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一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法和应用，所述分子标记位于SEQ？ID？NO:1所示核苷酸的第185位，该位点的核苷酸为C或T。PCR扩增高邮鸭基因组DNA，扩增产物经连接酶检测反应后测序，通过序列分析获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记。该分子标记在筛选高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状中的应用，可以用于家系选育中的早期选择，在选配中提供分子依据。本发明分子标记为筛选高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状提供了新的方法。

Description

一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用
技术领域
本发明属于家禽基因工程的技术领域，更具体地，涉及一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用。
背景技术
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称GDF-8，属TGF-β超家族，是1997年发现的一种骨骼肌生长发育的负调控因子，其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，表现为双肌性状。MSTN在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白，其功能和表达量的变化可能会通过调节靶蛋白的表达来改变肌肉的纤维组成及造成肌肉重量的变化。MSTN对骨骼肌的生长有调节作用，其基因在猪、人、绵羊和牛已被定位和标记，但在家禽尤其是水禽育种过程中的研究及利用则相对缺乏研究和探索。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为第三代分子标记，具有数量多、分布广、代表性强和遗传稳定性好等特点。目前已经在动植物的遗传多样性分析、基因作图、分子标记辅助育种和功能基因学的研究中得到了广泛的应用。结合PCR技术、电泳、荧光等方法的SNP检测方法，在动植物遗传育种中起到重要作用。高邮鸭是全国三大名鸭之一，生长发育快，肉质好，属于肉蛋兼用型地方品种。在育种工作中，与改变个体遗传特性(人工诱变)相比较，改变品种遗传结构相对容易。而现有技术中尚未发现与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记与应用。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记、其获取方法及应用。
本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记，所述分子标记位于SEQIDNO:1所示核苷酸的第185位，该位点的核苷酸为C或T。
本发明还提供了一种获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，PCR扩增高邮鸭基因组DNA，扩增产物经连接酶检测反应后测序，通过序列分析获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记。
其中，PCR扩增所用引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
其中，连接酶检测反应所用探针序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。
其中，连接酶检测反应产物长度101bp的为基因型CC，连接酶检测反应产物长度103bp的为基因型TT，连接酶检测反应产物长度101bp和103bp的为基因型CT。
本发明还提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记在筛选高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记，针对该分子标记单核苷酸多态性，设计特定的引物扩增包含SNP位点的基因片段，然后进行连接酶检测反应，测序分析，能够简单、快速、低成本、精确地检测其单核苷酸的多态性。对上述SNP位点的基因型与高邮鸭育成中期体重、胸肌增重进行关联分析，可以用于家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据。本发明分子标记为筛选高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状提供了新的方法。
附图说明
图1是ABI3730型基因分析仪检测与Genemapper分析结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
本发明的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记，所述分子标记位于SEQIDNO:1所示核苷酸的第185位，该位点的核苷酸为C或T，导致该基因位点的单核苷酸多态性，该核苷酸序列为鸭MSTN基因的部分基因组序列。
针对上述第185位的单核苷酸多态性，本发明还公开了其获取的方法，其中用于扩增所述MSTN基因和检测该基因位点突变的正反向引物对序列如SEQIDNO：2-3所示。
其中用于对上述扩增产物进行连接酶检测反应(LDR)，所需的LDR探针序列如SEQIDNO：4-6所示。
本发明的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记用于筛选高邮鸭体重、胸腿肌重和胸肌肌纤维性状。
本发明的获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，包括以下步骤：
1、鸭血样的采集
本发明的试验鸭来自江苏省高邮鸭集团，在相同的日粮水平下饲喂的同日龄高邮鸭种鸭群。采用一次性注射器从鸭翅下静脉中抽取1ml血液，注入经高压灭菌并装有200μl2％无菌的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的1.5ml离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。
2、DNA的提取
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法
(1)取上述全血30μl置于1.5ml离心管，分别加入470μl1×SET缓冲液、12.5μl20％SDS(十二烷基硫酸钠)和6μl的10mg/ml蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
(2)取出样本于1.5ml离心管，加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；
(3)取上清，再次加入500μl饱和苯酚，轻摇20min，10000rpm离心10min；
(4)取上清，加入500μl氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10000rpm离心10min；
(5)取上清，加入1ml冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10000rpm离心10min后倒出乙醇；
(6)用1ml75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
(7)待DNA完全干燥后加入300μl灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；将DNA原液1：100稀释并进行分光光度计检测浓度，OD值为1.85-1.94。
(8)将DNA浓度稀释到50ng/μl，存放于-20℃冰箱中保存备用。
3、PCR扩增
扩增包含C185T位点的片段：根据GenBank的鸭基因组中MSTN基因(NW_004676457)全序列设计包含该位点的正反向引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以上述高邮鸭基因组为模板，在包含待测位点序列的正反向引物、TaqDNA聚合酶、缓冲环境、dNTPs存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，PCR产物大小为207bp，用于LDR反应。
所述引物对序列如下：
上游引物序列为：5’-AGCCATCGCTACTGTCGTCT-3’(SEQIDNO：2)；
下游引物序列为：5’-ATGGACTGTGCAATGCTTGT-3’(SEQIDNO：3)
PCR扩增反应的具体步骤为：
1)PCR扩增反应体系准备：50ng/μlDNA模板1μl、2mMdNTP2μl、3mMMg2+0.6μl、10×PCR反应缓冲液2μl、10μM上下游引物各0.4μl、1U/μlTaq聚合酶0.2μl，加ddH2O至总体积20μl。
2)PCR扩增反应程序设置：在Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystems9600上进行扩增反应，PCR扩增反应程序为：95℃变性2min，40次循环(94℃90s，50℃1min30s，65℃30s)65℃延伸10min，得到PCR扩增产物。
3)反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功，剩余反应产物在-20℃的条件下保存。
4、连接酶检测反应(LDR)
设计三条LDR探针，然后进行LDR反应；所述三条探针的序列分别如下：
C185T_modify:
P-TGGAGACAGAATACAAAATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM(SEQIDNO:4)
C185T_C：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGACTGTGCAATGCTTGTACG(SEQIDNO:5)
C185T_T：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGGACTGTGCAATGCTTGTACA(SEQIDNO:6)
其中，C185T-modify的3’末端带有FAM修饰(蓝色荧光)，5’端磷酸化，以便与其它两条特异性的探针连接；探针C185T-C的3’末端碱基与C对应，探针C185T-T的3’末端碱基与T对应。
LDR反应的具体步骤为：
1)在PCR扩增产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接酶检测反应的模板；
2)在200μl的PCR薄壁管中，加入4μl模板，1μl1×Buffer、1μlProbemix(2pmol/μl)、0.05μlTaqDNAligase(2U/μl)、4μlddH2O，充分混匀后短暂离心，最后加入10μl石蜡油；
3)将PCR反应管放入PCR仪进行连接酶检测反应，反应扩增程序为：95℃变性2min，40次循环(94℃15s，50℃25s)；
4)在每个上样孔中加入10μlLoadingBuffer，0.25μlABIGS-500ROX荧光标记分子量标准，最后加入0.5μl的LDR产物，充分混匀后上样，运用ABI3730测序仪进行测序胶毛细管电泳；
5)应用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准。
5、基因型分析与判定
上述LDR反应产物由ABI3730型基因分析仪检测，根据LDR产物的长度与各基因型通过Genemapper进行关联分析，分型图见附图1，基因型CC的LDR产物长度为101bp，基因型TT的LDR产物长度为103bp，基因型CT的LDR产物长度为101bp和103bp的混合。
6、SNP分子标记位点与性状的关联分析
表1SNP分子标记位点与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长性状的相关性分析
注：()内数字表示个体数；同行数据，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著。
对MSTN基因的SNP分子标记的不同基因型与49日龄高邮鸭育成中期体重、胸肌增重进行了关联分析的检测应用。关联分析结果如表2所示，SNP分子标记位点与高邮鸭49日龄体重、胸肌重、胸肌面积、胸肌直径呈显著相关(P<0.05)；其中基因型CC在各日龄阶段的体重显著高于基因型TT和CT，比较TT和CT，各日龄体重差异并不显著，所有CC基因型为优势基因型。在育种筛选中，只选择CC型，可以在群体中固定该基因型。
本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于SEQIDNO:1所示核苷酸的第185位，该位点的核苷酸为C或T。
2.一种获取权利要求1所述的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，其特征在于，PCR扩增高邮鸭基因组DNA，扩增产物经连接酶检测反应后测序，通过序列分析获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记。
3.根据权利要求2所述的获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，其特征在于，PCR扩增所用引物对序列如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示。
4.根据权利要求2所述的获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，其特征在于，连接酶检测反应所用探针序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。
5.根据权利要求2所述的获取与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记的方法，其特征在于，连接酶检测反应产物长度101bp的为基因型CC，连接酶检测反应产物长度103bp的为基因型TT，连接酶检测反应产物长度101bp和103bp的为基因型CT。
6.权利要求1所述的与高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关的分子标记在筛选高邮鸭育成中期体重、胸肌增长相关性状中的应用。
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