CN105316314A

CN105316314A - 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105316314A
Application number: CN201410364761.5A
Authority: CN
Inventors: 侯小虎; 何成宜; 陈志英
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen new Connaught micro ring Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN105316314B

Abstract

本发明提供了一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用，所述制备方法包括：1)提供含有靶标序列的亲本质粒，所述亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；2)将所述亲本质粒转化到宿主细胞，经诱导后所述亲本质粒通过位点特异性重组作用产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；3)裂解宿主细胞，对质粒进行预纯化，得到混合质粒，所述混合质粒中包括微环DNA、含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA；4)采用三螺旋纯化法去除混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到高纯度的微环DNA。

Description

一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纯化用于基因治疗的表达载体，属于质粒载体的制备领域，具体涉及一种高纯度的微环DNA的制备方法及其应用。

背景技术

在基因治疗中，一个高效、安全的载体将目的基因转移至真核细胞内表达是至关重要的。目前用于基因治疗的载体大致可分为两大类，即病毒载体和非病毒载体。在基因治疗载体中，重组腺病毒载体应用于临床占23.8％，逆转录病毒载体占20.7％，质粒载体占18.3％(MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009))。

虽然病毒载体在体内的转染率高，但存在一些安全隐患，如病毒基因有整合到宿主基因组、免疫原性等潜在风险。

相对于病毒载体，传统的质粒载体转染率低，临床用量达毫克级，但比病毒载体安全。然而，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐藏的表达信号(JechlingerW.等,ExpertRevVaccines,5(6):803-825(2006))，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗中可能引起严重的生物的安全性问题。除此之外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播，如Pang等将不含真核启动子的质粒通过肌肉注射到兔体内，结果细菌基因表达导致兔发生严重免疫反应(PangAS.等,BiochemBiophysResCommun,202(3):1227－1234(1994))。另外，隐藏在真核表达信号上游的抗性基因还会导致哺乳动物细胞中基因的表达发生改变(HartikkaJ等,HumGeneTher,7(10):1205－1217(1996)；ValeraA等,HumGeneTher,5:449－456(1994))。此外，细菌序列的存在也会导致目的基因表达沉默。

微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性(ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)；ChenZY等,Moleculartherapy,16(3):548－556(2008))。与病毒载体、质粒载体相比，无论是在体内还是体外进行基因表达，微环DNA减少了发生炎症和基因沉默的可能，表达周期更久，基因表达强度增强10-1000倍(MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009)；ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)；US,897,380B2)。

WHO^[1],EMEA^[2],FDA^[3]指出的DNA投递的风险是外来DNA整合到受体基因组DNA上造成的插入性基因突变或者是抗生素基因表达的风险。如果投递的质粒DNA被线性化这种基因组整合的机会会明显提高。质粒载体有三种拓扑结构：超螺旋、环状、线性。这就是权威组织要求用于基因治疗的质粒含有高成分的超螺旋结构的原因(StenlerS等,HumVaccinImmunother,SafetyandefficacyofDNAvaccines:Plasmidsvs.minicircles,10(5),2014)。FDA建议超螺旋结构超过80％^[3]。投递超螺旋结构的微环DNA的一个主要优势是它被认为没有基因组整合的风险。在最近的一个研究中，Stenleretal.研究了微环DNA和质粒DNA注射到老鼠体内的命运。让人印象深刻的是，质粒DNA被部分摧毁达不到FDA80％超螺旋结构的要求。但是微环DNA的命运要好得多，摧毁的微环DNA不到摧毁的质粒DNA的10％(StenlerS等,HumVaccinImmunother,SafetyandefficacyofDNAvaccines:Plasmidsvs.minicircles,10(5),2014)。在另一个研究中，环状的载体被认为比同样长度的线性的载体更能抵抗剪切力，而超螺旋结构更能抵抗剪切力使载体不被摧毁。这些结果表明微环DNA的另一个优势：抵抗剪切力使载体不被摧毁(CataneseDJ等,GeneTher,19(1):94-100(2012))。

[1]WHO(2007).TheWHOExpertCommitteeonBiologicalStandardization56threport:Number941.Geneva:WorldHealthOrganization.

[2]EMEA(2000).NoteforGuidanceontheQuality,PreclinicalandClinicalAspectsofGeneTransferMedicinalProducts.CPMP/BWP/3088/3099.

[3]FDA(2007).Guidanceforindustry:considerationsforplasmidDNAvaccinesforinfectiousdiseaseindications.

微环DNA的生产是通过传统质粒在大肠杆菌体内通过特异性重组位点的位点特异性重组得到的。位点特异性重组主要有phiC31(ΦC31)重组酶系统、parA重组酶系统、Cre重组酶系统(胡春生等,生物技术通讯,22(1):104-109(2011))，微环DNA的生产应用最多的是phiC31重组酶系统。phiC31重组酶来源于链霉菌噬菌体，是一种位点特异性的整合酶。它能有效地介导噬菌体基因组中attP位点与细菌宿主染色体上attB位点之间的重组反应。重组的特异位点称为att结合位点，细菌的att称作attB(attbacteria)；噬菌体的att称作attP(attphage)。phiC31重组酶系统在大肠杆菌中的理论重组效率为100％，在哺乳动物细胞中的重组率大于50％。phiC31重组酶识别的attB、attP位点的最小识别序列(attB如SEQIDNO:19所示，attP如SEQIDNO:20所示)。

本申请发明人优选通过BP重组系统(phiC31系统)得到的微环DNA(微环DNA制备方法参照Kay,MA等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010)；US,897,380B2)。该技术与早期的微环DNA生产技术相比，有3个优点。第一，程序非常简单，与普通质粒的构建程序相比，在加入L-阿拉伯糖后，仅需要一个额外的温度变化和5小时的孵化程序；第二，与早期的微环DNA生产技术相比，产量增加3-5倍,微环DNA产品所含杂质减少了10倍；第三；生产微环DNA的成本大大降低，与标准质粒相似。由于基因载体技术是基因治疗的核心技术，具有很强的通用性，同一种载体可以携带任意的目的基因，都具有基本相同的生产工艺和质量标准。因此，该技术的发展为本项目的完成奠定了坚实的基础。卓越的功能，方便的生产技术，微环DNA已成为最佳的非病毒基因载体，被斯坦福和许多大学、公司用于基因治疗和其它研究，并有很多成功的临床前实验报告。美国SBI等多个公司，已构买微环DNA的使用权或销售有关产品。

具体步骤包括：将含有亲本质粒的大肠杆菌基因工程菌Escherichiacoli(E.coli)ZYCY10P3S2T培养12-16h，在阿拉伯糖的诱导作用下，E.coliZYCY10P3S2T表达重组酶phiC31和识别Sce-I位点的核酸内切酶。phiC31介导亲本质粒attB和attP重组，亲本质粒产生微环DNA和骨架DNA。核酸内切酶特异性识别骨架DNA的Sce-I位点，骨架DNA被剪切成线性DNA近而被DNA酶消化。微环DNA经亲和柱吸附提取后即获得大量微环DNA。微环DNA是体内重组的产物，由于位点特异性重组酶和内切酶的表达强度不同，位点特异性重组的效率从50％-99％不等(MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009)；Kay,MA等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010)；JechlingerW等,JMolMicrobiolBiotechnol,8(4):222-231(2004)；JournalofGeneMedicine,2008,10(11):1253-1269.MayrhoferP等,JournalofGeneMedicine,10(11):1253-1269(2008))。

然而，在上述制备微环DNA的方法中，尽管这种经BP重组和线性消化获得的微环DNA采用目前行业内现有的质粒提纯技术进行纯化，但是纯化后的微环DNA中仍然存在着1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒(Kay,MA等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010))。而这1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒的存在给微环DNA的临床应用带来了隐患。为了克服这一障碍，扩大微环DNA基因治疗的范围，满足WHO、EMEA、FDA临床质粒产品和药用的要求，必须有效地去除微环DNA中存在的1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒(“WHO(2007).TheWHOExpertCommitteeonBiologicalStandardization56threport:Number941.Geneva:WorldHealthOrganization”；“EMEA(2000).NoteforGuidanceontheQuality,PreclinicalandClinicalAspectsofGeneTransferMedicinalProducts.CPMP/BWP/3088/3099”；“FDA(2007).Guidanceforindustry:considerationsforplasmidDNAvaccinesforinfectiousdiseaseindications”.)。

因此，有必要提供一种高纯度的微环DNA及其制备方法和应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了高纯度的微环DNA及其制备方法和应用。

本发明提供了的高纯度的微环DNA及其制备方法和应用具有如下有益效果：

由于微环DNA、骨架质粒、或亲本质粒同为DNA序列，它们的区别仅在于核苷酸序列上的不同，传统的质粒提纯方法无法有效分离这三种质粒。

三链DNA纯化技术是一种序列特异性结合分离的技术。本发明通过对亲本质粒进行改造，使得三链DNA纯化技术能用于分离微环DNA。本发明提供的微环DNA纯化方法整合了传统质粒的大量生产技术以及序列特异性结合的三链DNA纯化技术，从而达到了制备临床级别微环DNA的纯化要求。

本发明提供的高纯度的微环DNA的制备方法，采用质粒预纯化和三螺旋纯化两步除杂方法相结合的优势，解决了现有质粒纯化技术无法将微环DNA中从微环DNA于骨架质粒和/或亲本质粒的混合物中进行分离的问题，从而提供了满足临床应用的需求的高纯度的微环DNA，提高了微环DNA临床应用的安全性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的微环DNA在宿主E.coliZYCY10P3S2T中的形成过程示意图；

图2为本发明实施例提供的采用三螺旋亲和法纯化微环DNA的流程示意图；

图3～图17分别为本发明实施例提供的质粒图谱，其中，图3～图17本发明实施例提供的含靶标序列的亲本质粒Triplex15、Triplex21、ATriplex15DsRed、Triplex15DsRed、ATriplex21DsRed、2TTTriplex21DsRed、Triplex21DsRed、ZY781-Triplex15、ZY781-Triplex21、Triplex21CMV.bpA、Triplex21RSV.bpA、Triplex21Ubc.bpA、Triplex21ApoE.bpA、Triplex21Luc和Triplex21LDLR的质粒图谱；

图18为本发明验证实施例提供不同数量的三链DNA序列、含有亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图，所有质粒均经过EcoRI内切酶消化；

图19为本发明验证实施例提供的含有亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图，所有质粒均经过EcoRI内切酶消化，其中，图A～图D分别为含1％、2％、5％和10％亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图；

图20本发明实施例制备的含有亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图。

本发明详述

本发明第一方面提供了一种高纯度的微环DNA的制备方法，包括如下步骤：

1)提供含有靶标序列的亲本质粒，所述含有靶标序列的亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；所述含有靶标序列的亲本质粒通过所述特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；所述靶标序列为双链DNA，所述靶标序列含有与第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列，所述微环DNA不含有与所述第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列；

2)将所述含有靶标序列的亲本质粒转化到宿主细胞，经诱导后所述含有靶标序列的亲本质粒通过特异性重组位点的位点特异性重组作用产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；

3)裂解宿主细胞，对质粒进行预纯化处理，得到混合质粒，所述混合质粒中包括微环DNA、含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA；

4)采用三螺旋纯化法去除所述混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到所述高纯度的微环DNA。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒为在所述p2ФC31空质粒或pMC.BESPX空质粒的多克隆位点插入有目的基因表达盒而制得。

本发明所述的微环DNA具有所述微环DNA的核苷酸序列。

本发明所述的含有靶标序列的骨架DNA具有所述骨架DNA的核苷酸序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA不具有靶标序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA具有靶标序列，所述微环DNA上的靶标序列与所述含有靶标序列的骨架DNA上的靶标序列不同时为同一种序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA具有目的基因。

进一步优选地，所述目的基因为蛋白质的编码基因或小分子RNA的编码基因。

进一步优选地，所述目的基因为红色荧光蛋白DsRed基因、luciferase基因或LDLR基因。

在本发明一个实施例中，所述红色荧光蛋白DsRed基因的Genebank登录号为FJ226077.1。

在本发明一个实施例中，所述红色荧光蛋白luciferase基因的Genebank登录号为U03687.1。

在本发明一个实施例中，所述红色荧光蛋白LDLR基因的Genebank登录号为NM_000527.4。

如本文所述，“蛋白质的编码基因”包括但不限于抗原或抗体基因。

所述抗原或抗体包括但不限于天然的、重组的抗体、抗原或抗原表位。

所述抗原或抗体包括但不限于人源或鼠源抗体。

所述抗体包括但不限于治疗性的抗体。

所述抗体可以为单靶向、双靶向或多靶向抗体。

如本文所述，“靶向”是指抗体特异性地结合抗原，“双靶向”是指抗体具有两个与抗原特异性结合的位点，“多靶向”是指抗体具有两个以上的与抗原特异性结合的位点。

如本文所述，“小分子RNA的编码基因”包括但不限于可以转录siRNA、shRNA、dsRNA或miRNA的基因。

如本文所用，所述的“多克隆位点”是指质粒载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

如本文所用，所述的“目的基因”是指所有需要研究的DNA分子，如与细胞或被导入细胞的受试者部分或完全异源的核酸序列。目的片段可以来自基因组DNA，也可以来自cDNA、人工合成的DNA，而当前最多的是PCR产物(包括RT-PCR产物)。

如本文所用，所述的“目的基因表达盒”为插入载体多克隆位点的序列，用来在细胞中表达目的基因，由于存在相对于所述目的基因的表达调控区域，其所包含的目的基因可被转录，有些RNA继续被翻译以产生具有所需生物活性的多肽或蛋白质，有些RNA能加工成小分子RNA。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有抗性基因，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述抗性基因的上游或下游。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有抗性基因，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述抗性基因的上游和下游。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游或下游。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游和下游。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有至少一个DNA内切酶的酶切位点。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述DNA内切酶为I-Sce1内切酶。

优选地，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列。

所述靶标序列可通过基因重组插入质粒的骨架DNA中，包含靶标序列的质粒DNA为双链结构，包括第一链DNA和第二链DNA，所述第一链DNA和第二链DNA通过碱基互补配对形成DNA双螺旋结构，即第一链DNA和第二链DNA通过经典的Watson-Crick碱基互补作用进行配对。

研究发现，如Frank-KamenetskiiMD等，AnnuRevBiochem，64:65-95(1995)中所述，三链DNA结构是第三条嘧啶排列的单链DNA通过Hoogsteen氢键作用结合到Watson-Crick双螺旋DNA的一种结构。

本发明所述的第三条单链DNA、RNA、PNA或DNG通过Hoogsteen氢键作用结合到Watson-Crick双螺旋DNA，形成三螺旋结构。

如本文所用的，“DNA”为脱氧核糖核苷酸，由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通过3，5-磷酸二酯键连接而成。

如本文所用的，“RNA”为核糖核苷酸，是由核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接而成的多聚体。RNA的碱基主要有4种，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)，其中，U取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基；在本发明中，RNA作为第三条单链与互补DNA作用形成三螺旋结构。

如本文所用的，“PNA”为肽核酸，是指以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架形成的寡聚核酸(ODN)类似物，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构，在本发明中，PNA作为第三条单链与互补DNA作用形成三螺旋结构。

如本文所用的，“DNG”为脱氧核胍，是指以[-NH-C(＝N⁺H₂)-NH-]胍盐为主链代替磷酸二酯键[-O-(PO₂-)-O-]的寡聚核酸(ODN)的类似物，它和PNA一样带正电荷，在与互补DNA作用形成三螺旋时，对Watson-Crick碱基对的相互作用没有影响，且由于静电吸引，与互补DNA作用后有利于三螺旋结构的稳定(凌连生等，分析化学，32(9),1252-1255)。

如本文所用的，“三螺旋结构”包括“三链DNA结构”、“双链DNA-RNA结构”、“双链DNA-PNA结构”或“双链DNA-DNG结构”。

本文所述的三链DNA结构中包括经典的三联体和非经典的三联体。

如本文所用的，“经典的三联体”包括T*AT三联体和⁺C*GC三联体，所述T*AT三联体表示第三条单链DNA中的胸腺嘧啶结合双链DNA中的腺嘌呤-胸腺嘧啶形成的结构，所述⁺C*GC三联体表示第三条单链DNA中的胞嘧啶结合双链DNA中的鸟嘌呤-胞嘧啶形成的结构。

如本文所用的，采用“*”间隔第三条单链的碱基和DNA双链的碱基对。

如本文所用的，“⁺C”表示质子化的胞嘧啶。

由于胞嘧啶C少了一个氢键供给者，作为第3条单链的C需要在酸性pH条件下以质子化状态存在，才能形成稳定的三螺旋结构。

研究发现，第三条单链DNA中的胸腺嘧啶T结合腺嘌呤-胸腺嘧啶形成三链T*AT，第三条单链DNA中的胞嘧啶结合鸟嘌呤-胞嘧啶形成三链T*AT。第三条单链DNA的5’端用生物素标记用于与固定在磁珠上的亲和素(Streptavidine)结合，在磁力的作用下，三链DNA纯化技术满足到达纯化质粒的要求(ItoT等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:495-498(1992)；CostioliMD等,BiotecthnolBioeng,81:535-545(2003)；SchluepT等,NucleicAcidsRes,26:4524-4528(1998))。

在本文一个优选实施例中，第三条单链DNA中的胸腺嘧啶T结合靶标序列中的腺嘌呤-胸腺嘧啶形成三联体T*AT，第三条单链DNA中的胞嘧啶结合结合靶标序列中的鸟嘌呤-胞嘧啶形成三联体C*GC，通过形成三联体的方式，第三条单链DNA与靶标序列形成三螺旋结构。

在本发明一个优选的实施例中，第三条单链DNA的5’端用生物素进行标记，并用于与固定在磁珠上的亲和素(Streptavidine)结合，在磁力的作用下，第三条单链DNA与靶标序列形成的三螺旋结构被分离，得到纯化的微环DNA，满足临床级别的要求。

本发明提供的亲本质粒包括特异性重组位点、含有靶标序列的骨架DNA的序列、微环DNA的序列、以及靶标序列，亲本质粒重组得到微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA后，尽管大部分含有靶标序列的骨架DNA和亲本质粒能被降解，但按现有质粒纯化的方法，无法将微环DNA中残余的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA进行分离。

由于微环DNA、骨架质粒、或亲本质粒同为DNA序列，它们的区别仅在于核苷酸序列上的不同，传统的质粒提纯方法无法有效分离这三种质粒。本发明提供的亲本质粒经过特殊设计，使得靶标序列只存在于亲本质粒和骨架DNA上，而不存在于微环DNA中，从而能够利用三链纯化技术分离微环DNA。如本文所用的，“非经典的三联体”是相对于经典的三联体来说稳定性较弱的结构，比如：C*AT三联体、C*TA三联体、T*TA三联体、T*GC三联体、T*CG三联体或G*CG三联体等。

如本文所用的，“胸腺嘧啶(T)”，它能与双链DNA的双联体AT生成经典的三联体T*AT，也可分别与DNA靶标序列的双联体GC和CG生成非经典的三联体T*GC和T*CG(Soyfer等,Springer,N.Y.，pp.151-193(1996))。

如本文所用的，“鸟嘌呤(G)”，它能与双链DNA的双联体TA生成非经典的三联体G*TA(Soyfer等,Springer,N.Y.，pp.151-193(1996))。

如本文所用的，“胞嘧啶(C)”，它能与双链DNA的双联体GC、AT和TA生成经典的三联体⁺C*GC，或非经典的三联体C*AT和C*TA(Bates等，NucleicAcidsResearch,23(1995)3627)。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列中的任意一条DNA链包括如式I所示的核苷酸序列的至少一种：

I:5’-(W)_n-3’

式中，所述W为碱基序列，在W中的嘧啶碱基数不超过8，所述n为所述靶标序列中任意一条DNA链的碱基总数，所述n为自然数，且6≤n≤60。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值范围为5≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为15≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W中的嘧啶碱基数为2。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W中的嘧啶碱基数为1。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W为只含有嘌呤碱基的核苷酸序列。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W为只含有嘌呤碱基的核苷酸序列，所述嘌呤碱基包括A和G。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W为AG、AGG或AAG的重复序列。

更进一步优选地，所述步骤(1)中，所述AG、AGG或AAG的重复序列的重复次数为3～20。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列中的任意一条DNA链的核苷酸序列如SEQIDNO:1～9所示。

具体的，所述SEQIDNO:1的序列为AGAAGAAAGGAGAAA。

具体的，所述SEQIDNO:2的序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA。

具体的，所述SEQIDNO:3的序列为GAAAGAAGGGAAGGAAAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:4的序列为

GAGGGGAAAGAGAGAGGGAGAGG。

具体的，所述SEQIDNO:5的序列为AGAGAGGGGAGAGAGAGAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:6的序列为GGGGAGGGAGGAAGGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:7的序列为GGGGGAAGGGAGGAGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:8的序列为AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG。

具体的，所述SEQIDNO:9的序列为GAGGAGGGAAGAGGG。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒含有至少一个靶标序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒中，含有2～6个靶标序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒中的靶标序列之间间隔了非靶标序列。

如本文所用的，“非靶标序列”是指不能与双链DNA形成三螺旋结构的序列。

本发明所述的靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的骨架DNA区。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游的靶标序列的数目为2、3或4个。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的下游。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的下游的靶标序列的数目为2、3或4个。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游和上游。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游和下游的靶标序列的数目分别为2、3或4个。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游的靶标序列的数目为2、3或4个。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的下游的靶标序列的数目为2、3或4个。

优选地，所述步骤(1)中，所述靶标序列分别插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游和上游。

进一步优选地，插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游和下游的靶标序列的数目分别为2、3或4个。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链为单链DNA、单链RNA、单链PNA或单链DNG。

如本文所用的，所述第三条单链为RNA时，RNA中的尿嘧啶(U)与双链DNA的双联体AU或TA生成三联体U*AU和U*TA(Bates等，NucleicAcidsResearch,23(1995)3627)，其它碱基三联体的形成机制与本文所述的三链DNA中三联体的形成机制相同。

如本文所述的，所述第三条单链为PNA或DNG时，第三条单链与靶标序列DNA双螺旋之间通过Hoogsteen氢键形成三螺旋的机理与单链DNA相同，这是因为PNA和DNG只是针对核酸骨架进行了改造，相比单链DNA，PNA和DNG的碱基种类并没有改变。

本发明所述的第三条单链的目的是为了与亲本质粒中的靶标序列形成稳定的三螺旋结构，从而在溶液中可以进行分离操作，因此，本发明第三条单链包括但不限于本发明所述的单链DNA、RNA、PNA或DNG，比如本技术领域的技术人员可以根据需要对寡核苷酸的糖链骨架或碱基进行修饰，从而增强寡核苷酸对核酶的抗性、对特异序列的亲和性的化学修饰，或提高三螺旋结构的稳定性。

常见的，可以对第三条单链的胞嘧啶的5位进行甲基化。

甲基化的寡核苷酸在接近中性(pH≥5)的条件下，有助于其结合靶标序列后形成的三螺旋结构的稳定；此外，在所述pH接近中性的条件下，质粒DNA降解的危险性较低。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，经典三联体的数目为t，所述t的取值范围为6≤t≤60，所述经典三联体为T*AT三联体和+C*GC三联体。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目不超过8。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目为2。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目为1。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链的序列包括n个碱基，所述n为自然数，且6≤n≤60。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为15≤n≤30。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链为只含有嘧啶碱基的核苷酸序列，所述嘧啶碱基包括C和T。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链为只含有嘧啶碱基的核苷酸序列，所述嘧啶碱基包括C和U。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链的序列为CT、CCT或CTT的重复序列。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述CT、CCT或CTT的重复序列的重复次数为3～20。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链的序列如SEQIDNO:10～18所示。

具体的，所述SEQIDNO:10的序列为CTTTCTTCCCTTCCTTTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:11的序列为CTCCCCTTTCTCTCTCCCTCTCC。

具体的，所述SEQIDNO:12的序列为TCTCTCCCCTCTCTCTCTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:13的序列为CCCCTCCCTCCTTCCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:14的序列为CCCCCTTCCCTCCTCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:15的序列为TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC。

具体的，所述SEQIDNO:16的序列为CTCCTCCCTTCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:17的序列为TCTTCTTTCCTCTTT。

具体的，所述SEQIDNO:18的序列为CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT。

当第三条单链为RNA时，所述第三条单链(SEQIDNO:10～18)中的碱基T用U替代即为单链RNA的序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA不含亲本质粒中抑制目的基因表达的骨架DNA序列。

如本文所用，“微环DNA”是指不含原核质粒的骨架DNA序列，主要以超螺旋结构存在的载体，能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外稳定持久表达转录或表达目的基因。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA包括任何本领域技术人员根据需要所添加的序列。

如本文所用的，“亲本质粒”是指可以通过位点特异性重组产生含靶标序列的骨架DNA和不含靶标序列的微环DNA的质粒。

如本文所用的，“骨架DNA序列”包括标准质粒中负责细菌质粒的复制、或筛选含质粒的宿主等功能的DNA序列，包括细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序等。

本文所采用的“骨架DNA”和“骨架DNA载体”可以互换。

优选地，所述微环DNA不含亲本质粒中抑制目的基因表达的骨架DNA序列。

本发明采用的微环DNA，由于除去了细菌来源的骨架DNA序列，与病毒载体、质粒载体相比，微环DNA的体内体外基因表达减少了发生炎症和基因沉默的可能，表达周期更久，基因表达强度增强10-1000倍(ChenZY等,GeneTher,,11(10):856－864(2004)；Kay等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010)；美国专利US,897,380B2；MayrhoferP等,MethodsMolBiol,542:87-104(2009))。

优选地，所述微环DNA包括任何本领域技术人员根据需要所添加的序列。

在本文一实施例中，微环DNA可通过传统质粒在大肠杆菌中经过位点特异性重组制得，微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性(ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)；ChenZY,等,Moleculartherapy,2008,16(3):548-556)。

本文所采用的“微环DNA”和“微环DNA载体”可以互换。

优选地，所述步骤(1)中，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。

具体地，所述phiC31特异性重组位点包括attB位点和attP位点。

在本发明一个实施例中，所述含靶标序列的亲本质粒为具有attB位点和attP位点的质粒载体。

具体地，当本发明的含靶标序列的亲本质粒具有attB位点和attP位点时，所述骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列之间分别间隔有所述attB位点和attP位点。

所述attB位点和attP位点能在ΦC31重组酶的作用下进行重组，使得微环母质粒非可逆地产生含有attL位点的质粒骨架DNA和含attR位点的微环DNA。

相应地，所述ΦC31重组酶的表达框可位于含靶标序列的亲本质粒上，由所述含靶标序列的亲本质粒表达。

相应地，所述ΦC31重组酶的表达框可位于含宿主细胞的基因中，由所述宿主细胞表达。

优选地，所述步骤(1)中，所述attB位点的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示。

优选地，所述步骤(1)中，所述attP位点的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。

当本领域技术人员采用parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点构建含靶标序列的亲本质粒时，可以根据本领域常识和常规操作将各特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列进行合理的排列，从而使得含靶标序列的亲本质粒经过特异性重组位点的重组作用产生微环DNA和骨架DNA。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒为p2ФC31空质粒或pMC.BESPX空质粒。

如本文所用，“p2ФC31空质粒”或“pMC.BESPX空质粒”具有attB位点和attP位点，该attB位点和attP位点能在ΦC31重组酶的作用下进行重组。

具体地，所述空质粒p2ФC31构建方法参照ChenZY等,MolecularTherapy,8(3),495-500(2003)、ChenZY等,HumanGeneTherapy,16(1),126-131(2005)和美国专利US7897380B2。

具体地，所述空质粒pMC.BESPX全基因序列参照ChenZY等,NatureBiotechnology,28,(12),1289-1291(2010)。

如本文所用，所述的“质粒”是指在基因工程研究中，可以插入外源DNA井能在受体细胞中复制的DNA结构。

本文所采用的“质粒”和“质粒载体”可以互换。

本发明提供的p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，区别在于：pMC.BESPX无p2ФC31载体上编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶的核苷酸序列，其制备的微环DNA母质粒更加优质，少了重组酶和内切酶的核苷酸序列的污染；但是pMC.BESPX需配套使用了大肠杆菌E.coliZYCY10P3S2T工程菌，因为无编码ФC31重组酶(即phiC31组酶)和I-Sce1内切酶核苷酸序列的pMC.BESPX需要具有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶功能的ZYCY10P3S2T工程菌才能产生体内位点特异性重组(而大肠杆菌E.coliTOP10无此功能)并最终生产出微环DNA；相应的，p2ФC31载体可配套使用TOP10即可产生体内位点特异性重组(而大肠杆菌E.coliTOP10无此功能)并最终生产出微环DNA。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒的多克隆位点插入有目的基因。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链的5’端或3’端具有功能化修饰。

优选地，所述步骤(1)中，所述第三条单链的“功能化修饰”优选为生物素或链霉亲和素修饰。

在此优选条件下，该功能化修饰可以使得本发明的第三条单链特异性的结合具有链霉亲和素或生物素的基质载体；当第三条单链与含有靶标序列的亲本质粒或含有靶标序列的骨架DNA结合形成三螺旋复合物时，该该功能化修饰可以使得所述三螺旋复合物特异性的结合具有链霉亲和素或生物素的基质载体；由于本发明制备的微环DNA不含靶标序列，因此不能被第三条单链结合，从而不能结合到基质载体上，被留在了溶液上清，达到和亲本质粒以及骨架DNA相分离的目的，即纯化微环DNA，去除本质粒以及骨架DNA的目的。

在本文一个实施例中，采用了LifeTechnologies公司的链霉亲和素修饰(M-270Streptavidin货号65306)的磁珠作为基质载体，该磁珠表面共价结合有链霉亲和素；链霉亲和素捕获修饰有生物素的靶分子，如本发明所述的修饰有生物素的第三条单链或三螺旋复合物。

优选地，所述基质载体为具有链霉亲和素或生物素的磁珠。

优选地，所述磁珠为采用行业内常规方法所制备。

优选地，所述步骤(2)中，所述宿主细胞具有经诱导后表达DNA内切酶的基因序列。

在本发明一个实施例中，所述含有靶标序列的骨架DNA被I-Sce1内切酶酶切为线性DNA，继而被宿主菌中的DNA酶降解，有利于微环DNA的分离提纯。

优选地，所述步骤(2)中，所述宿主细胞具有经诱导后表达位点特异性重组酶的基因序列。

优选地，所述步骤(2)中，所述含有靶标序列的骨架DNA具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列。

优选地，所述骤(2)中，所述含有靶标序列的骨架DNA不具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述宿主细胞具有经诱导后表达位点特异性重组酶的基因序列。

如本文所述的，“经诱导后表达”为本领域内常用的诱导蛋白表达的方法，所述的诱导蛋白表达的方法优选为ChenZY等,MolecularTherapy,8(3),495-500(2003)、ChenZY等,HumanGeneTherapy,16(1),126-131(2005)、或ChenZY等NatureBiotechnology,28,(12),1289-1291(2010)中诱导亲本质粒重组产生微环的诱导方法。

优选地，步骤(4)中，所述的对质粒进行预纯化处理的方式为行业内常规质粒提纯方法。

优选地，步骤(4)中，所述三螺旋纯化法制备高纯度的微环DNA的步骤包括：

a)将步骤(1)所述第三条单链的5’端或3’端进行修饰，得到修饰有接头基团的第三条单链；

b)提供基质载体，所述基质载体表面具有与第三条单链上的接头基团特异性结合的官能团；

c)将步骤(a)处理过的第三条单链、步骤(b)提供的基质载体、以及待纯化的混合质粒在溶液状态下相互接触，所述含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA与所述第三条单链形成三螺旋结构复合物，所述三螺旋结构复合物通过第三条单链与基质载体连接，其中，所述基质载体通过与第三条单链上的接头基团特异性结合而连接；

d)采用离心、磁力吸附、或过亲和柱的方式去除所述混合质粒中的含有靶标序列的亲本质粒和/或含有靶标序列的骨架DNA，得到所述高纯度的微环DNA。

优选地，所述步骤(4)的步骤a中，所述接头基团为生物素、巯基、二硫化物、琥珀酰化物、氨基或羧基。

如本文所用，“接头基团”目的是使第三条链通过共价作用偶联到基质载体上，所述基质载体带有官能团，所述官能团能与第三条单链上的接头基团共价偶联，所述官能团为二硫化物、马来酰亚胺、氨基、羧基、酯、环氧基、溴化氰基或醛基。

优选地，所述步骤(4)的步骤b中，所述官能团为二硫化物、马来酰亚胺、氨基、羧基、酯、环氧基、溴化氰基或醛基。

优选地，所述步骤(4)的步骤b中，所述基质载体为色谱载体、塑料、玻璃、磁性胶乳珠或非磁性胶乳珠。

优选地，所述步骤(4)的步骤b中，所述基质载体为凝胶渗透色谱载体。

优选地，所述步骤(4)的步骤b中，所述基质载体是散装的或预先填在柱中的。

如本文所用，“凝胶渗透色谱载体”包括琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖以及它们的衍生物；包括聚合物，例如聚(苯乙烯二乙烯苯)，或接枝或未接枝的二氧化硅。

如本文所用的，修饰在第三条单链上的“接头基团”与修饰在基质载体上的“官能团”包括但不限于本文所例举的具体基团，本领域技术人员可根据需要选择任意合适的修饰，其目的是为了将第三条单链与基质载体进行共价偶联；如本文所用的，马来酰亚胺基团可在中性pH环境特异地共价结合巯基，形成稳定的硫醚键；生物素化的寡核苷酸特异性结合链霉亲和素蛋白包被的基质；NH2修饰的寡核苷酸可以与环氧硅烷衍生的或者异硫氰酸酯包被的玻璃载玻片共价结合，琥珀酰化的寡核苷酸可以与氨基苯基-或者氨丙基-衍生玻璃通过肽键偶联，以及二硫化物修饰的寡核苷酸可以通过硫醇/二硫化物交换反应被固定到巯基硅烷化玻璃。

由于第三条单链与靶标序列形成三螺旋复合物，通过第三条单链与基质载体的共价结合，可以有效将三螺旋复合物吸附在基质载体上。而不含靶标序列的微环DNA不能吸附基质载体，从而得到分离、纯化的目的。

优选地，所述步骤(4)中，所述高纯度的微环DNA中，含有靶标序列的亲本质粒的含量低于3％。

如本文所用，“对质粒进行预纯化处理”采用的是行业内现有的常规质粒提纯方法，比如采用各商业化的质粒纯化试剂盒提取微环DNA。细菌宿主经裂解后，经过行业内常规质粒提纯处理，可有效去除其它细菌基因组核酸、蛋白质、内毒素(例如脂多糖)、核酸酶等的杂质，采用目前行业内现有的质粒提纯方法所得的微环DNA可用于转染、克隆和体外转录，但不适于临床应用。

由于采用目前行业内现有的质粒提纯方法纯化微环DNA后，所得的微环DNA中仍然存在着1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒(Kay,MA等,NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010))。而这1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒的存在给微环DNA的临床应用带来了隐患。为了克服这一障碍，扩大微环DNA基因治疗的范围，满足WHO、EMEA、FDA临床质粒产品和药用的要求，必须有效地去除微环DNA中存在的1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒。

如本文所用，“三螺旋纯化法”的原理是利用第三条单链的中介作用，通过第三条单链与基质载体的共价结合，可以有效将三螺旋复合物吸附在基质载体上。而不含靶标序列的微环DNA不能吸附基质载体，从而得到分离、纯化微环DNA的目的。

结合磁力作用的三链DNA纯化技术满足纯化质粒的要求，用生物素修饰靶分子与链霉亲和素修饰的磁珠结合，在磁力的作用下可以纯化靶分子三链DNA(ItoT等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:495-498(1992)；CostioliMD等,BiotecthnolBioeng,81:535-545(2003)；SchluepT等,NucleicAcidsRes,26:4524-4528(1998))。

在本发明一个实施例中，采用了QIAGEN公司的PlasmidMegaKit(25)试剂盒(货号12183)提取微环DNA(即对微环DNA进行预纯化处理)。所得的微环DNA再经过本发明所述的DNA三链纯化技术纯化微环DNA，有效去除了预纯化的微环DNA中存在的1-3％的骨架质粒和/或亲本质粒，从而满足临床应用的需求，提高了微环DNA临床应用的安全性。

在本发明一个实施例中，按下述步骤纯化获得了高纯度的微环DNA：

1)构建亲本质粒

构建第一种亲本质粒：构建具有1个靶标序列的亲本质粒，所述靶标序列位于亲本质粒的抗性基因的上游，所述靶标序列为AGAAGAAAGGAGAAA(SEQIDNO:1)。

构建第二种亲本质粒：构建具有6个靶标序列的亲本质粒，所述6个靶标序列分别位于亲本质粒的抗性基因的上游和下游，其中，抗性基因的上游和下游各具有3个串联的靶标序列，所述靶标序列为AGAAGAAAGGAGAAA(SEQIDNO:1)。

2)生产微环DNA

亲本质粒重组产生微环DNA：参考Kay,MA等提供(NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010))的方法制备微环DNA的步骤操作，所述含靶标序列的亲本质粒经过阿拉伯糖诱导，在宿主细胞中进行位点特异性重组，产生了含靶标序列的含有靶标序列的骨架DNA和不含靶标序列的微环DNA，大部分所述含靶标序列的骨架DNA被降解；

质粒预纯化：采用PlasmidMegaKit(25)试剂盒提取微环DNA，所得的微环DNA中存在一部分未进行重组的亲本质粒和未被降解的含有靶标序列的骨架DNA；

三链DNA纯化技术纯化微环DNA：在pH4.5(0.2mol/LCH₃COOH；2mol/LNaCl)的环境下，将5’端生物素标记单链DNA(序列Bio-TCTTCTTTCCTCTTT(SEQIDNO:17))、预纯化处理的微环DNA溶液、M-270Streptavidin(Lifetechnologies)试剂盒提供的磁珠混合，所述5’端生物素标记单链DNA特异性结合含靶标序列的亲本质粒以及含靶标序列的骨架DNA，并各自形成三链DNA，同时5‘端生物素与磁珠结合，在磁力的作用下让结合了三链DNA的磁珠沉淀，骨架质粒和/或亲本质粒即被除去；上清液则为微环DNA，吸取上清液做乙醇沉淀得到纯化的微环DNA。

1)构建亲本质粒

构建第一种亲本质粒：构建具有1个靶标序列的亲本质粒，所述靶标序列位于亲本质粒的抗性基因的上游，所述靶标序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA(SEQIDNO:2)。

构建第二种亲本质粒：构建具有2个靶标序列的亲本质粒，所述2个靶标序列位于亲本质粒的抗性基因的上游，所述2个靶标序列之间间隔有非靶标序列，所述靶标序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA(SEQIDNO:2)。

构建第三种亲本质粒：构建具有4个靶标序列的亲本质粒，所述4个靶标序列分别位于亲本质粒的抗性基因的上游和下游，其中，抗性基因的上游和下游各具有2个串联的靶标序列，所述靶标序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA(SEQIDNO:2)。

2)生产微环DNA

亲本质粒重组产生微环DNA：参考Kay,MA等提供(NatBiotechnol,28(12):1287-1289(2010))的方法制备微环DNA的步骤操作，所述含靶标序列的亲本质粒经过阿拉伯糖诱导，在宿主细胞中进行位点特异性重组，产生了含靶标序列的骨架DNA和不含靶标序列的微环DNA，大部分所述含靶标序列的骨架DNA被降解。

3)两步法纯化微环DNA

三链DNA纯化技术纯化微环DNA：在pH4.5(0.2mol/LCH₃COOH；2mol/LNaCl)的环境下，将5’端生物素标记单链DNA(序列Bio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQIDNO:18))、预纯化处理的微环DNA溶液、M-270Streptavidin(Lifetechnologies)试剂盒提供的磁珠混合，所述5’端生物素标记单链DNA特异性结合含靶标序列的亲本质粒以及含靶标序列的骨架DNA，并各自形成三链DNA，同时5‘端生物素与磁珠结合，在磁力的作用下让结合了三链DNA的磁珠沉淀，骨架质粒和/或亲本质粒即被除去；上清液则为微环DNA，吸取上清液做乙醇沉淀得到纯化的微环DNA。

本发明提供的高纯度的微环DNA的制备方法采用质粒预纯化和三螺旋纯化两步除杂方法相结合的优势，即可完成大量抽提质粒的要求，又可有效去除了微环DNA中存在的骨架质粒和/或亲本质粒，解决了现有质粒纯化技术无法将微环DNA中从微环DNA于骨架质粒和/或亲本质粒的混合物中进行分离的问题，从而满足临床应用的需求，提高了微环DNA临床应用的安全性。

采用本发明质粒预纯化和三链纯化两步除杂法可制备高纯度的微环DNA。

优选地，所述高纯度的微环DNA为有效去除杂质的微环DNA。

如本文所用的，“有效去除”是指所制备的微环DNA中的杂质的种类、含量不高于经过本发明提供的两步法除杂后所得的微环DNA中的杂质。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架质粒的含量低于3％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架质粒的含量不高于1％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架质粒的含量不高于0.43％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架质粒的含量不高于0.05％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒的含量不高于0.32ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒的含量不高于0.30ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒的含量不高于0.33ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架DNA的含量低于3％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架DNA的含量不高于1％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架DNA的总含量不高于0.43％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的骨架DNA的总含量不高于0.05％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的骨架DNA的含量不高于0.32ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的骨架DNA的含量不高于0.30ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的骨架DNA的含量不高于0.33ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的总含量低于3％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的总含量不高于1％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的总含量不高于0.43％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的总含量不高于0.05％。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的含量不高于0.32ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的含量不高于0.30ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA中，含靶标序列的亲本质粒和含有靶标序列的骨架DNA的总含量不高于0.33ng/μL。

优选地，所述高纯度的微环DNA为临床级别的微环DNA。

如本文所用，“临床级别的微环DNA”中微环DNA的纯度满足WHO、EMEA或FDA临床质粒产品和药用的要求。

优选地，所述步骤(3)中，本领域技术人员可根据需要，进行重复三螺旋纯化步骤。

进一步优选地，所述三螺旋纯化步骤重复次数为2～4次。

根据本发明第一方面提供了一种高纯度的微环DNA的制备方法，当构建的微环DNA也具有靶标序列，且微环DNA上的靶标序列与骨架DNA上的靶标序列不同时，利用不同靶标序列和不同第三条单链DNA的亲和性，可以对具有不同靶标序列的微环DNA和骨架DNA依次进行分离，有需要时，还可用于微环DNA的富集。

本发明第二方面提供了一种含有靶标序列的亲本质粒，所述含有靶标序列的亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；所述含有靶标序列的亲本质粒通过所述特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；所述靶标序列为双链DNA，所述靶标序列含有与第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列，所述微环DNA不含有与所述第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒含有至少一个靶标序列。

优选地，所述微环DNA不具有靶标序列。

优选地，所述微环DNA具有靶标序列，所述微环DNA上的靶标序列与所述含有靶标序列的骨架DNA上的靶标序列不同时为同一种序列。

当微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA上同时具有不同的靶标序列时，利用不同的靶标序列的结合特异性可以将微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA进行分离。

优选地，所述微环DNA具有目的基因。

所述抗原或抗体包括但不限于人源或鼠源抗体。

所述抗体包括但不限于治疗性的抗体。

所述抗体可以为单靶向、双靶向或多靶向抗体。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有抗性基因，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述抗性基因的上游或下游。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有抗性基因，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述抗性基因的上游和下游。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游或下游。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游和下游。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有至少一个DNA内切酶的酶切位点。

进一步优选地，所述DNA内切酶为I-Sce1内切酶。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列。

优选地，所述第三条单链为单链DNA、单链RNA、单链PNA或单链DNG。

所述靶标序列可通过基因重组插入质粒的含有靶标序列的骨架DNA中，包含靶标序列的质粒DNA为双链结构，包括第一链DNA和第二链DNA，所述第一链DNA和第二链DNA通过碱基互补配对形成DNA双螺旋结构，即第一链DNA和第二链DNA通过经典的Watson-Crick碱基互补作用进行配对。

优选地，所述靶标序列中的任意一条DNA链包括如式I所示的核苷酸序列的至少一种：

I:5’-(W)_n-3’

进一步优选地，所述n的取值范围为5≤n≤30。

进一步优选地，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述n的取值为15≤n≤30。

进一步优选地，所述W中的嘧啶碱基数为2。

进一步优选地，所述W中的嘧啶碱基数为1。

进一步优选地，所述W为只含有嘌呤碱基的核苷酸序列。

进一步优选地，所述W为只含有嘌呤碱基的核苷酸序列，所述嘌呤碱基包括A和G。

进一步优选地，所述W为AG、AGG或AAG的重复序列。

更进一步优选地，所述AG、AGG或AAG的重复序列的重复次数为3～20。

优选地，所述靶标序列中的任意一条DNA链的核苷酸序列如SEQIDNO:1～9所示。

具体的，所述SEQIDNO:1的序列为AGAAGAAAGGAGAAA。

具体的，所述SEQIDNO:2的序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA。

具体的，所述SEQIDNO:3的序列为GAAAGAAGGGAAGGAAAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:4的序列为

GAGGGGAAAGAGAGAGGGAGAGG。

具体的，所述SEQIDNO:5的序列为AGAGAGGGGAGAGAGAGAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:6的序列为GGGGAGGGAGGAAGGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:7的序列为GGGGGAAGGGAGGAGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:8的序列为AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG。

具体的，所述SEQIDNO:9的序列为GAGGAGGGAAGAGGG。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒中，含有至少一个靶标序列。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒中，含有2～6个靶标序列。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒中的靶标序列之间间隔了非靶标序列。

优选地，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游。

优选地，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的下游。

优选地，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的复制起始位点的上游和上游。

优选地，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游。

优选地，所述靶标序列插入所述含靶标序列的亲本质粒的抗性基因的上游和上游。

常见的，可以对第三条单链的胞嘧啶的5位进行甲基化。

优选地，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，经典三联体的数目为t，所述t的取值范围为6≤t≤60，所述经典三联体为T*AT三联体和+C*GC三联体。

优选地，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目不超过8。

优选地，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目为2。

优选地，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，非经典三联体的数目为1。

优选地，所述第三条单链的序列包括n个碱基，所述n为自然数，且6≤n≤60。

进一步优选地，所述n的取值范围为5≤n≤30。

进一步优选地，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述n的取值为15≤n≤30。

优选地，所述第三条单链为只含有嘧啶碱基的核苷酸序列，所述嘧啶碱基包括C和T。

优选地，所述第三条单链为只含有嘧啶碱基的核苷酸序列，所述嘧啶碱基包括C和U。

优选地，所述第三条单链的序列为CT、CCT或CTT的重复序列。

进一步优选地，所述CT、CCT或CTT的重复序列的重复次数为3～20。

优选地，所述第三条单链的序列如SEQIDNO:10～18所示。

具体的，所述SEQIDNO:10的序列为CTTTCTTCCCTTCCTTTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:11的序列为CTCCCCTTTCTCTCTCCCTCTCC。

具体的，所述SEQIDNO:12的序列为TCTCTCCCCTCTCTCTCTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:13的序列为CCCCTCCCTCCTTCCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:14的序列为CCCCCTTCCCTCCTCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:15的序列为TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC。

具体的，所述SEQIDNO:16的序列为CTCCTCCCTTCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:17的序列为TCTTCTTTCCTCTTT。

具体的，所述SEQIDNO:18的序列为CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT。

在本文一实施例中，微环DNA可通过传统质粒在大肠杆菌中经过位点特异性重组制得，微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性(ChenZY等,GeneTher,11(10):856－864(2004)，ChenZY等,.Moleculartherapy,2008,16(3):548-556)。

本文所采用的“微环DNA”和“微环DNA载体”可以互换。

优选地，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。

具体地，所述phiC31特异性重组位点包括attB位点和attP位点。

优选地，所述attB位点的核苷酸序列如SEQIDNO:19所示。

优选地，所述attP位点的核苷酸序列如SEQIDNO:20所示。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有I-Sce1内切酶的酶切位点。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有I-Sce1内切酶的编码基因。

优选地，所述含有靶标序列的骨架DNA含有ΦC31重组酶的编码基因。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒为p2ФC31空质粒或pMC.BESPX空质粒。

进一步优选地，所述p2ФC31空质粒或pMC.BESPX空质粒的多克隆位点插入有目的基因表达盒。

优选地，所述含靶标序列的亲本质粒的多克隆位点插入有目的基因。

优选地，所述第三条单链的5’端或3’端具有功能化修饰。

优选地，所述第三条单链的“功能化修饰”优选为生物素或链霉亲和素修饰。

优选地，所述基质载体为具有链霉亲和素或生物素的磁珠。

优选地，所述磁珠为采用行业内常规方法所制备。

优选地，所述第三条单链的5’端或3’端修饰有接头基团。

进一步有优选地，所述接头基团为生物素、巯基、二硫化物、琥珀酰化物、氨基或羧基。

“接头基团”目的是使第三条链通过共价作用偶联到基质载体上，所述基质载体带有官能团，所述官能团能与第三条单链上的接头基团共价偶联，所述官能团为二硫化物、马来酰亚胺、氨基、羧基、酯、环氧基、溴化氰基或醛基。

如本文所用，“基质载体”优选为为色谱载体、塑料、玻璃、磁性胶乳珠或非磁性胶乳珠。

优选地，所述基质载体为凝胶渗透色谱载体。

优选地，所述基质载体是散装的或预先填在柱中的。

在本发明实施例中，分别制备了MC.Triplex21DsRed、MC.ATriplex15DsRed、MC.2TTTriplex21DsRed、MC.Triplex21Luc、MC.Triplex21LDLR、MC.Triplex15、MC.Triplex21、MC.ATriplex21DsRed、MC.Triplex15DsRed微环DNA。

在本发明一个实施例中，分别制备了临床级别的MC.Triplex21DsRed、MC.Triplex21Luc、MC.Triplex21LDLR微环DNA。

本发明第三方面提供了一种高纯度的微环DNA，所述高纯度的微环DNA通过如下步骤制备：

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA不具有靶标序列。

优选地，所述步骤(1)中，所述微环DNA具有目的基因。

所述抗原或抗体包括但不限于人源或鼠源抗体。

所述抗体包括但不限于治疗性的抗体。

所述抗体可以为单靶向、双靶向或多靶向抗体。

I:5’-(W)_n-3’

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为15≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W中的嘧啶碱基数为2。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述W中的嘧啶碱基数为1。

具体的，所述SEQIDNO:1的序列为AGAAGAAAGGAGAAA。

具体的，所述SEQIDNO:2的序列为GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA。

具体的，所述SEQIDNO:3的序列为GAAAGAAGGGAAGGAAAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:4的序列为

GAGGGGAAAGAGAGAGGGAGAGG。

具体的，所述SEQIDNO:5的序列为AGAGAGGGGAGAGAGAGAGAG。

具体的，所述SEQIDNO:6的序列为GGGGAGGGAGGAAGGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:7的序列为GGGGGAAGGGAGGAGGAGGG。

具体的，所述SEQIDNO:8的序列为AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG。

具体的，所述SEQIDNO:9的序列为GAGGAGGGAAGAGGG。

常见的，可以对第三条单链的胞嘧啶的5位进行甲基化。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为10≤n≤30。

进一步优选地，所述步骤(1)中，所述n的取值为15≤n≤30。

具体的，所述SEQIDNO:10的序列为CTTTCTTCCCTTCCTTTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:11的序列为CTCCCCTTTCTCTCTCCCTCTCC。

具体的，所述SEQIDNO:12的序列为TCTCTCCCCTCTCTCTCTCTC。

具体的，所述SEQIDNO:13的序列为CCCCTCCCTCCTTCCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:14的序列为CCCCCTTCCCTCCTCCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:15的序列为TTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC。

具体的，所述SEQIDNO:16的序列为CTCCTCCCTTCTCCC。

具体的，所述SEQIDNO:17的序列为TCTTCTTTCCTCTTT。

具体的，所述SEQIDNO:18的序列为CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT。

具体地，所述phiC31特异性重组位点包括attB位点和attP位点。

优选地，所述步骤(1)中，所述含靶标序列的亲本质粒为在所述p2ФC31空质粒或pMC.BESPX空质粒的多克隆位点插入有目的基因表达盒而制得。

优选地，所述基质载体为具有链霉亲和素或生物素的磁珠。

优选地，所述磁珠为采用行业内常规方法所制备。

优选地，所述步骤(2)中，所述含有靶标序列的骨架DNA不具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述宿主细胞具有经诱导后表达位点特异性重组酶的基因序列。

1)构建亲本质粒

2)生产微环DNA

1)构建亲本质粒

2)生产微环DNA

3)两步法纯化微环DNA

优选地，所述高纯度的微环DNA为有效去除杂质的微环DNA。

优选地，所述高纯度的微环DNA为临床级别的微环DNA。

进一步优选地，所述三螺旋纯化步骤重复次数为2～4次。

本发明第四方面提供了一种高纯度的微环DNA或高纯度的微环DNA的制备方法在制备质粒纯化试剂盒中的应用。

优选地，所述高纯度的微环DNA的制备方法如本发明第一方面所述。

本发明第五方面提供了一种高纯度的微环DNA或高纯度的微环DNA的制备方法在制备疾病预防、疾病诊断或基因治疗的药物中的应用。

优选地，所述患者为癌症患者或肿瘤患者。

进一步优选地，所述癌症包括但不限于肿瘤、白血病、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌或甲状腺癌。

优选地，所述高纯度的微环DNA如本发明第三方面所述。

优选地，所述高纯度的微环DNA的制备方法参照本发明第一方面所述。

本发明第六方面提供了一种采用高纯度的微环DNA进行基因治疗的方法，包括如下步骤：

1)制备高纯度的微环DNA；

2)将所述高纯度的微环DNA按下述任一步骤操作：

a)将所述高纯度的微环DNA单独用于基因治疗；

b)将所述高纯度的微环DNA与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合用于基因治疗；

c)采用体内靶向投递的方式将所述高纯度的微环DNA直接投递到患者体内进行治疗；

d)先通过体外转染技术将所述高纯度的微环DNA转染免疫效应细胞，然后将所述转染有高纯度的微环DNA的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。

优选地，所述患者为癌症患者或肿瘤患者。

优选地，所述高纯度的微环DNA如本发明第三方面所述。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecμlarCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook,J.,Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3^rdedition,2001,NY,ColdSpringHarbor)。

本发明实施例所使用的菌株E.coliZYCY10P3S2T、肝细胞HepG2细胞均为市售商品，所使用的试剂均为市售商品；所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。

本发明实施例所使用的TB培养基、LB培养基配置如下：

TB培养基：TB肉汤粉(Terrificbrothpowder)47.6g/L；甘油4g/L；pH7.0

LB培养基：胰化蛋白胨(Tryptone)10g/L；酵母粉(Yeastextract)5g/L；NaCl10g/L；pH7.0

本发明实施例所采用引物如表1所示：

表1.本发明实施例所用引物

表1中，下划线标识的序列为限制性内切酶的酶切位点。

备注栏除qPCR外皆表示相对应的引物含有的酶切位点的名称。

备注栏qPCR表示相对应的引物(Kan-F和Kan-R)为用于绝对定量PCR(qPCR)的引物，以本发明实施例提供的亲本质粒triplex21DsRed为模板，并做逐步10倍浓度稀释。

本发明绝对定量PCR用QiagenQuantiFastSYBRGreenPCRkit试剂盒在Rochesystem上完成的。程序包括为:94℃5min,94℃for20s,68℃for20s(40个循环)。实验条件下，相关方程为：C_T＝-3.1226lgX₀+45.26(R²＝0.9988)，X₀为DNA的拷贝数。

在Triplex15-F(SEQIDNO:21)、Triplex15-R(SEQIDNO:22)、Triplex21-F(SEQIDNO:23)、Triplex21-R(SEQIDNO:24)四行中，斜体且加粗的序列为靶标序列，其中，SEQIDNO:21中含有3个重复的、串联的SEQIDNO:1序列(本文中SEQIDNO:1序列又称Triplex15靶标序列)，SEQIDNO:23中含有2个重复的、串联的SEQIDNO:2(本文中SEQIDNO:2序列又称Triplex21)靶标序列；SEQIDNO:22中含有3个重复的、串联的SEQIDNO:17序列，SEQIDNO:24中含有2个重复的、串联的SEQIDNO:18序列。

在ATriplex15-F、ATriplex21-F、2TTTriplex21-F三行行中，斜体且加粗的序列为靶标序列，其中，SEQIDNO:41中含有1个重复的SEQIDNO:1序列，SEQIDNO:42中含有1个重复的SEQIDNO:2序列、SEQIDNO:43中含有2个重复的SEQIDNO:2序列，在SEQIDNO:43中双下划线的TT序列间隔了2个重复的SEQIDNO:2序列。

本发明采用的重叠PCR扩增LDLR基因表达盒，所采用的PCR模板为带启动子的LDLR基因(genebank登录号为NM_000527.4)。

采用的重叠PCR的引物包括LDLR1-4，其中：

LDLR1(SEQIDNO:35)和LDLR2(SEQIDNO:36)为第一组引物，LDLR3(SEQIDNO:37)和LDLR4(SEQIDNO:38)为第二组引物，重叠PCR时，先分别采用第一组引物和第二组引物进行PCR，得到第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物，所得产物混合后，以LDLR1(SEQIDNO:35)和LDLR4(SEQIDNO:38)为第三组引物与混合后的产物再进行PCR，即得重叠PCR产物LDLR；

LDLR2(SEQIDNO:36)和LDLR4(SEQIDNO:38)引物中的斜体且加粗的序列为第一组DNA片段产物和第二组DNA片段产物的重叠部分序列。

实施例1

构建具有靶标序列的亲本质粒ATriplex15DsRed、Triplex15DsRed和ATriplex15DsRed、2TTTriplex21DsRed、Triplex21DsRed，包括以下步骤：

a.以质粒ZY781.CMV.DsRed.bpA为模板(ZY781.CMV.DsRed.bpA的制备方法为：在pMC.BESPX质粒的SpeI和EcoRI位点插入CMV启动子、EcoRI和SalI位点插入DsRed基因、PspOMI和ScaI位点插入SV40bpA，制得ZY781.CMV.DsRed.bpA质粒，其中，所述CMV启动子、DsRed基因和SV40bpA的基因登录号分别为BD015377.1、FJ226077.1和NC_001669.1)，分别采用如下5对引物进行PCR：第一对引物：ATriplex15-F(SEQIDNO:41)和ATriplex-R(SEQIDNO:44)；第二对引物：Triplex15-F(SEQIDNO:21)和Triplex15-R(SEQIDNO:22)；第三对引物：ATriplex21-F(SEQIDNO:42)和Triplex-R(SEQIDNO:44)；第四对引物：2TTTriplex21-F(SEQIDNO:43)和Triplex-R(SEQIDNO:44)；第五对引物：Triplex21-F(SEQIDNO:23)和Triplex21-R(SEQIDNO:24)；

对PCR产物分别进行胶回收，分别获得：

具有1个Triplex15靶标序列的kan片段；具有6个Triplex15靶标序列的kan片段，其中，6个Triplex15靶标序列的排布方式为：Kan基因上下游各有3个串联重复的Triplex15靶标序列；具有1个Triplex21靶标序列的kan片段；具有2个重复的Triplex21靶标序列的kan片段，其中，2个重复Triplex21靶标序列之间间隔了2个碱基TT；具有4个Triplex21靶标序列的kan片段，其中，4个Triplex21靶标序列的排布方式为：Kan基因上下游各有2个串联重复的Triplex21靶标序列。

b.XhoI酶切质粒ZY781.CMV.DsRed.bpA，得到kan片段和去除kan片段的大片段，胶回收去除kan片段的大片段，并用去磷酸化酶去磷酸化。

c.T4NDA连接酶分别连接ZY781.CMV.DsRed.bpA去kan片段和步骤(a)中PCR并胶回收获得各个具有靶标序列(三链DNA识别序列)的kan片段。

d.连接产物转化大肠杆菌基因工程菌E.coliZYCY10P3S2T，挑取转化子培养提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。

e.将克隆正确的质粒分别命名为ATriplex15DsRed、Triplex15DsRed、ATriplex15DsRed、2TTTriplex21DsRed、Triplex21DsRed，即得含有靶标序列的亲本质粒，ATriplex15DsRed的质粒图谱如图5所示，Triplex15DsRed的质粒图谱如图6所示，ATriplex21DsRed的质粒图谱如图7所示，2TTTriplex21DsRed的质粒图谱如图8所示，Triplex21DsRed的质粒图谱如图9所示。

实施例2

构建具有靶标序列的亲本质粒ZY781-triplex15、ZY781-triplex21，包括以下步骤：

以质粒ZY781.bpAp(MC.BESPX的PspOMI和ScaI位点插入SV40bpA片段得到质粒ZY781.bpAp，所述SV40bpA的基因登录号为NC_001669.1)为模板；以如下2对引物分别进行PCR：

第一对引物：Triplex15-F(SEQIDNO:21)和Triplex15-R(SEQIDNO:22)；

第二对引物：Triplex21-F(SEQIDNO:23)和Triplex21-R(SEQIDNO:24)；

分别胶回收PCR产物，分别获得具有6个Triplex15靶标序列的kan片段，其中，6个Triplex15靶标序列的排布方式为：Kan基因上下游各有3个串联重复的Triplex15靶标序列；具有4个Triplex21靶标序列的kan片段，其中，4个Triplex21靶标序列的排布方式为：Kan基因上下游各有2个串联重复的Triplex21靶标序列。

按照与实施例1相同的克隆方法构建具有靶标序列的亲本质粒ZY781-triplex15、ZY781-triplex21，所述ZY781-triplex15的质粒图谱如图10所示，ZY781-triplex21的质粒图谱如图11所示。

实施例3

构建具有靶标序列的亲本质粒Triplex21CMV.bpA、Triplex21RSV.bpA,Triplex21Ubc.bpA和Triplex21ApoE.bpA，包括以下步骤：

分别采用表1中所述引物对CMV-F(SEQIDNO:25)和CMV-R(SEQIDNO:26)、RSV-F(SEQIDNO:27)和RSV-R(SEQIDNO:28)、Ubc-F(SEQIDNO:29)和Ubc-R(SEQIDNO:30)、ApoE-F(SEQIDNO:31)和ApoE-R(SEQIDNO:32)进行PCR，分别扩增CMV、RSV、Ubc、ApoE启动子，所述PCR扩增的模板基因的genebank登录号分别为：CMV启动子(genebank登录号为BD015377.1)、RSV启动子(genebank登录号为M77786.1)、Ubc启动子(genebank登录号为NG_027722.2)、ApoE启动子(genebank登录号为D38257.1)；各PCR产物经常规克隆步骤，通过相应的酶切位点分别连接到ZY781-triplex21，酶切鉴定和测序鉴定后，将克隆正确的质粒分别命名为Triplex21CMV.bpA、Triplex21RSV.bpA、Triplex21Ubc.bpA、Triplex21ApoE.bpA，即得到具有靶标序列的亲本质粒Triplex21CMV.bpA、Triplex21RSV.bpA,Triplex21Ubc.bpA和Triplex21ApoE.bpA，质粒图谱分别如图12～图15所示。

实施例4

构建具有靶标序列的亲本质粒Triplex21Luc和Triplex21LDLR，包括以下步骤：

luciferase基因通过PCR扩增得到，其中，PCR的引物为Luc-F(SEQIDNO:33)和Luc-R(SEQIDNO:34)，PCR的模板luciferase基因的genebank登录号为U03687.1；LDLR表达盒通过引物LDLR1(SEQIDNO:35)、LDLR2(SEQIDNO:36)、LDLR3(SEQIDNO:37)和LDLR4(SEQIDNO:38)进行重叠PCR获得；

将得到的luciferase基因片段和LDLR表达盒分别通过EcoRI和SalI双酶切后，分别连接到实施例三所构建的亲本质粒Triplex21CMV.bpA的EcoRI和SalI位点，酶切鉴定和测序鉴定后，将克隆正确的质粒分别命名为Triplex21Luc和Triplex21LDLR，即得具有靶标序列的亲本质粒Triplex21Luc和Triplex21LDLR，质粒图谱分别如图16～图17所示。

本发明实施例1～4所制备的含靶标序列的亲本质粒所具有的相关特征如下表2所示：

表2.本发明实施例构建的含靶标序列的亲本质粒相关信息

实施例5

本实施例提供了一种在宿主细胞中制备微环DNA的方法，包括以下步骤：

a.取各亲本质粒转化大肠杆菌基因工程菌E.coliZYCY10P3S2T，得到含有亲本质粒的重组菌，各含亲本质粒的重组菌如下表3所示：

表3.宿主菌和含有亲本质粒的宿主菌

b.将大肠杆菌基因工程菌E.coliZYCY10P3S2T(Triplex21DsRed)、ZYCY10P3S2T(Triplex21Luc)、ZYCY10P3S2T(Triplex21LDLR)接种装有5mLTB培养基(Kanamycin终浓度50μg/ml)的12mL细菌培养管，37℃、250rpm培养8h。

c.1％的接种量接种装有400mLTB培养基(Kanamycin终浓度50μg/ml)的2L锥形瓶，37℃、250rpm培养12-16h。

d.配制诱导液：LB培养基400mL；1mol/L的NaOH16mL；过滤除菌的20％的阿拉伯糖400μL。

e.诱导液加入到b步骤中的2L锥形瓶中诱导5-8h。

f.离心收集菌体，用QIAGENPlasmidMegaKit(25)质粒大量提取试剂盒提取质粒，得到微环DNA。

g.酶切鉴定制备的微环DNA。

图1为本发明实施例含靶标序列的亲本质粒在宿主菌种重组并获得微环DNA过程的示意图。

验证实施例1

为验证本发明提供的靶标序列在纯化微环DNA时的有效性，本发明提供了验证实施例1，该验证实施例采用实施例5提供的方法，采用亲本质粒ATriplex15DsRed、Triplex15DsRed和ATriplex21DsRed、2TTTriplex21DsRed、Triplex21DsRed分别制备了微环DNA，并分别命名为MC.ATriplex15DsRed、MC.Triplex15DsRed和MC.ATriplex15DsRed、MC.2TTTriplex21DsRed、MC.Triplex21DsRed。

说明：

triplex-15序列，即SEQIDNO:1序列，具体为：AGAAGAAAGGAGAAA；

triplex-21序列，即SEQIDNO:2序列，具体为：GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA。

单一的triplex-15:三链DNA形成几率为1。

6个triplex-15(上下游各3个串联重复):三链DNA形成几率为6，

其中，上游或下游3个串联重复的triplex-15具体为：

AGAAGAAAGGAGAAAAGAAGAAAGGAGAAAAGAAGAAAGGAGAAA。

单一的triplex-21:三链DNA形成几率为1。

间隔有2个碱基(TT)的2个triplex-21:三链DNA形成几率为2，

其中，含有2个间隔碱基(TT)的triplex-21具体为：

GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA。

4个(上下游各2个串联重复)triplex-21:三链DNA形成几率为16。

其中，上游或下游2个串联重复的triplex-21具体为：

GAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA，记为(GAA)₁₄ 。注：由于(GAA)₁₄与Bio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(记为(CTT)₇)的三链DNA形成几率为8,上游或下游2个串联重复的triplex-212*(GAA)₁₄与Bio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(CTT)₇三链DNA形成几率为16。

所述的“说明”从理论上阐述了：靶标序列重复方式、重复次数、以及具体碱基序列与三链DNA的形成几率有关；在靶标序列相同的情况下，靶标序列与第三条单链DNA形成三链DNA的几率越高，微环DNA纯化的效率会越高，因此，本领域技术人员可以根据具体需要为靶标序列设计合适的重复方式、重复次数、以及具体碱基序列；

为进一步说明本发明的有益效果，本发明提供的验证步骤及其结果如下：

1.程序：

a.配置如下混合质粒：MC.ATriplex15DsRed、MC.Triplex15DsRed、MC.ATriplex21DsRed、MC.2TTTriplex21DsRed、MC.Triplex21DsRed中分别加入2.5％的PP.ATriplex15DsRed、PPTriplex15DsRed和PP.ATriplex21DsRed、PP.2TTTriplex21DsRed、PPTriplex21DsRed，得到5组混合质粒(混合方式为各自亲本质粒与对应的微环DNA混合)，并将每组质粒总浓度调整到1μg/μL，在分别、平行进行后续操作。

所得5组混合质粒的混合方式如下表4所示：

表4.各组合混合质粒中亲本质粒及其浓度

b.用结合缓冲液(0.2mol/LCH3COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)平衡磁珠(M-270Streptavidin，Lifetechnologies),并加入5‘端生物素标记的单链DNA

(Bio-TCTTCTTTCCTCTTT(SEQIDNO:17)或

Bio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQIDNO:18))。

c.将步骤(a)制备的混合质粒分别溶于结合缓冲液(0.2mol/LCH3COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)中，并分别加入到(b)步骤中的混合液中；30℃温和搅拌反应2h形成三螺旋结构复合物，所述三螺旋结构复合物为三链DNA结构，且所述三链DNA结构通过5‘端生物素与磁珠结合。

d.在磁力(磁力架，Lifetechnologies，货号12321D)的作用下让磁珠(结合三链DNA)沉淀，吸取上清液做乙醇沉淀即可得到纯化的微环DNA，纯化的微环DNA的浓度调整到1μg/μL。

e.加入冰冷的分离缓冲液(0.5mmol/LEDTA；pH9.0)，使三链DNA解离，并使得5‘端生物素与磁珠分离，在磁力的作用下让磁珠沉淀，去除上清液后用PBS(pH7.2)回收、保存磁珠。

f.采用琼脂糖凝胶电泳和绝对定量PCR检测三链DNA纯化微环DNA效率，其中，绝对定量PCR的引物如SEQIDNO:39和SEQIDNO:40所示。

图2为本发明实施例提供的三螺旋亲和法纯化微环DNA的流程示意图；图2中的三螺旋结构在本验证实施例1中表示三链DNA结构。

2.结果：

含亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳结果如图18所示，所有质粒均经过EcoRI内切酶消化，图中的M泳道为DNAMarker(1KBplusDNAladder,Lifetechnologies,货号：10787026)的泳道，泳道1～10分别为组合1纯化后、组合1纯化前、组合2纯化后、组合2纯化前、组合3纯化后、组合3纯化前、组合4纯化后、组合4纯化前、组合5纯化后、组合5纯化前的泳道。

由图18所示的电泳鉴定结果表明，泳道1、3、5、7和9只有在1650～2000bp处有一条条带(微环DNA所处的条带)，相对于泳道2、4、6、8和10，缺少了亲本质粒所在的条带(处于5000～6000bp处)，即本发明提供的三螺旋纯化技术可以显著降低微环DNA中存在的2.5％的亲本质粒。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了绝对定量PCR(qPCR)检测三链DNA纯化微环DNA效率的结果，如下表5所示：

	A Triplex15	Triplex15	A Triplex21	2TT Triplex21	Triplex21
						Be.C_T	22.52	22.48	22.45	22.48	22.51
Be.PP(ng/μL)	24.29	25.01	25.57	25.01	24.47
						Be.PP content(％)	2.43	2.50	2.56	2.50	2.45
Af.C_T	24.36	26.24	24.92	25.53	26.87
						Af.PP(ng/μL)	6.26	1.57	4.15	2.65	0.99
Af.PP content(％)	0.63	0.16	0.41	0.26	0.10

表5.qPCR检测三链DNA纯化微环DNA的效率

在表5中，“Be.C_T”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中微环DNA(PP)的qPCT的C_T值；

“Be.PP(ng/uL)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的浓度(浓度单位为ng/uL)；

“Be.PPcontent(％)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的百分比浓度(content)；

“Af.C_T”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之后(Af.)，混合质粒中微环DNA(PP)的qPCT的C_T值；

“Af.PP(ng/uL)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之后(Af.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的浓度(浓度单位为ng/uL)；

“Af.PPcontent(％)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之后(Af.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的百分比浓度(content)；

比较表5微环DNA的纯度，相对于各纯化之前的混合质粒组合，采用本发明提供的三链DNA纯化后，将组合1～5中PP的含量从25ng/μL分别降低到6.26ng/μL，1.57ng/μL，4.15ng/μL，2.65ng/μL，0.99ng/μL。纯化效率分别为74％，94％，84％，89％，96％。

图18和表5的结果表明：相对于中间间断有其它非靶序列(如TT)的串联的靶标序列，靶标序列的连续串联可以更显著地提高三链DNA的纯化效率；三碱基重复(比如GAA作为重复单元)的靶标序列相对于碱基随机排布的靶标序列，前者与第三条单链DNA形成三链DNA的几率更高；靶标序列与第三条单链DNA形成三链DNA的几率越高，微环DNA纯化的效率会越高。

验证实施例2

为验证本发明提供的微环DNA纯化方法的有效性，本发明提供了验证实施例，该验证实施例采用实施例6提供的方法，采用亲本质粒Triplex15DsRed和Triplex21DsRed分别制备了微环DNA，并分别命名为MC.Triplex15DsRed和MC.Triplex21DsRed，然后配置混合有不同浓度亲本质粒的微环DNA，并采用本发明提供的DNA三链纯化技术对微环DNA进行纯化方法，包括以下步骤：

1.程序：

a.配置如下混合质粒：MC.Triplex15DsRed和MC.Triplex21DsRed中分别含有1％、2％、5％、10％PPTriplex15DsRed和PPTriplex21DsRed，并将质粒总浓度调整到1μg/μL。

b.用结合缓冲液(0.2mol/LCH3COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)平衡磁珠(M-270Streptavidin，Lifetechnologies),并加入5‘端生物素标记的单链DNA(Bio-TCTTCTTTCCTCTTT(SEQIDNO:3)或Bio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQIDNO:4))。

c.将步骤(a)制备的混合质粒溶于结合缓冲液(0.2mol/LCH3COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)中，并加入到(b)步骤中的混合液中；30℃温和搅拌反应2h形成三螺旋结构复合物，所述三螺旋结构复合物为三链DNA结构，且所述三链DNA结构通过5‘端生物素与磁珠结合。

f.采用琼脂糖凝胶电泳和绝对定量PCR检测三链DNA纯化微环DNA效率，其中，绝对定量PCR的引物如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示。

图2为本发明实施例提供的三螺旋亲和法纯化微环DNA的流程示意图；图2中的三螺旋在本验证实施例中表示三链DNA。

2.结果：

琼脂糖凝胶电泳如图19所示。图19为本发明验证实施例提供的含有亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图，所有质粒均经过EcoRI内切酶消化，其中，图A～图D分别为含1％、2％、5％和10％亲本质粒的微环DNA经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图。

在图A～图D中，每个图中的M泳道为DNAMarker(1KBplusDNAladder,Lifetechnologies,货号：10787026)的泳道，泳道1～4分别为MC.Triplex15DsRed纯化前、MC.Triplex15DsRed纯化后、MC.Triplex21DsRed纯化前和MC.Triplex21DsRed纯化后的泳道。

图19中，图A～图D各泳道的信息如下表4-1所示：

表4-1.各泳道对应的混合质粒中亲本质粒的浓度

由图19所示的电泳鉴定结果表明，各图A～D中，泳道3和4只有在1650～2000bp处有一条条带(微环DNA所处的条带)，相对于泳道1和2，缺少了亲本质粒所在的条带(处于5000～6000bp处)，即本发明提供的三螺旋纯化技术可以显著降低微环DNA中存在的1％、2％、5％、10％的亲本质粒。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了绝对定量PCR(qPCR)检测三链DNA纯化微环DNA效率的结果，如下表5-1和5-2所示：

Be.PP content(％)	1	2	5	10
					Be.C_T	23.65	22.67	21.48	20.56
Be.PP(ng/μL)	10.57	21.75	52.25	102.89
					Af.C_T	27.82	26.56	24.86	23.45
Af.PP(ng/μL)	0.50	1.20	4.30	12.20
					Af.PP content(％)	0.050	0.120	0.430	1.220

表5-1.qPCR检测三链DNA纯化MC.Triplex15DsRed效率

Be.PP content(％)	1	2	5	10
					Be.C_T	23.52	22.68	21.51	20.54
Be.PP(ng/μL)	11.63	21.59	51.11	104.42
					Af.C_T	28.44	27.36	25.24	24.05
Af.PP(ng/μL)	0.30	0.70	3.30	7.90
					Af.PP content(％)	0.030	0.070	0.330	0.790

表5-2.qPCR检测三链DNA纯化MC.Triplex21DsRed效率

在表5-1和5-2中，“Be.PPcontent(％)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的百分比浓度(content)；

“Be.C_T”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中微环DNA(PP)的qPCT的C_T值；

比较表5-1和表5-2微环DNA的纯度，相对于纯化之前的混合质粒，采用本发明提供的三链DNA纯化后，将PP的含量从1％降到0.05％，从2％降到0.12％，从5％降到0.43％，从10％降到1.22％；triplex21特异序列三链DNA纯化技术将PP的含量从1％降到0.03％，从2％降到0.07％，从5％降到0.33％，从10％降到0.79％。

3.结论：

本验证实施例说明采用本发明提供的含有triplex15靶标序列(SEQIDNO:1)的亲本质粒制备微环DNA，并采用本发明提供的三链DNA纯化方法，可以达到进一步纯化微环DNA的效果，并大大降低混合质粒中亲本质粒的浓度。此外，相对于采用6个重复的triplex15靶标序列的三链DNA纯化方法，采用4个重复的triplex21靶标序列(SEQIDNO:2)的三链DNA纯化方法显示了更高的纯化效率，可应用于生产更高质量的微环DNA。

值得注意的是，本领域技术人员可根据需要采用6个重复的triplex15靶标序列的三链DNA纯化方法，可以通过重复一次三链DNA纯化步骤提高微环DNA的纯化效率。

实施例7

本实施例提供了一种高纯度的微环DNA的制备方法，包括如下步骤：

1、程序：

a.用结合缓冲液(0.2mol/LCH₃COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)平衡磁珠,并加入5‘端生物素标记单链DNABio-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQIDNO:4)。

b.将实施例6制备的微环DNA溶于结合缓冲液(0.2mol/LCH₃COOH；2mol/LNaCl；pH4.5)中，并加入到(a)步骤中的混合液中；30℃温和搅拌反应2h形成三链DNA、5‘端生物素与磁珠结合。

c.在磁力的作用下让磁珠(结合三链DNA)沉淀，吸取上清液做乙醇沉淀即可得到纯化的微环DNA，纯化的微环DNA的浓度调整到1μg/μL。

d.加入冰冷的分离缓冲液(0.5mmol/LEDTA；pH9.0)，使三链DNA解离、5‘端生物素与磁珠分离，在磁力的作用下让磁珠沉淀，去除上清液后用PBS(pH7.2)保存磁珠。

e.琼脂糖凝胶电泳和绝对定量PCR检测三链DNA纯化微环DNA效率，其中，绝对定量PCR的引物如SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示。

2.结果：

琼脂糖凝胶电泳如图20所示。图20为本发明实施例7提供的含有亲本质粒和/或骨架质粒的微环DNA(实施例6制备)经过三螺旋亲和法纯化前后的琼脂糖凝胶电泳图，所有质粒均经过EcoRI内切酶消化。

在图20中，M泳道为DNAMarker(1KBplusDNAladder,Lifetechnologies,货号：10787026)的泳道，泳道1～3分别为PP.Triplex21DsRed、MC.Triplex21DsRed纯化前和MC.Triplex21DsRed纯化后的泳道；

泳道4～6分别为PP.Triplex21Luc、MC.Triplex21Luc纯化前、MC.Triplex21Luc纯化后的泳道；

泳道7～9分别为PP.Triplex21LDLR、MC.Triplex21LDLR纯化前和MC.Triplex21LDLR纯化后的泳道。

如本文所用的，所述“PP.”表示亲本质粒，所述“MC.”表示微环DNA。

由图16所示的电泳鉴定结果表明，在泳道1、4、7中，只有各亲本质粒PR.Triplex21DsRed、PR.Triplex21Luc和PR.Triplex21LDLR的条带，所述各亲本质粒由实施例4～5制备；

泳道2、5、8为实施例6所制备的微环DNA(分别为MC.Triplex21DsRed、MC.Triplex21Luc和MC.Triplex21LDLR)，即采用现有的、行业内常用的质粒纯化试剂盒纯化处理的微环DNA，可以发现，泳道2、5、8中各除了微环DNA的条带，还存在亮度较弱的、各自亲本质粒的条带，说明采用现有技术提取微环DNA还含有少量亲本质粒(含量和浓度请参见表6的数据)。

泳道3、6、9中只有一条微环DNA所处的条带，即采用本发明提供的三螺旋纯化方法可有效去除微环DNA中存在的亲本质粒。

图20的结果显示，采用本发明提供的两步法(质粒预除杂和三螺旋纯化法)可以有效去除微环DNA中存在的亲本质粒；此外，图16还显示，采用常规的质粒提纯试剂盒不能有效去除微环DNA中存在的亲本质粒(如泳道2、5、8所示)，即虽然常规的质粒提纯方法获得了较纯的微环DNA，但仍然含有1-2％的骨架质粒和/或亲本质粒。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了绝对定量PCR(qPCR)检测三链DNA纯化微环DNA效率的结果，如下表6所示：

	Triplex21DsRed	Triplex21Luc	Triplex21LDLR
				Be.C_T	22.82	23.21	22.95
Be.PP(ng/μL)	19.47	14.61	17.69
				Be.PP content(％)	1.95	1.46	1.77
Af.C_T	28.41	28.48	28.37
				Af.PP(ng/μL)	0.32	0.30	0.33
Af.PP content(％)	0.032	0.030	0.033

表6.qPCR检测三链DNA纯化微环效率

在表6中，“Be.PPcontent(％)”表示采用本发明提供的三链DNA纯化之前(Be.)，混合质粒中亲本质粒(PP)的百分比浓度(content)；

比较表6中各微环DNA的纯度，相对于纯化之前的混合质粒，采用本发明提供的三螺旋纯化法进行纯化后，亲本质粒Triplex21DsRed、Triplex21Luc、Triplex21LDLR的浓度分别从19.47ng/μL、14.61ng/μL、17.69ng/μL降到0.32ng/μL、0.30ng/μL、0.33ng/μL。

此外，采用本发明提供的三螺旋纯化法进行纯化后，微环DNA(1.73–4.90kb)产量为3.68–5.27mg/L，转化率为0.63mg/mg(2.12nmol/nmol),0.74mg/mg(1.86nmol/nmol),0.77mg/mg(1.41nmol/nmol)。相关数据见表7：

本发明所述的转化率是指亲本质粒经位点特异性重组、预纯化以及三螺旋纯化后所得的微环DNA的质量占亲本质粒的质量的比例。比如：0.63mg/mg为1mg的PP最终得到0.63mg的微环DNA。

3、结论:

采用本发明提供的两步法制备微环DNA，可以将亲本质粒的含量稳定降低至在0.03％左右。本发明提供的两步法包括：首先采用行业内常规的质粒提纯的方法进行预提纯，并制得大量微环DNA(但仍然含有1-2％的骨架质粒和/或亲本质粒)；然后采用三螺旋纯化法有效去除微环DNA中骨架质粒和/或亲本质粒。本发明提供的微环DNA纯化的方法通过联合微环DNA的大量制备技术和三链DNA纯化技术，制备了高质量的、符合临床应用、药用要求的微环DNA。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述微环DNA具有目的基因。

3.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游和/或下游。

4.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。

5.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述靶标序列中的任意一条DNA链包括如式I所示的核苷酸序列的至少一种：

I:5’-(W)_n-3’

6.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述第三条单链为单链DNA、单链RNA、单链PNA或单链DNG，所述第三条单链的5’端或3’端具有功能化修饰。

7.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，经典三联体的数目为t，所述t的取值范围为6≤t≤60，所述经典三联体为T*AT三联体和⁺C*GC三联体。

8.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第三条单链的序列选自SEQIDNO:10～SEQIDNO:18中的至少一种。

9.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。

10.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述宿主细胞具有经诱导后表达DNA内切酶的基因序列和经诱导后表达位点特异性重组酶的基因序列。

11.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述含有靶标序列的骨架DNA具有表达位点特异性重组酶的核苷酸序列。

12.如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述三螺旋纯化法制备高纯度的微环DNA的步骤包括：

13.如权利要求12所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述接头基团为生物素、巯基、二硫化物、琥珀酰化物、氨基或羧基；步骤(b)中，所述官能团为二硫化物、马来酰亚胺、氨基、羧基、酯、环氧基、溴化氰基或醛基；所述基质载体为色谱载体、塑料、玻璃、磁性胶乳珠或非磁性胶乳珠。

14.如权利要求12所述的高纯度的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述高纯度的微环DNA中，含有靶标序列的亲本质粒的含量低于3％。

15.一种高纯度的微环DNA，其特征在于，所述高纯度的微环DNA由如权利要求1所述的高纯度的微环DNA的制备方法所制备。

16.一种含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述含有靶标序列的亲本质粒具有特异性重组位点、骨架DNA的核苷酸序列和微环DNA的核苷酸序列；所述含有靶标序列的亲本质粒通过所述特异性重组位点的位点特异性重组产生微环DNA和含有靶标序列的骨架DNA；所述靶标序列为双链DNA，所述靶标序列含有与第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列，所述微环DNA不含有与所述第三条单链相互作用形成三螺旋结构的核苷酸序列。

17.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述微环DNA具有目的基因。

18.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述含有靶标序列的骨架DNA含有启动子，所述含有靶标序列的骨架DNA具有至少一个靶标序列，所述靶标序列位于所述启动子的上游和/或下游。

19.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述靶标序列中的任意一条DNA链包括如式I所示的核苷酸序列的至少一种：

I:5’-(W)_n-3’

20.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述第三条单链为单链DNA、单链RNA、单链PNA或单链DNG，所述第三条单链的5’端或3’端具有功能化修饰。

21.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述第三条单链与所述靶标序列形成的三螺旋结构中，经典三联体的数目为t，所述t的取值范围为6≤t≤60，所述经典三联体为T*AT三联体和⁺C*GC三联体。

22.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述第三条单链的序列选自SEQIDNO:10～SEQIDNO:18中的至少一种。

23.如权利要求16所述的含有靶标序列的亲本质粒，其特征在于，所述特异性重组位点为phiC31特异性重组位点、parA特异性重组位点或Cre特异性重组位点。

24.一种高纯度的微环DNA或高纯度的微环DNA的制备方法在制备质粒纯化试剂盒中的应用。

25.一种高纯度的微环DNA或高纯度的微环DNA的制备方法在制备疾病预防、疾病诊断或基因治疗的药物中的应用。

26.一种采用微环DNA进行基因治疗的方法，包括如下步骤：

S01)制备高纯度的微环DNA；

S02)将所述高纯度的微环DNA按下述任一步骤操作：

a)将所述高纯度的微环DNA单独用于基因治疗；