CN105330747A - 一种人干扰素IFN-α2a与LL-37的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人干扰素IFN-α2a与人抗菌肽LL-37的基因改造、融合表达与纯化。所获得的IFN-α2a与LL-37融合蛋白同时具有IFN-α2a的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性。

Description

一种人干扰素IFN-α2a与LL-37的融合蛋白

技术领域

本发明属于生物工程技术领域

背景技术

蛋白融合技术，是通过DNA重组技术获得两个基因重组后的表达产物。现广泛用于新的蛋白药物或新功能蛋白分子产品的开发。

蛋白融合的目的包括：一是使一种分子具有两种蛋白的功能。例如，将人B7-2分子与荧光蛋白融合表达，使新形成的融合蛋白同时具有B7-2分子的功能和荧光蛋白的功能。二是增加二种蛋白中某一蛋白的稳定性以提高其效率，例如将人干扰素蛋白与人血清蛋白融合表达，就可以提高干扰在人体内的半衰期。三是蛋白产物定向的需要。例如将信号肽序列与目标蛋白融合表达，就可以实现产物的胞外表达。

目前干扰素均通过基因工程技术生产。α干扰素在生产和使用过程中存在的主要问题一是基因工程菌产量低，生产成本高；二是α干扰素分子量小，容易被肾小球滤过，临床应用时半期短，约每2天就需要重新用药一次。对于产量低的问题，目前主要通过优化表达系统和发酵工艺方面着力。对于半衰期短的问题，目前常采取的方法包括PEG修饰以增加分子量，掩盖分子表面的抗原决定簇和蛋白酶作用位点；同人白蛋白或免疫球蛋白Fc片断融合增加分子量，减少肾小球滤过；在合适的位置引入糖基化掩蔽蛋白酶位点和增大分子量等。很多病毒均具有诱发肿瘤的能力，因此同时具有抗病毒与抗肿瘤能力的α干扰在此类疾病的治疗方面作用重要。同时，多数肿瘤患者由于其自身的免疫系统不同程度的受到破坏，因此，还需特别预防细菌感染。基于临床需要同时抗菌、抗细菌和抗肿瘤的特点，将人IFN-α2a与LL-37经过按毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，构建高产工程菌，在此基础上生产出长效的三联干扰素。

发明内容

1.人LL-37与IFN-α2aDNA序列的密码子优化

在保证人LL-37与IFN-α2a氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris对密码子的偏好性特点，对他们的DNA序列进行优化。

2重组质粒构建

分别用EcoRI和NotI双酶切pPIC9K和pMD-18Fall-IFN质粒，经凝胶电泳后切胶分别回收约9300bp利700bp的片断，用胶回收试剂盒回收片断，并用T4ligase连接，构建分泌型重组质粒pPIC9K-Fall-IFN，用CaCl法转化大肠杆菌DH5α，利用LB-Amp平板筛选重组子。挑选阳性转化子送上海生工进行测序，确定质粒的结构。

3重组质粒转化毕赤酵母

用SacI单酶切pPIC9K-Fall-IFN成线性重组质粒，通过电击转化法将其转入P.pastorisGS115中构建重组菌P.pastorisGS115LI。电击条件为1500kV，200Ω，25μF。转化液涂布于MD平板30℃静止培养3天，挑选阳性克隆，摇瓶后，用真菌基因组提取试剂盒提取基因组进行PCR鉴定。引物为：SenseP1：TTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTC，AntisP2：TCACTCCTTAGATCTCAAAGACTC，退火温度为58℃，以GS115基因组及未加模板的体系为对照组。

4重组菌表型鉴定及多拷贝筛选

通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将PCR鉴定的阳性转化子编号，并将每菌株用灭菌牙签同时接种MD和MM平板，30℃静止培养5天，观察各菌株在两种平板上的生长情况。

通过遗传霉素(G418)浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的YPD平板，然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭菌牙签点在5个遗传霉素梯度平板上，30℃静止培养4天，观察结果，能在高浓度下生长良好的菌株为多拷贝菌株。

5融合蛋白发酵与纯化

将筛选的重组菌株，接种于25mLBMGY培养液中，30℃250rpm/min培养约16h，至菌液OD₆₀₀≈5，4℃4000rpm/min离心5min，收集菌体，用25mLBMMY培养液重悬细胞，诱导培养，每24h按体积比为0.5％加入纯甲醇，连续诱导144h以上，4℃12000rpm/min离心5min，收集上清于-20℃冻存待用。

上清液中的融合蛋白先用35％饱和度(NH₄)₂SO₄盐析，12000rpm/min离心收集盐析沉淀，再将沉淀溶于0.8mol/L(NH₄)₂SO₄(pH8.3)，上样Phenyl-SepharoseFF疏水柱，用0.5mol/L(NH₄)₂SO₄洗脱后透析除盐，样品浓缩后再上样DEAESephadexA-25阴离子交换柱，采用0.3mol/LNaCl洗脱，收集含目的蛋白洗脱峰，浓缩后采用Sephacyal-HR200分子筛脱盐，冷冻干燥得最终产品。

6IFN-α2a与LL-37融合蛋白的检测

6.1融合蛋白纯度检测

用SDS-PAGE法检测融合蛋白纯度，检测参照文献进行。以Takara蛋白分子质量标准(低)为Marker。以未经诱导的发酵液为空白对照。

6.2融合蛋白浓度检测

以牛血清白蛋白为标准，按Lowry法测定融合蛋白浓度。

6.3融合蛋白产物活性分析

培养液中IFN-α2a的活性分析参照《中国药典2010版》中《干扰素效价测定(细胞病变抑制法)》。活性标准品购自广州市药品检测所。以总IFN-α2a活性计算纯化过程中的回收率。

培养液中LL-37的活性测定参照文献17。用大肠杆菌ATCC25922以及ML35p作为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发酵液，37℃孵化3h后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养20h，测量无菌生长的透明环直径。抗菌活性以下式计算：

抗菌活性单位(U)＝(抗菌环直径-3)×10

附图说明

图1重组质粒pPIC9K-Fall-IFN构建过程

图2重组P.pastorisGS115LI与原始菌P.pastorisGS115基因PCR结果

1道为200bpmarker，2、3、4、5道为P.pastorisGS115LI，6、7、8为P.pastorisGS115。

图3经过诱导和未诱导的GS115LI1发酵液的SDS-PAGE。

具体实施方式

下面结合附图和实施例子对本发明作进一步说明，但本发明并不限于此。

1IFN-α2a与LL-37的密码子优化

自Genebank中查询，获得Homosapiensinterferonalpha2a序列，SequenceID：gb|JN848522.1，全长为567序列，按毕赤酵母密码子偏好性优化后，所得结果见SEQIDNo.2。

自Genebank中查询的人抗菌肽LL-37基因，按毕赤酵母密码子偏好性优化后，所得结果见SEQIDNO.3。

2人LL-37与IFN-α2a融合重组质粒的构建

经过优化的人LL-37DNA序列(3′端不带终止密码子)，通过4个甘氨酸和1个丝氨酸与IFN-α2a柔性联结。重组质粒pPIC9K-Fall-IFN的构建过程见图1。

将构建的质粒pPIC9K-Fall-IFN转入化感受态E.coliDH5α，所挑选的阳性转化子经摇瓶提取质粒，用EcoRI和NotI双酶切鉴定得到大小约为9300和690的两条片断，与预期的结构一致。同时将质送样测序，得到的DNA序列与设计的结果一致。

3重组质料pPIC9K-Fall-IFN整合入毕赤酵母GSP115

重组菌P.pastorisGS115LI与原始菌P.pastorisGS115基因PCR结果电泳图见图2。

重组酵母基因组可扩增得到大小约为690bp的条带，而空白的原始菌株GS115却在相应位置未出现相应的条带，这表明重组质粒pPIC9K-Fall-IFN成功整合进入了酵母的基因组中，所获得的重组菌P.pastorisGS115LI与预期结果一致。

4筛选Mut⁺及多拷贝编码基因重组菌

P.pastorisGS115为组氨酸缺陷型(His^-)，因此不能在不含组氨酸的MD平板上生长。整合了含组氨酸编码基因(His4)质粒pPIC9K-Fall-IFN的菌株P.pastorisGS115LI，由于获得了组氨酸的合成能力，因此可以在不含组氨酸的MD平板上正常生长，以此证明重组菌株P.pastorisGS115LI可以正确的表达质粒pPIC9K-Fall-IFN的转录单元。实验结果表明，前述实验所筛选出来的阳性克隆pPIC9K-Fall-IFN均可以在MD平板上正常生长，表明他们都具有正确的表型(Mut^-)。

通常情况下，重组菌株中质粒pPIC9K-Fall-IFN的拷贝数越高，其表达目的产物的能力就越强，同时对遗传霉素G418的抗性就越强。因此，通过遗传霉素浓度梯度筛选出在高浓度下生长的菌株，即表明其具有较高的拷贝数。本实验得到了在遗传霉素为3mg/mL浓度下能正常生长的重组菌二株，分别命名为GS115LI1和GS115LI2，以供后续实验。

5表达产物IFN-α2a与LL-37融合蛋白的分子检测

表达产物IFN-α2a与LL-37融合蛋白的分子检测结果见图3。

从图中可以看出，在蛋白Marker的20.1至29kDa之间，如图中箭头所示，诱导的具有明显的条带，未诱导的在相应位置没有条带。LL-37与IFN-α2a融合蛋白的分子量约为26kDa，与图中预期的一致。因此，可以判断GS115LI1成功表达出了所需的LL-37与IFN-α2a融合蛋白

6重组菌株GS115LI产物活性分析

融合蛋白的抗病毒活性与抗菌活性测定结果见表1。

表1LL-37与IFN-α2a融合蛋白抗病毒与抗菌活性检测

从表1中可以看出，重组菌GS115LI1与GS115LI2经诱导后的发酵液中均能检出较高的抗病毒和抗菌活性，这说明了融合蛋白保证了二者各自的活性功能。

7融合蛋白纯化结果

融合蛋白的纯化结果见表2。

表2LL-37与IFN-α2a融合蛋白纯化过程中的纯度与回收率

从表中可以看出，在LL-37与IFN-α2a融合蛋白纯化过程中过程中，总的回收率为46.2％，其中疏水层析的损失最大，达到20.2％，其次为盐析损失19.0，阴离子交换层析损失14.6％。最终产品的纯度达到97％，满足了医用产品的质量标准。利用Lowry法检测分子筛脱盐后的溶液融合蛋白总量(相当于牛血清白蛋白)为378.4mg，换算成产品的IFN-α2a活性为2.6×10⁸IU/mg，发酵液中产物的产量为819.1mg/L。

Claims (6)

1.一种人干扰素IFN-a2a与LL-37的融合蛋白，其是：

a)具有与SEQIDNo.1的1-232位氨酸序列所示的肽链，或

b)在SEQIDNo.1基础上通过缺失、突变、重组获得的具有人干扰素IFN-α2a与LL-37活性的多肽。

2.权利要求1的IFN-α2a与LL-37的融合蛋白，由人IFN-α2a通过接头GlyGlyGlyGlySer与LL-37相连。

3.权利要求1的IFN-α2a来源于人，并按毕赤酵母的密码子偏好性改造而成。

4.权利要求1的LL-37来源于人，并按毕赤酵母的密码子偏好性改造而成。

5.权利要求1的IFN-α2a与LL-37的融合蛋白同时具有IFN-α2a的抗病毒活性与LL-37的抗菌活性。

6.权利要求1的IFN-α2a与LL-37的融合蛋白可通过基因工程重组的毕赤酵母表达，并通过盐析、疏水层析和阴离子交换得到。