CN105316236A - 赫氏颗石藻的培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分：海水+不含Si的f/2培养基+11μM？NaFeEDTA+5mM？Serine+3mM？NaHCO₃+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。本发明还公开了一种培养赫氏颗石藻的方法，本发明具有成本低、收益大、无污染、操作简单，易于规模化培养的优点，将对赫氏颗石藻和神经酰胺产业的跨越式发展起到重要的推动作用，应用前景广阔。本发明还公开了一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法，用上述培养方法获得的神经酰胺可以制成抗肿瘤、抗衰老等药物，还可作为高档护肤品美容保湿的添加剂。

Description

赫氏颗石藻的培养方法及应用

技术领域

本发明属于海洋植物培育技术领域，具体涉及一种培养赫氏颗石藻的方法，本发明还涉及一种培养赫氏颗石藻的培养基，本发明还涉及一种赫氏颗石藻特异病毒的制备方法。

背景技术

赫氏颗石藻Emilianiahuxleyi是一种广泛分布于全球近海和大洋的的单细胞真核微型浮游植物，隶属于定鞭藻门(Prymnesiophyta)，定鞭藻纲(Prymnesiophyceae)。赫氏颗石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质，在医药、食品和日用化工等研究领域具有广阔的应用前景，如能有效合成和积累具有防止心血管疾病等药理功能的Ω-3长链多元不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)(SayanovaO,HaslamRP,CalerónMV,etal.Identificationandfunctionalcharacterisationofgenesencodingtheomega-3polyunsaturatedfattyacidbiosyntheticpathwayfromthecoccolithophoreEmilianiahuxleyi.Phytochemistry,2011,72(7):594-600)；能够合成大量的具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性物质，如聚酮类化合物(ReadBA,KegelJ,KluteMJ,etal.PangenomeofthephytoplanktonEmilianiaunderpinsitsglobaldistribution.Nature,2013.499(7457):209-13)；特别是该藻能够合成一种新型的神经酰胺类物质，其具有自然界罕见的特殊结构，该结构的神经酰胺具有较高的生物学活性(MichaelsonLV,DunnTM,NapierJA.Viraltrans-dominantmanipulationofalgalsphingolipids.PlantSci,2010,15(12):651-655.)。

神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质，对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。目前，商品化的天然神经酰胺价格高达6000美元/kg，美国每年神经酰胺类产品的产值在100亿美元以上。作为一种新型的生物活性物质，神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质，在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。目前国内外天然神经酰胺产品均为植物源神经酰胺，主要从大米、小麦、玉米、米糠和魔芋等原料中提取，但含量甚微，一般占生物量干重的0.01％-0.2％。因此，天然神经酰胺产量较低是制约神经酰胺功能性产品开发的瓶颈，使其商业化应用存在经济性的挑战。目前已陆续从海洋生物如，海绵和珊瑚中提取到了新型的神经酰胺，而且发现源于这些海洋生物的神经酰胺具有特殊的结构，其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。与海绵及软体动物珊瑚等相比，海洋微藻生长快、周期短、易培养且细胞中总脂含量相对较高。因而，在生物活性物质开发利用中无疑具有更强的优势。

目前，几乎所有商业化的微藻培养体系都是在开放式池中，但是，并不是所有的物种都能在开放式池中培养，如球石藻(coccolithophorid)中的Pleurochrysiscarterae能在户外跑道式池中生长至少10个月，而赫氏颗石藻(E.huxleyi)和钙板金藻(Gephyrocapsaoceanica)却不能利用这种方式培养(MoheimaniandBorowitzka,2006)。研究发现，板式光生物赫氏颗石藻中颗石藻(P.carterae)、赫氏颗石藻(E.huxleyi)和钙板金藻(G.oceanica)最理想的封闭培养体系，采用半连续方式培养，颗石藻(P.carterae)能达到的最大细胞密度为4.1×10⁵cells.mL^-1、E.huxleyi能达到5.9×10⁵cells.mL^-1、G.oceanica能达到2.4×10⁵cells.mL^-1。这三种都能在玻璃光生物反应器中生长(NavidR.Moheimani,AndreasIsdepsky,JanLisec,etal.Coccolithophoridalgaecultureinclosedphotobioreactors.BiotechnologyandBioengineering,2011,108(9):2078-2087)，而这些培养均在自养条件下利用不含Si的f/2培养基。目前赫氏颗石藻采用常规培养基培养所能达到的生物量仍处于较低水平。因此，迫切需要寻找既能提高赫氏颗石藻生物量又能提高细胞内神经酰胺积累的培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，采用可提高赫氏颗石藻生物量，又可促进细胞内神经酰胺积累的培养基组合物，该培养基可使赫氏颗石藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与自养培养相比有较大幅度提高。

本发明的另一目的是提供一种赫氏颗石藻的培养方法，采用可提高赫氏颗石藻生物量，又可促进细胞内神经酰胺积累的培养基组合物，该培养基可使赫氏颗石藻达到高密度培养的前提下，藻体品质与自养培养相比有较大幅度提高。

本发明的另一目的是提供一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法。

本发明所采用的第一技术方案是，一种用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分：不含Si的f/2培养基+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

进一步地，不含Si的f/2培养基海水的盐度为18‰。

进一步地，病毒裂解液的制备方法：将分离自挪威西南海岸的赫氏颗石藻特异性病毒EhV99B1感染处于对数后期的赫氏颗石藻E.huxleyiBOF92(分离自挪威西南海岸)，待藻培养液被病毒裂解变得清澈透亮(即藻细胞已被裂解完全)，裂解液用孔径为0.45μm的混合纤维素酯滤膜过滤，过滤液用MasterflexI/PEasy-Load蠕动泵以5mL/min的流速泵进，经Milliporepellicon卷式膜包(其截留分子量为30kDa)切向流超滤浓缩后(此过程中控制回流速度为0.5mL/min)，获得病毒裂解浓缩液和病毒裂解收集液(其中病毒裂解收集液中不含病毒颗粒)。

本发明所采用的第二技术方案是，一种赫氏颗石藻的培养方法，包括以下步骤：

1)、制备用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物；

2)、将赫氏颗石藻按4.5×10⁵cells/mL的密度接种于用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物上；

3)、培养体积为50mL，在18～20℃，光照强度为15～25μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12L:12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶1～2次；以接种的时间算起，隔天取样一次，并在显微镜下用血球计数板计数，用公式μ＝Ln(N_t-N₀)/t，其中，N_t为经过t时间培养后单位体积的藻细胞数；N₀为t时间培养初始单位体积藻细胞数；t为培养的时间；μ为赫氏颗石藻的每天平均生长率，以检测添加培养组合物后赫氏颗石藻的生长。

进一步地，用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物为：不含Si的f/2培养基+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

进一步地，赫氏颗石藻病毒裂解液通过以下方法制备得到：将赫氏颗石藻特异性病毒感染处于对数后期的赫氏颗石藻，待藻培养液被病毒裂解变得清澈透亮，即藻细胞已被裂解完全时，将裂解液用孔径为0.45μm的混合纤维素酯滤膜过滤，将过滤液用蠕动泵以5mL/min的流速泵进，经卷式膜包切向流超滤浓缩后，获得病毒裂解浓缩液和病毒裂解收集液。

本发明所采用的第三技术方案是，一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法，包括以下步骤：

1)采用上述的培育方法培育得到赫氏颗石藻；

2)将制备得到的赫氏颗石藻进行去盐、真空冷冻干燥，制备得到赫氏颗石藻藻粉；

3)将赫氏颗石藻藻粉加入2mL的裂解液(氯仿：甲醇，1：2)，超声波破碎直至细胞完全裂解；

4)采用Bligh和Dyer法抽提赫氏颗石藻的总脂类；向每1mL样品中，依次加入3.75mL裂解液，1.25mL氯仿，1.25mL超纯水，充分混匀；4℃10000rpm离心5min充分分层，收集下相；加入2.25mL的洗涤液(水：氯仿：甲醇＝2.25:1.25:2.5，充分混匀，至分层，取上相)；将下相用氮吹仪吹干，所得沉淀即为海洋球石藻总脂类粗提物；

5)将提取获得的总脂类粗提物用于神经酰胺含量分析：色谱柱:ZORBZXEclipseXDB-18，4.6mm×250mm，5μm，流动相:甲醇，柱温:35℃，流速:0.8ml/min，蒸发光散射检测器漂移管的温度：50℃，氮气流速：2.5L/min，检测灵敏度：5；预先用50倍柱体积的流动相平衡色谱柱，将样品稀释至合适的浓度，用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；通过浙大智达N2000色谱工作站软件对数据进行处理；精确称取标准品50μg、100μg、200μg、400μg和800μg溶解于1mL、v/v＝5:1的氯仿/甲醇溶液中，将标准液用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；每个浓度标准液进样3次，对其进样的标准液浓度和出峰面积作双对数曲线绘制标准曲线；采用上述建立起来的蒸发光散射检测器-高效液相色谱法检验提取获得的总粗脂，根据标准曲线换算出每个细胞神经酰胺含量。

本发明的有益效果是：本赫氏颗石藻的培养方法在f/2培养基中添加培养基组合物NaFeEDTA、Serine和NaHCO₃以及病毒裂解收集液，不仅可以显著提高赫氏颗石藻的生长速率和生物量，还可以促进赫氏颗石藻细胞内神经酰胺的积累。实验证明，接种密度为4.5×10⁵cells/mL时，加入11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃以及1.7％的病毒裂解收集液这一培养组合物后，赫氏颗石藻的生长率、细胞密度以及总脂和神经酰胺积累量均得到显著提高，在接种后的第四天，细胞密度可达2.74×10⁷cells/L，其细胞密度是对照组(常规培养)的12.3倍，神经酰胺的含量达到干重的0.895％，是对照组的3.1倍，是目前魔芋神经酰胺所能达到的24.9倍。本发明具有成本低、收益大、无污染、操作简单，易于规模化培养的优点，将对赫氏颗石藻和神经酰胺产业的跨越式发展起到重要的推动作用，应用前景广阔。

用上述培养方法获得的神经酰胺可以制成抗肿瘤、抗衰老等药物，还可作为高档护肤品美容保湿的添加剂。

附图说明

图1为添加不同培养组合物对赫氏颗石藻生长的影响；

图2为添加不同培养组合物对赫氏颗石藻细胞内神经酰胺积累的影响；

图3为添加不同培养组合物对赫氏颗石藻神经酰胺产量的影响；

图4为不同培养体积培养赫氏颗石藻生物量的结果；

图5为不同培养体积培养赫氏颗石藻生物量的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述的NaFeEDTA、Serine和NaHCO₃均为国产分析纯。

所述的NaFeEDTA、Serine和NaHCO₃浓度是在单因素试验基础上，通过筛选显著因子，进行响应面设计得出的结果，其最佳浓度组合分别为11μM、5mM和3mM。

实施例1

一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分：不含Si的f/2培养基(包括盐度为18‰的海水)+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+1％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

实施例2

一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，包括以下组分：不含Si的f/2培养基(包括盐度为18‰的海水)+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

实施例3赫氏颗石藻的培养及不同营养条件对赫氏颗石藻生长的影响

将赫氏颗石藻按4.5×10⁵cells/mL的密度接种于已高温灭菌的f/2培养基中，设置以下四个组别进行实验：(1)仅添加已灭菌的11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃这一培养组合物；(2)仅添加1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液；(3)同时添加已灭菌的11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃和1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液；(4)以常规培养作为对照。培养体积为50mL，在20℃，光照强度为20μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12L:12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶1～2次。以接种的时间算起，隔天取样一次，并在显微镜下用血球计数板计数，用公式μ＝Ln(N_t-N₀)/t(N_t为经过t时间培养后单位体积的藻细胞数；N₀为t时间培养初始单位体积藻细胞数；t为培养的时间；μ为赫氏颗石藻的每天平均生长率)，以检测添加培养组合物后赫氏颗石藻的生长。加入培养组合物后赫氏颗石藻的细胞统计结果如图1所示，经计算，加入培养组合物时赫氏颗石藻的最大生长率可达1.13/天，最大细胞密度2.74×10⁷cells/L，对照组(即不加培养组合物)的最大生长率仅为0.36/天，最大细胞密度3.95×10⁶cells/L，表明用本发明的方法对赫氏颗石藻进行培养，可使赫氏颗石藻的培养效率得到大幅度提高。

实施例4赫氏颗石藻的培养及不同营养条件下对赫氏颗石藻细胞内总脂积累的影响

将赫氏颗石藻按4.5×10⁵cells/mL的密度接种于已高温灭菌的f/2培养基中，设置以下四个组别进行实验：(1)仅添加已灭菌的培养组合物11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃这一培养组合物；(2)仅添加1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液；(3)同时添加已灭菌的培养组合物+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃和1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液；(4)以常规培养作为对照。培养体积为2000mL，在20℃，光照强度为20μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12L:12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶2～3次。以检测添加培养组合物后赫氏颗石藻细胞内神经酰胺积累情况。从接种当天算起，隔两天取样一次，每次取样500mL，5000rpm离心10min，弃上清，藻体去盐后，真空冷冻干燥，称重，得出赫氏颗石藻的干重。将获得的藻粉加入2mL的裂解液(氯仿：甲醇，1：2)，超声波破碎直至细胞完全裂解。采用Bligh和Dyer法抽提赫氏颗石藻的总脂类；向每1mL样品中，依次加入3.75mL裂解液，1.25mL氯仿，1.25mL超纯水，充分混匀；4℃10000rpm离心5min充分分层，收集下相；加入2.25mL的洗涤液(水：氯仿：甲醇＝2.25:1.25:2.5，充分混匀，至分层，取上相)。将下相用氮吹仪吹干，所得沉淀即为海洋球石藻总脂类粗提物。将提取获得的总粗用于神经酰胺含量分析。色谱柱:ZORBZXEclipseXDB-18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相:甲醇,柱温:35℃，流速:0.8ml/min，蒸发光散射检测器漂移管的温度：50℃，氮气流速：2.5L/min，检测灵敏度：5。预先用50倍柱体积的流动相平衡色谱柱，将样品稀释至合适的浓度，用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样。通过浙大智达N2000色谱工作站软件对数据进行处理。精确称取标准品50μg、100μg、200μg、400μg和800μg溶解于1mL氯仿/甲醇(v/v＝5:1)溶液中，将标准液用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样。每个浓度标准液进样3次，对其进样的标准液浓度和出峰面积作双对数曲线绘制标准曲线。采用上述建立起来的蒸发光散射检测器-高效液相色谱法检验提取获得的总粗脂，根据标准曲线换算出每个细胞神经酰胺含量。添加不同培养组合物后赫氏颗石藻细胞内神经酰胺积累如图2所示，加入病毒裂解收集液后藻细胞内神经酰胺积累影响不大，而加入11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃组合物以及同时加入11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃和1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液后藻细胞内神经酰胺积累明显促进。在接种后的第四天，加入11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃和1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液这一组合物的藻细胞内神经酰胺达到67.3fg/cell，是对照组的3.72倍，且在整个培养周期，添加培养组合物的藻细胞中神经酰胺含量始终高于对照组，证明用本发明的方法对赫氏颗石藻进行培养，可使赫氏颗石藻神经酰胺积累量得到大幅度提高。

实施例5不同培养体积对赫氏颗石藻生长以及神经酰胺积累的影响

选取1L和5L锥形瓶以及20L敞口玻璃缸，将赫氏颗石藻按4.5×10⁵cells/mL的密度接种于已高温灭菌的f/2培养基中，同时添加已灭菌的培养组合物11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃和1.7％的赫氏颗石藻病毒裂解收集液，培养体积分别为500mL、2.5L和10L，在20℃，光照强度为20μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12L:12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶1～2次，培养四天后采收，按实施例2的方法获取各个培养体系的藻细胞生物量以及细胞内神经酰胺的积累量。结果如图3和图4所示，其中细胞内神经酰胺占干重的0.914％，是目前魔芋神经酰胺所能达到的25倍左右，而藻细胞生物量明显高于对照，在不同容器中培养的藻细胞干重大约是对照的20倍左右。证明用本发明的方法对赫氏颗石藻进行培养生产神经酰胺具有巨大的优势。

Claims (8)

1.一种培养赫氏颗石藻的培养基组合物，其特征在于，包括以下组分：不含Si的f/2培养基+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

2.根据权利要求1所述的培养赫氏颗石藻的培养基组合物，其特征在于，所述不含Si的f/2培养基，所述海水的盐度为18‰。

3.根据权利要求1所述的培养赫氏颗石藻的培养基组合物，其特征在于，所述病毒裂解液通过以下方法制备得到：将赫氏颗石藻特异性病毒感染处于对数后期的赫氏颗石藻，待藻培养液被病毒裂解变得清澈透亮，即藻细胞已被裂解完全时，将裂解液用孔径为0.45μm的混合纤维素酯滤膜过滤，将过滤液用蠕动泵以5mL/min的流速泵进，经卷式膜包切向流超滤浓缩后，获得病毒裂解浓缩液和病毒裂解收集液。

4.根据权利要求3所述的培养赫氏颗石藻的培养基组合物，其特征在于，所述卷式膜包的截留分子量为30kDa；所述超滤中的回流速度为0.5mL/min。

5.一种赫氏颗石藻的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、制备用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物；

2)、将赫氏颗石藻按4.5×10⁵cells/mL的密度接种于用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物上；

3)、培养体积为50mL，在18～20℃，光照强度为15～25μmol·m^-2·s^-1，光照时间为12L:12D的条件下静止培养赫氏颗石藻，每天搅拌或者摇瓶1～2次；以接种的时间算起，隔天取样一次，并在显微镜下用血球计数板计数，用公式μ＝Ln(N_t-N₀)/t，其中，N_t为经过t时间培养后单位体积的藻细胞数；N₀为t时间培养初始单位体积藻细胞数；t为培养的时间；μ为赫氏颗石藻的每天平均生长率，以检测添加培养组合物后赫氏颗石藻的生长。

6.根据权利要求5所述的赫氏颗石藻的培养方法，其特征在于，所述用于培养赫氏颗石藻的培养基组合物为：不含Si的f/2培养基+11μMNaFeEDTA+5mMSerine+3mMNaHCO₃+1％-2.5％的赫氏颗石藻病毒裂解液。

7.根据权利要求5所述的赫氏颗石藻的培养方法，其特征在于，所述赫氏颗石藻病毒裂解液通过以下方法制备得到：将赫氏颗石藻特异性病毒感染处于对数后期的赫氏颗石藻，待藻培养液被病毒裂解变得清澈透亮，即藻细胞已被裂解完全时，将裂解液用孔径为0.45μm的混合纤维素酯滤膜过滤，将过滤液用蠕动泵以5mL/min的流速泵进，经卷式膜包切向流超滤浓缩后，获得病毒裂解浓缩液和病毒裂解收集液。

8.一种赫氏颗石藻神经酰胺的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用权利要求5所述的培育方法培育得到赫氏颗石藻；

2)将制备得到的赫氏颗石藻进行去盐、真空冷冻干燥，制备得到赫氏颗石藻藻粉；

3)将赫氏颗石藻藻粉加入2mL的裂解液(氯仿：甲醇，1：2)，超声波破碎直至细胞完全裂解；

4)采用Bligh和Dyer法抽提赫氏颗石藻的总脂类；向每1mL样品中，依次加入3.75mL裂解液，1.25mL氯仿，1.25mL超纯水，充分混匀；4℃10000rpm离心5min充分分层，收集下相；加入2.25mL的洗涤液(水：氯仿：甲醇＝2.25:1.25:2.5，充分混匀，至分层，取上相)；将下相用氮吹仪吹干，所得沉淀即为海洋球石藻总脂类粗提物；

5)将提取获得的总脂类粗提物用于神经酰胺含量分析：色谱柱:ZORBZXEclipseXDB-18，4.6mm×250mm，5μm，流动相:甲醇，柱温:35℃，流速:0.8ml/min，蒸发光散射检测器漂移管的温度：50℃，氮气流速：2.5L/min，检测灵敏度：5；预先用50倍柱体积的流动相平衡色谱柱，将样品稀释至合适的浓度，用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；通过浙大智达N2000色谱工作站软件对数据进行处理；精确称取标准品50μg、100μg、200μg、400μg和800μg溶解于1mL、v/v＝5:1的氯仿/甲醇溶液中，将标准液用0.2μm微孔滤膜过滤于Waters自动进样瓶中，根据设置的色谱参数进样；每个浓度标准液进样3次，对其进样的标准液浓度和出峰面积作双对数曲线绘制标准曲线；采用上述建立起来的蒸发光散射检测器-高效液相色谱法检验提取获得的总粗脂，根据标准曲线换算出每个细胞神经酰胺含量。