CN105368850A - 产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用。它具有SEQ？ID？No.1序列所示的核苷酸序列；通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过同源克隆的策略和3ˊRACE技术克隆枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因<i>LmCCD1</i>，得到完整的编码基因序列为1641bp。构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-<i>Lm</i><i>CCD1</i>，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因<i>LmCCD1</i>编码的酶活性进行了鉴定。同时构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-<i>LmCCD1</i>，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，用于后续的转基因研究。

Description

产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞（LyciumchinenseMiller）类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoidcleavagedioxygenaseenzyme）的克隆，具体为一种能够产生β-紫罗酮等香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶（LmCCD1）基因的克隆及应用。

背景技术

CCDs是一个古老的小基因家族，其中拟南芥CCDs包括9个同源基因(Tanetal.,2003)，分别为AtCCD1、AtCCD4、AtCCD7、AtCCD8、AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9，定位在不同的染色体上。CCDs能在特定位点裂解氧化类胡萝卜素而形成多种脱辅基类胡萝卜素，属于一种类胡萝卜素氧化酶，这类酶是非血红素加氧酶(Boucieretal.,2005)。加氧酶在催化过程中可向反应产物上加单氧也可加双氧，单加氧酶需要空气中的一个氧原子，而双加氧酶在其产物中增加2个氧原子(Leuenbergeretal.,2001)。在离体条件下用H₂ ¹⁸O和¹⁸O标记β-脱辅基-8’-类胡萝卜素的试验显示，拟南芥AtCCD1裂解类胡萝卜素的反应是通过向产物加双氧进行的(Holgeretal.,2006)，这说明CCDs催化类胡萝卜素裂解是一个加双氧的反应，CCDs是一类具有双加氧特性的类胡萝卜素氧化酶。

Schwartz等(2001)实验表明，拟南芥AtCCD1可裂解叶黄素生成β-紫罗酮，裂解β-胡萝卜素生成β-紫罗酮和C14的二醛(4,9-二甲基十二烷-2,4,6,8,10-戊烯-1,12-二醛)，并使玉米黄质转化为3-羟基-β-紫罗酮和3-羟基-α-紫罗酮。AtCCD1还可使全反式紫黄质转化为5,6-环氧-3-羟基-β-紫罗酮，裂解9-顺式-紫黄质的末端的9’,10’顺式双键而生成C27的环氧-脱辅基类胡萝卜醛，使9-顺式-新黄质裂解生成C27的环氧-脱辅基类胡萝卜醛和C27丙二烯脱辅基类胡萝卜醛，C27化合物则进一步裂解为C14二醛和C13的酮(Andrewetal.,2004)。

拟南芥CCD1缺陷型突变体种子中类胡萝卜素的含量增加，表明CCD1在类胡萝卜素催化裂解过程中起作用(Auldirigeetal.,2006)。目前CCD1同源基因已经在番茄(Anderwetal.,2004)、牵牛花(Andrewetal.,2004)、香瓜(Mwafaqetal.,2006)等多种植物中被分离纯化。研究表明，植物类胡萝卜素裂解双加氧酶1(CarotenoidCleavageDioxygenase1，CCD1)在9,10和9’,10’双键位置裂解线型和环型的类胡萝卜素而产生多种天然活性化合物――脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoids)，其中包括一些色素、芳香物质、生长调节剂和防御化合物等。而CCD1的催化活性需要Fe²⁺作为辅因子，它们含有与铁结合的4个组氨酸(Schwartzetal.,1997)。而来源不同植物的CCD1酶的活性有所不同，来自甜瓜的CCD1基因可以裂解全反式八氢番茄红素（phytoene）、番茄红素（lycopene）、β-胡萝卜素（β-carotene）和δ-胡萝卜素（δ-carotene），产生C13产物（MwafaqIbdahetal.,2006）；而来自番红花（Bouvieretal.,2003）和葡萄植物(Mathieu,S.etal.,2005)的CCD1酶只能裂解玉米黄质，产生C13产物3-羟基-β-紫罗酮。Vogel（2008）报道指出，拟南芥、玉米和番茄中的CCD1酶还具有新的裂解位置，即在5,6和（或）5’，6’位置裂解番茄红素，产生芳香物质6-甲基-5-庚烯-2-酮。最近的研究还表明，异源表达水稻CCD1基因可以在C7和C8位置降解单环或无环的类胡萝卜素，产生香叶醛(Ilgetal.2009)。

在离体条件下，葡萄CCD1基因还能够裂解玉米黄质和叶黄素，产生芳香物质3-羟基-β-紫罗酮和C14二醛（Mathieuetal.2005,2007）。Lashbrooke(2010)证实葡萄CCD1基因可以裂解番茄红素和β-胡萝卜素，产生假紫罗酮和β-紫罗酮。目前已知植物CCD1酶的底物较多，在离体条件下，能够分别以八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、玉米黄质、紫黄质和新黄质等多种类胡萝卜素为反应底物，生成β-紫罗酮、3-羟基-β-紫罗酮、3-羟基-α-紫罗酮、香叶基丙酮、假紫罗酮、C27的环氧-脱辅基类胡萝卜醛和C27丙二烯脱辅基类胡萝卜醛等物质。而这些脱辅基类胡萝卜素参与了色素、风味、香气的形成。水果中含有少量的脱辅基类胡萝卜素，对人类健康却具有重要意义。

脱辅基类胡萝卜素是矮牵牛(PetuniahyhridaVilm)、番茄、胡萝卜(Daucusaarota)和杨桃(Sebastianiachamaelea)香气物质重要的组成成分(Mwafaqetal.,2006)。β-紫罗酮作为花的香气物质，能够刺激昆虫取食或起到昆虫性信息素的作用，因此是很好的引诱剂，引诱昆虫前来取食或“交尾”。而类胡萝卜素积累使花呈现亮黄色、橙色或红色，以吸引昆虫从而实现授粉。两者为植物种群稳定的繁衍提供了保障。Lewin-sohn等(2005)证明，西瓜(Capparisspinosa)和番茄中的类胡萝卜素和萜类等挥发性物质在结构上是非常相似的，类胡萝卜素的着色形式影响番茄和西瓜脱辅基类胡萝卜素和单萜芳香性挥发性物质的组成形式。

Weishu等（2011）报到，在拟南芥中过表达AtCCD1基因，可以增加拟南芥花中β-紫罗酮的释放，并减轻十字花科跳甲的危害。而CCD1基因能提高多种植物及一些植物产品例如葡萄酒、果汁等的风味，已在多种文献中有所报道。由于CCD1基因能改良植物风味、参与植物生长发育及抵抗非生物胁迫等重要作用，因此已成为当今植物改良研究中的一个热点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够产生香味物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供了一种枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1，如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供了一种上述枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1编码的蛋白质，如序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供了一种上述枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1重组克隆载体pMD18-T-LmCCD1。

本发明提供了一种上述枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1。

含有上述的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的重组载体，这些重组载体包括质粒。

所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1。

所述的质粒表达载体双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1。

含有上述枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。

本发明提供了一种含有LmCCD1基因工程菌。

上述枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的应用包括该LmCCD1基因编码的蛋白在大肠杆菌和植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的LmCCD1遗传转化获得上述物种转基因植株。

本发明提供的一种枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LCCD1，如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，还包括所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

本发明提供的一种枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1编码的蛋白，如序列表SEQIDNO.2所示氨基酸序列。

本发明的克隆方法由下述步骤组成：

从枸杞叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的核苷酸序列分别从5’端引物CCD1-JF：5’-ATGGGGATGAAAGAAGAG

AATGGA-3’，根据NCBI中已登录的番茄（AY576001）、矮牵牛花（AY576003）、马铃薯（DQ206633）、烟草（DQ212781）的保守核苷酸保守区域设计中间特异性上游引物CCD1-BF：5’-GAGCTTCCWAATTGCTTCAT-3’。中间特异上游引物CCD1-BF与3'RACE试剂盒中下游Outer引物利用RACE技术扩增得到其3’端末端全长序列；同时根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物，通过PCR扩增获得LmCCD1基因的全长序列。

本发明构建含枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1，由下述步骤组成：

构建含有枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的中间载体pMD18-T-LmCCD1：

设计由SEQIDNO.3所示的上游引物P1（P1：5’-ATGGGGATGAAAGAAGAGAAT-3’），和由SEQIDNO.4所示的下游引物P2（P2：5’-TCACAGTTTGGCTTGTTCTTGTA-3’），以枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQIDNO.1所示的LmCCD1基因的中间载体pMD18-T-LmCCD1。

构建大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1：

设计由SEQIDNO.5所示的上游引物P3（P3：5’-CGCGGATCCATGGGGATGAAAGAAGAGAATGGAG-3’），和由SEQIDNO.6所示的下游引物P4（P4：5’-ACGCGTCGACTCACAGTTTGGCTTGTTCTTG-3’），以质粒pMD18-T-LmCCD1为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物经BamHI和SalI酶切后，将大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1经BamHI和SalI双酶切，二者进行连接反应，得到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1。

本发明提供了一种枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码类胡萝卜素裂解双加氧酶基因的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmCCD1基因在蛋白水平表达的产物具有酶的活性。

本发明通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，用3'-RACE技术克隆了枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1，得到完整的编码基因序列为1641bp。构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1，对克隆的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1编码的酶活性进行了鉴定，通过pGEX-4T-1原核表达载体构建的重组蛋白在大肠杆菌中异源表达表明LmCCD1重组蛋白对底物β-胡萝卜素和番茄红素均具有较高的活性。同时构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，用于后续的研究。

附图说明

附图说明

图1pMD18-T-LmCCD1载体示意图。

图2pGEX-4T-1-LmCCD1载体示意图。

图3pGEX-4T-1-LmCCD1双酶切示意图。

图4LmCCD1重组蛋白在大肠杆菌中表达降解β-胡萝卜素结果图。图a：共转入β-胡萝卜素合成基因和LmCCD1基因使大肠杆菌颜色变浅，说明其可以降解β-胡萝卜素；图b：共转入β-胡萝卜素合成基因和空载体时的大肠杆菌中β-胡萝卜素含量HPLC图；图c：共转入β-胡萝卜素合成基因和LmCCD1基因时大肠杆菌中β-胡萝卜素含量HPLC图。

图5LmCCD1重组蛋白在大肠杆菌中表达降解番茄红素结果图。图a：共转入番茄红素合成基因和LmCCD1基因使大肠杆菌颜色变浅，说明其可以降解番茄红素；图b：共转入番茄红素合成基因和空载体时的大肠杆菌中番茄红素含量HPLC图；图c：共转入番茄红素合成基因和LmCCD1基因时大肠杆菌中番茄红素含量HPLC图。

图6pCAMBIA2300-LmCCD1载体示意图。

图7pCAMBIA2300-LmCCD1酶切验证结果。

图8转基因烟草基因组PCR验证结果。

图9LmCCD1重组蛋白将β-胡萝卜素（β-carotene）和番茄红素（Lycopene）分别降解为β-紫罗酮（β-ionone）和假紫罗酮（Pseudoionone）的代谢途径。

具体实施方式

对本发明作进一步的阐述，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的克隆：

以RNeasyPlantMiniKit（QIAGEN，German）试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取TotalRNA，根据转录组Unigene序列中枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的核苷酸序列设计5’端引物CCD1-JF：5’-ATGGGGATGAAAGAAGAGAATGGA-3’，根据NCBI中已登录的番茄（AY576001）、矮牵牛花（AY576003）、马铃薯（DQ206633）、烟草（DQ212781）的保守核苷酸保守区域设计中间特异性上游引物CCD1-BF：5’-GAGCTTCCWAATTGCTTCAT-3’。利用3'-FULLRACECoreSetVer.2.0（TaKaRa，Japan）试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤：

①以TotalRNA为模板，使用3'RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

RNA：2μl

3'RACEAdaptor：1μl

5×M-MLVBuffer：2μl

2.5mMdNTPMixture：1μl

RNaseInhibitor：0.25μl

ReverseTranscriptaseM-MLV：0.25μl

RNaseFreedH2O：3.5μl

反应条件：42℃，60min；70℃，15min。

②根据基因的上游引物与上述的试剂盒提供的下游引物3'RACEoutprimer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1stStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：2μl

APX-BF：0.5μl

3'RACEoutprimer：0.5μl

10×LAPCRBuffer：2.5μl

TaKaRaLATaq：0.25μl

ddH₂O：18.25μl

Totalvolume25μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环。

根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物P2。以1stStrandcDNA为模板，以5’端特异引物P1和3’端特异引物P2为上下游引物，进行PCR反应，扩增基因的全长。反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：4μl

P1：1μl

P2：1μl

10×LAPCRBuffer：5μl

TaKaRaLATaq：0.5μl

ddH₂O：37.5μl

Totalvolume50μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。

实施例2

克隆载体pMD18-T-LmCCD1的构建过程

将序列表所示的LmCCD1基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下：

目的PCR片段：4μl

pMD18-T载体：1μl

SolutionI：5μl

反应条件：16℃，30min。连接产物转化E.ColiTOP10，涂布于含Amp抗性的LB平板。以目的基因为引物进行PCR（反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。）得到PCR产物，电泳条带正确，然后送华大基因公司测序，测序结果在NCBI中进行Blast，表明为该基因。

实施例3

大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1的构建过程

首先，以pMD18-T-LmCCD1为模版，P3和P4分别为上下游引物用高保真Pfu酶扩增LmCCD1基因，其反应条件为94℃，4min；94℃，30sec；57℃，30sec；72℃，1min50sec；72℃，8min，30个循环。在P3中引入BamHI酶切位点（CGCGGATCC），在P4中引入SalI酶切位点（ACGCGTCGAC）。然后，PCR产物与pGEX-4T-1质粒分别经BamHI和SalI双酶切，将二者酶切产物连接：22℃，2hrs，连接（2μl载体DNA，5μl外源DNA，2μl5×T4buffer，1μlT4DNA连接酶）。连接产物转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因为引物进行PCR得到约1641bp左右产物条带，送华大基因测序公司测序，结果表明载体pGEX-4T-1-LmCCD1构建正确。

实施例4

LmCCD1基因在大肠杆菌中的功能验证

（1）LmCCD1在BL21中的诱导表达以及纯化，具体步骤为：

挑取能产生β-胡萝卜素（CRT）和番茄红素（EBI）质粒和重组载体pGEX-4T-1-LmCCD1共转化BL21感受态细胞，挑取单菌落，37℃过夜培养；

将菌液按l/20比例稀释，200ml菌液于37℃，200rpm培养至OD₆₀₀=0.6，取出lml菌液作为对照保存于4℃；

加入IPTG（终浓度为0.2mmol/L）于28℃诱导表达48h后，两个质粒共转化菌颜色明显浅于只含CRT和EBI质粒菌，说明LmCCD1基因具有代谢β-胡萝卜素和番茄红素的功能。取出lml菌液作为对照保存于4℃；余下的进行β-胡萝卜素和番茄红素及其降解产物含量的HPLC分析。结果见图4（LmCCD1降解β-胡萝卜素），图5（LmCCD1降解番茄红素）。

实施例5

双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1的构建及转化农杆菌工程菌种C58。

pGEX-4T-1-LmCCD1质粒和pCAMBIA2300空载体质粒分别经BamHI和SalI双酶切，酶切体系为：60μl质粒，2μlBamHI内切酶，2μlSalI内切酶，20μl10×FastDigestBuffer，116μlddH₂O₂，反应条件为37℃，2hrs。分别切胶回收目的片段LmCCD1和载体片段pCAMBIA2300，然后将二者连接，连接体系同实施例3。连接产物转化E.Coli.TOP10，涂布于含100mg/L浓度Kana抗性的LB平板。阳性克隆经酶切验证正确，如图7所示。构建成功的pCAMBIA2300-LmCCD1载体通过电击转化农杆菌工程菌C58，通过菌落PCR验证正确的阳性转化子存于-80℃，用于后续的植物转基因。

实施例6

农杆菌感受态细胞的制备和电转化过程

(1)将根癌农杆菌C58活化，划板，28℃培养2天后长出单克隆。挑取单克隆接种于10mlYEP液体培养基中，28℃振荡培养至对数期0D600=0.5。

(2)冰浴30min，5000rpm离心10min，收集菌体。并用冰预冷的1mmol/L的HEPES/KOH(pH7.0)溶液重悬，并重复以上步骤2~3次。

(3)将农杆菌重悬于20ml预冷的10%甘油中，分装成每管100μl预冷过的1.5ml离心管中，液氮速冻，存于-80℃备用。

电击转化过程（冰上操作）

(1)向含有100μl感受态农杆菌中加入1μl质粒（约100ng），轻轻混合后冰浴5min

(2)转移到冰预冷的电击杯中（电击杯直径型号为1mm），电击转化。电击条件为：1.5KV，200Ω，25μF。

(3)立即加入0.5ml不含抗生素的YEP培养基，28℃150rpm，培养2~4h。

(4)直接取50μl转化后的菌液涂布于含卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2~3d。挑取单菌落做菌落PCR验证阳性克隆。

实施例7

农杆菌介导的烟草遗传转化

本实验用到的培养基：

无菌苗培养基：MS固体培养基，pH5.8；

侵染培养基：MS液体培养基，pH5.8；

共培培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA

脱菌筛选培养基：MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+100mg/L卡那霉素+400mg/L的头孢霉素，pH5.8；

抗性苗生根培养基：MS+100mg/l卡那霉素+400mg/l的头孢霉素，pH5.8；

烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用75%乙醇浸泡lmin，25%的安替福明(有效氯2.5%)水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次，将种子放在MS培养基中，25℃光培养，16h/8h光周期。

烟草的农杆菌转化

侵染菌液的制备

挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养。

次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD600=0.6-0.9)时，将菌液移入50ml离心管，在3500r/min，4℃下离心15min，弃上清液，收集菌体。

用等量的MS液体培养基重悬，使OD600=0.9-1。

外植体浸染

将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。

将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。

转基因苗移栽

将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在营养土：蛭石：珍珠岩=4:5:1的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。

转基因烟草基因组DNA的PCR检测

CTAB法提取烟草总DNA;

以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为P3、P4，反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。

取上述PCR产物5μl进行电泳检测，图8说明LmCCD1基因已成功转入烟草。

序列表

<110>天津大学

<120>产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用

<130>20131116

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1641

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1641)

<400>1

atggggatgaaagaagagaatggagtggcaagaatagagggaggagtagtggtggttgat60

ccaaagccaaaaaaaggagtggttgcaaaggccatagacttgttagaatgggggatgatc120

aagttaatgaatgactccaccaaaccacttcactatcttcaaggcaattttgcacctacc180

catgaaactcctccttttaaagaccttcctgttaaaggccatcttccggagtgcctgaat240

ggcgagtttgtcagggttggtccaaatcctaaatttgctccagctgctggatatcattgg300

tttgatggagatggcatgattcatggcttgcacattaaagatggaaaagcaacatatgtc360

tcacgttttgtgaggacatcacgtctaaagcaagaagagttctttggaggagccaagttt420

atgaagattggagatcttaaagggctgttcgggttgttttcagtatacatttacatgctc480

aggcaaaagctgaaagttttggacacttcctatggaaatggcacagctaatacagctatg540

atatatcaccacgggaagcttttggctcttcatgagggtgataaaccatatgtagttaaa600

gttctggaggatggagatctacaaacgcttggcatgctggattacgataaaaggttgcaa660

cattcctttactgctcacccgaaggttgacccggtgactggggaaatgtttacttttgga720

tacgcgcagacaccaccttacgctacatatagagtcatatccaaggatggcatcatggaa780

gatcctgttccaataacaataccagcagctgttatgatgcatgattttgctattactgaa840

aattatgcaattatgatggatcttccattgtacttcaagccaaaggaaatggtgaaaaat900

aaacagctggcatacagttttgaccccacaaagaaggctcgctttggagttcttccacgc960

tacgcaaagaatgaatccctaatcaagtggttcgagcttcctaactgcttcatattccac1020

aatgccaatgcttgggaggagggagatgacgtggtcttgatcacttgccgcctgcagaat1080

ccagatttagatgcaattaatggaactgaaaatgaacaacagcgtgacggtttcacaaat1140

gagctgtatgagatgaggttcaatatgaagaatggtctagcatcagagaagaaactgtca1200

gagtctgctgttgattttccacgggtcaacgagaactacactggaaggaaacaacgctat1260

gtatatggaaccattttgaacaacgttgccaagatcacaggagttgtcaaatttgatttg1320

catgcggaaccagagactggaaaaacaaagcttgaagtcggtggaaacattcctggaatt1380

ttcgaccttggaccaggaagatttggctcagaagcaatatttgttccccgacagcctggg1440

acagaatgtgaagaggatgacggatacttgatattgtttgtacatgatgagatcactgga1500

cagtcatcagtgaatgtaattgatgcgaaaacaatgtccgccgaacctgtggcagttgtt1560

gagttacccaatagagttccatatggtttccatgccttttttgtcacagaggaacaaata1620

caagaacaagccaaactgtga1641

<210>2

<211>546

<212>PRT

<213>人工系列

<220>

<221>MUTAGEN

<222>(1)..(546)

<400>2

MetGlyMetLysGluGluAsnGlyValAlaArgIleGluGlyGlyVal

151015

ValValValAspProLysProLysLysGlyValValAlaLysAlaIle

202530

AspLeuLeuGluTrpGlyMetIleLysLeuMetAsnAspSerThrLys

354045

ProLeuHisTyrLeuGlnGlyAsnPheAlaProThrHisGluThrPro

505560

ProPheLysAspLeuProValLysGlyHisLeuProGluCysLeuAsn

65707580

GlyGluPheValArgValGlyProAsnProLysPheAlaProAlaAla

859095

GlyTyrHisTrpPheAspGlyAspGlyMetIleHisGlyLeuHisIle

100105110

LysAspGlyLysAlaThrTyrValSerArgPheValArgThrSerArg

115120125

LeuLysGlnGluGluPhePheGlyGlyAlaLysPheMetLysIleGly

130135140

AspLeuLysGlyLeuPheGlyLeuPheSerValTyrIleTyrMetLeu

145150155160

ArgGlnLysLeuLysValLeuAspThrSerTyrGlyAsnGlyThrAla

165170175

AsnThrAlaMetIleTyrHisHisGlyLysLeuLeuAlaLeuHisGlu

180185190

GlyAspLysProTyrValValLysValLeuGluAspGlyAspLeuGln

195200205

ThrLeuGlyMetLeuAspTyrAspLysArgLeuGlnHisSerPheThr

210215220

AlaHisProLysValAspProValThrGlyGluMetPheThrPheGly

225230235240

TyrAlaGlnThrProProTyrAlaThrTyrArgValIleSerLysAsp

245250255

GlyIleMetGluAspProValProIleThrIleProAlaAlaValMet

260265270

MetHisAspPheAlaIleThrGluAsnTyrAlaIleMetMetAspLeu

275280285

ProLeuTyrPheLysProLysGluMetValLysAsnLysGlnLeuAla

290295300

TyrSerPheAspProThrLysLysAlaArgPheGlyValLeuProArg

305310315320

TyrAlaLysAsnGluSerLeuIleLysTrpPheGluLeuProAsnCys

325330335

PheIlePheHisAsnAlaAsnAlaTrpGluGluGlyAspAspValVal

340345350

LeuIleThrCysArgLeuGlnAsnProAspLeuAspAlaIleAsnGly

355360365

ThrGluAsnGluGlnGlnArgAspGlyPheThrAsnGluLeuTyrGlu

370375380

MetArgPheAsnMetLysAsnGlyLeuAlaSerGluLysLysLeuSer

385390395400

GluSerAlaValAspPheProArgValAsnGluAsnTyrThrGlyArg

405410415

LysGlnArgTyrValTyrGlyThrIleLeuAsnAsnValAlaLysIle

420425430

ThrGlyValValLysPheAspLeuHisAlaGluProGluThrGlyLys

435440445

ThrLysLeuGluValGlyGlyAsnIleProGlyIlePheAspLeuGly

450455460

ProGlyArgPheGlySerGluAlaIlePheValProArgGlnProGly

465470475480

ThrGluCysGluGluAspAspGlyTyrLeuIleLeuPheValHisAsp

485490495

GluIleThrGlyGlnSerSerValAsnValIleAspAlaLysThrMet

500505510

SerAlaGluProValAlaValValGluLeuProAsnArgValProTyr

515520525

GlyPheHisAlaPhePheValThrGluGluGlnIleGlnGluGlnAla

530535540

LysLeu

545

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(18)

<400>3

atgggtaagtgctatcct18

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(17)

<400>4

gccactactcccaccct17

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(28)

<400>5

cgcggatccatgggtaagtgctatccta28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工系列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(29)

<400>6

acgcgtcgaccacccttcagaatcaccat29。

Claims (10)

1.一个枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，其特征在于该基因为SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因全序列。

4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1。

5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组载体的大肠杆菌BL21。

6.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1。

7.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因全序列。

8.一种权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于它是大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、烟草细胞、玉米细胞或者大豆细胞。

9.权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因（LmCCD1）的克隆方法，其特征在于包括的步骤：

以RNeasyPlantMiniKit试剂盒，从100mg新鲜枸杞叶片中提取TotalRNA，根据转录组Unigene序列中枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因LmCCD1的核苷酸序列设计5’端引物CCD1-JF：5’-ATGGGGATGAAAGAAGAGAATGGA-3’，根据NCBI中已登录的番茄、矮牵牛花、马铃薯、烟草的保守核苷酸保守区域设计中间特异性上游引物CCD1-BF：5’-GAGCTTCCWAATTGCTTCAT-3’；利用3'-FULLRACECoreSetVer.2.0试剂盒扩增得到完整的基因序列；具体步骤：

①以TotalRNA为模板，使用3'RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

RNA：2μl

3'RACEAdaptor：1μl

5×M-MLVBuffer：2μl

2.5mMdNTPMixture：1μl

RNaseInhibitor：0.25μl

ReverseTranscriptaseM-MLV：0.25μl

RNaseFreedH2O：3.5μl

反应条件：42℃，60min；70℃，15min；

②根据基因的上游引物与上述的试剂盒提供的下游引物3'RACEoutprimer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1stStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：2μl

APX-BF：0.5μl

3'RACEoutprimer：0.5μl

10×LAPCRBuffer：2.5μl

TaKaRaLATaq：0.25μl

ddH₂O：18.25μl

Totalvolume25μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，8min，30个循环；

根据已获得的3’端序列设计下游特异性引物P2，以1stStrandcDNA为模板，以5’端特异引物P1和3’端特异引物P2为上下游引物，进行PCR反应，扩增基因的全长；反应体系如下：

1stPCR产物：1μl

2.5mMdNTPMixture：4μl

P1：1μl

P2：1μl

10×LAPCRBuffer：5μl

TaKaRaLATaq：0.5μl

ddH₂O：37.5μl

Totalvolume50μL

反应条件：94℃，4min；94℃，30sec；52℃，30sec；72℃，2min；72℃，8min，30个循环。

10.一种权利要求1所述的枸杞类胡萝卜素裂解加双氧酶基因（LmCCD1）的应用，其特征在于它用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。