中度风险组的10年生存概率约为40%,而高风险组患者在10年以内全部死亡。以上结果表明,即使在较大的测试组临床数据,包括不同种族,部分ACT,各个临床分期和所有细胞类型的非小细胞性肺癌,LCPI依然可以很好地识别三种不同的风险亚组。
LCPI预测生存概率,在来自法国单一研究机构最大的临床数据GSE30219中得到了验证。
测试组数据GSE30219(Rousseauxetal.,2013)是来自法国最大的单一研究机构的数据。该数据含有正常对照14例和小细胞性肺癌22例,将此去掉,还有271例非小细胞性肺癌,包括所有临床分期和7种不同细胞类型。由于此测试组与模型训练组使用了相同的检测平台,所以我们可以采用从模型训练组计算得来的,预先指定的LCPI分割值(6.83,8.19)来分析此测试组数据。图6c显示LCPI能够将此测试组患者分离成三个显著不同的亚组(低,中度和高风险组),非常类似于模型训练组和另外两个测试组的结果(GSE42127(Tangetal.,2013),GSE41271(Satoetal.,2013))。低风险组的6年生存概率高达100%,10年至18年以上仍稳定在89%。中度风险的10年生存概率大于40%,18年生存概率大于30%。而在任何给定时间点上高风险组的生存概率显著低于其他两个组。这是一个单一研究机构的数据,并不需要将它与其他数据相结合,故未进行批误差处理。以上结果表明,即使不使用批误差处理,LCPI仍然可以很好地在法国的测试组数据(包括各个临床分期和所有细胞类型的非小细胞性肺癌)中识别三种不同风险的亚组。
LCPI预测术后复发概率,在来自韩国的临床数据GSE8894中得到了验证。
手术切除后复发是非小细胞性肺癌患者过早死亡的主要原因。计算术后复发概率往往比计算生存概率更可靠,因为它不会受到非肺癌死亡的影响。如果我们的LCPI模型是可靠的,它应该同时适合于计算术后复发概率和计算生存概率,且不管患者是来自哪个国家。此测试组数据GSE8894(Leeetal.,2008)来自韩国,包括138例非小细胞性肺癌患者(两种细胞类型)。两名患者因缺少必要的数据,被排除在本研究之外。该测试组与此模型训练组使用的是相同的检测平台,但临床分期资料并未公布,故计算LCPI时只用了7个基因和年龄积分。分割值校对为测试组的最佳分割值。即使没有临床分期资料,我们应用LCPI模型仍然能够定义三个不同的风险亚组(图6e)。高风险组所有患者均在8年以内复发,而中等风险和低风险组第8年仍免于复发的概率超过55%和83%。
LCPI预测术后复发概率,在来自美国的临床数据GSE41271中得到了验证。
测试组数据GSE41271(Satoetal.,2013)是来自美国单一研究机构既包括生存概率资料又包括复发概率资料的最大的非小细胞性肺癌数据(N=275)。其中一个患者样本不具备分析所需的全部资料被排除在我们的研究之外。此数据包括所有临床分期和所有细胞类型的非小细胞性肺癌。采用与生存概率分析相同的LCPI分割值,此测试组的患者亦可分成三个显著不同的风险亚组(图6f)。高风险组所有患者均在8年以内复发,而中度风险和低风险组5年仍免于复发的概率大于52%和100%。
以上结果进一步支持LCPI模型既适用于预测生存概率又适合于计算复发概率,可将来自多个国家的非小细胞性肺癌患者准确地划分为低,中度和高风险组,且不受临床分期和细胞类型的限制。
LCPI预测生存概率,在来自日本的双通道临床数据GSE41271中得到了验证。
到目前为止,我们已经在多个国家的所有公开的非小细胞性肺癌单通道基因表达芯片数据中验证了LCPI的科学性和可靠性。但有极少数数据是采用双通道基因表达芯片GPL7015平台,例如来自日本的GSE11969(Takeuchietal.,2006)。该测试组有149例非小细胞性肺癌患者,其中包括临床分期IA至IIIB和5种不同的细胞类型。使用以下方程(3):
Esingle=(Etwo+log10(参考基因))/log102
我们可以将双通道数据转换成单通道数据,并计算出LCPI得分。在这里,亦采用最佳分割值来分组。我们发现LCPI同样可以将此测试组分成三个显著不同的亚组(图6g)。低,中度和高风险组的5年生存概率分别为95%,68%和32%,10年生存概率分别为84%,58%和22%。
总之,对于任何预测模型,最重要的是它的验证。因此为了验证LCPI模型的科学性和可靠性,我们使用了来自五个不同国家包括各个临床分期和多种细胞类型的非小细胞性肺癌的多个测试数据(N=1939,图6)。测试数据GSE42127(N=176)和GSE41271(N=274)包括所有临床分期和多种细胞类型,其中亦包括部分已接受过ACT的患者。在这些测试组中,LCPI可以有效地划分三组显著不同的生存风险组(图6a,b),其结果与模型训练组完全一致。我们还使用LCPI预测了术后免于复发的概率(N=274),其结果进一步验证了LCPI的预测能力(图6f)。
评估LCPI是否可以应用于来自不同国家的数据,我们分别在来自法国的数据GSE30219(N=271),韩国的GSE8894(N=136),日本的GSE11969(N=149),美国和加拿大的雅各布-00182,GSE14814和GSE4573(N=659)等数据中进行了验证。应用LCPI,可以将所有测试组患者划分为明显不同的三个风险组(图6c,d,g)。类似地,我们亦可以用LCPI预测免于复发的概率(GSE8894,图6E)。
LCPI模型在迄今为止所有公开发表的且有临床资料的来自多个国家的不受临床分期和细胞类型限制的非小细胞性肺癌基因表达芯片数据中,无论是生存还是复发,毫无例外均能够有效地划分出低,中度和高风险三组,广泛而又充分地证明了LCPI的科学性,可靠性与普遍性。
生物标志物检测
基于本发明人的新发现,可以以上述95个基因尤其是精确确定的7个基因作为肺癌预后的标志物(标记物)。通过分析这些基因的表达情况,从而得知确定待测患者的类型,为疾病的诊断或预后提供依据。
可采用各种技术来检测上述基因的表达情况,这些技术均包含在本发明中。基因水平上,检测可以针对cDNA,也可针对基因组DNA,或针对mRNA。在一个实施方案中,所述基因的基因表达水平通过对由所述基因表达的RNA或mRNA的量进行定量来确定。RNA或mRNA的量可以例如通过使用选自以下的方法来确定:微阵列技术,RNA印迹,RNA测序和定量PCR(qPCR),诸如实时定量PCR(qrt-PCR),任选的多重PCR,或本领域中已知的用于测量基因表达的任何其他方法。
因为本发明的基因标志物编码蛋白质,所以也可使用免疫化学或其他蛋白质分析方法来测量其蛋白表达作为其基因表达的估计或应变量(function)。因此,在本发明的一个实施方案中,基因表达水平可间接地通过测量由所述基因编码的蛋白的量来确定。例如,肺癌预后测定还可以通过下列一项或多项进行:MALDI-TOF、SELDI、经由与一种或多种配体的相互作用、基于1-D或2-D凝胶的分析系统、液相层析、组合的液相层析和质谱术技术、薄层层析、NMR光谱学、三明治式免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RAI)、酶免疫测定法(EIA)、侧流/免疫层析条测试、Western印迹、免疫沉淀、基于颗粒的免疫测定法(包括使用金、银、或乳胶颗粒)、磁性颗粒或Q点、和组织切片上的免疫组织化学。
本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。在一些实施方案中,变体与表1~3所列出的基因具或其编码蛋白质具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的同源性。
基因芯片
作为本发明的一种优选方式,采用基因芯片技术来检测上述基因的表达情况。所述的基因芯片上包含针对上述基因的探针;更优选的,所述的基因芯片上包含针对两种或两种以上所述基因的探针;最优选的,所述的基因芯片上包含针对上述基因的探针。
本发明所述的基因芯片,包括固相载体和有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针由10~100个(更特别的为20~80个;更特别的为30~70个)连续核苷酸组成。
另一个方面,本发明还提供了一种通过基因芯片检测人组织中所述基因表达谱的方法,包括步骤:
(1)提供分离自人组织的RNA样品,在所述的RNA上设置标记物;
(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触,使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应,从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针一RNA”二元复合物;
(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物,从而确定人组织中相应的基因的表达谱。
本发明所述的RNA与芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行,本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记,也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。
检测试剂盒
本发明还提供一种用于检测所述基因的表达情况的试剂盒,试剂盒可用于测定所述基因的表达水平。试剂盒包括有助于确定上述核苷酸集中的核苷酸的表达水平的引物对/核酸探针或确定所述蛋白质组中的蛋白质的特异性抗体。在一个实施例中,所述的试剂盒中包括上述基因芯片。试剂盒还可以包括对测量基因表达水平而言是必要的其他试剂,诸如取决于所选择的方法用于对结合的或扩增的核酸或抗体进行检测和/或定量的第二标记的探针或亲和配体。此类标记也可直接附着或连接到核酸探针或抗体。
试剂盒还可以包括各种辅助物质以使试剂盒能够容易和有效地被使用,例如溶剂、洗涤缓冲液等等。此外,试剂盒还可以有利地包括参考样品或通过使用相同方法从患有已知高风险或低风险肺癌的患者获得的有关参考基因表达水平值的信息。
检测试剂使用
依照本发明的另一方面,提供了一种检测试剂或试剂盒进行肺癌预后的方法,该方法包括:
(a)用检测试剂或试剂盒测定自患者获得的样品中的所述的基因和/或蛋白标志物的量;
(b)比较来自所述患者的样品中测定的所述的基因和/或蛋白标志物的量与正常对照中的所述的基因和/或蛋白标志物的量;
(c)对比较所得的数据进行统计学分析,按照上述实施例中的分析方法将患者划分为低、中或高风险。
Claims (10)
1.一种用于肺癌预后的多核苷酸集,其特征在于,所述多核苷酸集包括编码以下蛋白质的多核苷酸中的一种或多种:
Argonaute蛋白RISC催化组分4;锚蛋白重复结构域11;锚蛋白重复结构域40;适配器相关蛋白复合物1Σ1亚基;共济失调类似蛋白1;大脑表达X连锁蛋白-5;联苯水解酶样蛋白;染色体盒同源蛋白8;55kDa的中心体蛋白;软骨素聚合因子;氯离子通道5;胱抑素C;胱抑素A;组织蛋白酶B;组织蛋白酶D;DEAH盒多肽37;DnaJ/Hsp40同源物亚家族C成员27;蓬片段极性蛋白1;上皮膜蛋白2;序列相似性111家庭蛋白成员B;Fc受体样蛋白;Fc受体样蛋白A;甲酰肽受体1;胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶1;胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽;含有糖基转移酶样结构域1;GTP酶,非常大的干扰素诱导蛋白1;组蛋白去乙酰化酶4;组蛋白去乙酰化酶5;135/155kDa的内着丝粒蛋白抗原;40kDa的肌醇多磷酸-5-磷酸酶;肌醇聚磷酸盐多激酶;肌醇四磷酸激酶1;1,4,5-三磷酸肌醇1型受体;JunB蛋白;3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶;丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9;Kruppel样因子8;Kelch样家族成员6;溶血磷脂酸受体1;亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1;有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1;MARVEL结构域包含蛋白3;赖氨酸特异性甲基转移酶2A;髓鞘零样蛋白1;肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白;Myozenin1蛋白;非平滑肌细胞浓缩复合体1亚单位G;核受体共激活因子2;核受体共激活因子3;NIPA样结构域包含蛋白3;骨质疏松症相关跨膜蛋白1;肌丙酮酸激酶;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶;蛋白磷酸酶1,调节亚基15A;蛋白磷酸酶4,催化亚基;刺痒同源蛋白2;前列腺素还原酶1;酪氨酸蛋白磷酸酶,非受体类型5;RalGEF与PH域和SH3结合基序蛋白2;RNA结合基序蛋白12B;RNA结合基序蛋白17;G蛋白的调节信号2;G蛋白的调节信号10;G蛋白的调节信号19;RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A;TNFRSF受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1;无名指蛋白166;色素性视网膜炎蛋白2;RUN和FYVE结构域包含蛋白3;林-12样3SEL-1抑制子;SH2结构域包含蛋白1B;溶质载体家族7成员8;脾病灶形成病毒前病毒基因整合原癌基因1蛋白;血影α非红细胞1型蛋白;转录适配器3;T-箱子21;THAP结构域包含蛋白8;Aly/REF输出因子;跨膜emp24蛋白运输结构域包含蛋白4;三方结合基序包含蛋白28;泛素结合酶E2O;空泡蛋白分选37同源结构D;锌指蛋白331。
2.一种如权利要求1所述的多核苷酸集,其特征在于,所述多核苷酸集还包括编码以下蛋白质的多核苷酸:
α-1微球蛋白/bikunin前体;钙调蛋白1;胱抑素B;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,α-抑制活性多肽3;生长抑制家族成员3;基质金属肽酶14;PDZ结合激酶;增殖细胞核抗原;多嘧啶通道结合蛋白3;VANGL平面细胞极性蛋白1。
3.一种如权利要求1所述的多核苷酸集,其特征在于,所述多核苷酸集包括编码以下蛋白质的多核苷酸:
锚蛋白重复结构域11;组织蛋白酶B;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α-抑制活性多肽3;肌醇三磷酸3-激酶B;丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2;VANGL平面细胞极性蛋白1。
4.如权利要求1~3任一项所述的多核苷酸集在用于制备肺癌预后检测试剂或试剂盒中的用途。
5.一种用于肺癌预后的蛋白质组,其特征在于,所述蛋白质组包括以下蛋白质的一种或多种:
Argonaute蛋白RISC催化组分4;锚蛋白重复结构域11;锚蛋白重复结构域40;适配器相关蛋白复合物1Σ1亚基;共济失调类似蛋白1;大脑表达X连锁蛋白-5;联苯水解酶样蛋白;染色体盒同源蛋白8;55kDa的中心体蛋白;软骨素聚合因子;氯离子通道5;胱抑素C;胱抑素A;组织蛋白酶B;组织蛋白酶D;DEAH盒多肽37;DnaJ/Hsp40同源物亚家族C成员27;蓬片段极性蛋白1;上皮膜蛋白2;序列相似性111家庭蛋白成员B;Fc受体样蛋白;Fc受体样蛋白A;甲酰肽受体1;胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶1;胶原蛋白β(1-O)半乳糖转移酶;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽;含有糖基转移酶样结构域1;GTP酶,非常大的干扰素诱导蛋白1;组蛋白去乙酰化酶4;组蛋白去乙酰化酶5;135/155kDa的内着丝粒蛋白抗原;40kDa的肌醇多磷酸-5-磷酸酶;肌醇聚磷酸盐多激酶;肌醇四磷酸激酶1;1,4,5-三磷酸肌醇1型受体;JunB蛋白;3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶;丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9;Kruppel样因子8;Kelch样家族成员6;溶血磷脂酸受体1;亮氨酸丰富重复FLII相互作用蛋白1;有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1;MARVEL结构域包含蛋白3;赖氨酸特异性甲基转移酶2A;髓鞘零样蛋白1;肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白;Myozenin1蛋白;非平滑肌细胞浓缩复合体1亚单位G;核受体共激活因子2;核受体共激活因子3;NIPA样结构域包含蛋白3;骨质疏松症相关跨膜蛋白1;肌丙酮酸激酶;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶;蛋白磷酸酶1,调节亚基15A;蛋白磷酸酶4,催化亚基;刺痒同源蛋白2;前列腺素还原酶1;酪氨酸蛋白磷酸酶,非受体类型5;RalGEF与PH域和SH3结合基序蛋白2;RNA结合基序蛋白12B;RNA结合基序蛋白17;G蛋白的调节信号2;G蛋白的调节信号10;G蛋白的调节信号19;RIC8鸟嘌呤核苷酸交换因子A;TNFRSF受体相互作用丝氨酸-苏氨酸激酶1;无名指蛋白166;色素性视网膜炎蛋白2;RUN和FYVE结构域包含蛋白3;林-12样3SEL-1抑制子;SH2结构域包含蛋白1B;溶质载体家族7成员8;脾病灶形成病毒前病毒基因整合原癌基因1蛋白;血影α非红细胞1型蛋白;转录适配器3;T-箱子21;THAP结构域包含蛋白8;Aly/REF输出因子;跨膜emp24蛋白运输结构域包含蛋白4;三方结合基序包含蛋白28;泛素结合酶E2O;空泡蛋白分选37同源结构D;锌指蛋白331。
6.一种如权利要求5所述的蛋白质组,其特征在于,所述蛋白质组还包括以下蛋白质:
α-1微球蛋白/bikunin前体;钙调蛋白1;胱抑素B;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,α-抑制活性多肽3;生长抑制家族成员3;基质金属肽酶14;PDZ结合激酶;增殖细胞核抗原;多嘧啶通道结合蛋白3;VANGL平面细胞极性蛋白1。
7.一种如权利要求5所述的蛋白质组,其特征在于,所述蛋白质组包括以下蛋白质:
锚蛋白重复结构域11;组织蛋白酶B;鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α-抑制活性多肽3;肌醇三磷酸3-激酶B;丙型肝炎病毒NS5A反式蛋白9;原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2;VANGL平面细胞极性蛋白1。
8.如权利要求5~7任一项所述的蛋白质组在用于制备肺癌预后检测试剂或试剂盒中的用途。
9.一种用于测定肺癌预后的检测试剂,其特征在于,所述的试剂是特异性扩增或检测权利要求1~3任一项所述的多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的引物对;或是特异性识别测定权利要求1~3任一项所述的多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的探针;或是特异性识别权利要求5~7任一项所述的蛋白质组中的各蛋白质的抗体。
10.一种用于测定肺癌预后的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中
包含有助于特异性识别或测定权利要求1~3任一项所述的多核苷酸集中的各多核苷酸和/或其互补链的表达的核酸探针;和/或有助于特异性识别权利要求5~7任一项所述的蛋白质组中的各蛋白质的抗体。
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