CN105294850A - 一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法 - Google Patents

一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法 Download PDF

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Abstract

一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，属于生物技术领域。该方法为在pH？2-10条件下，将βLG和EGCG结合。本发明为降低牛乳蛋白βLG免疫反应提供了一种新的方法，其以更有效，更合理地利用牛奶蛋白，为低过敏性的乳制品发展的新思路路和理论支持。

Description

一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法。
背景技术
乳品加工，热处理的主要目的是通过灭菌延长产品的保质期。其主要参数工业：加热温度和加热时间。为了保持牛奶营养，热处理有不同的方法。因为牛奶复杂的组合物，不同的热处理牛奶的蛋白质，蛋白质的机制出性质的变化热处理的不同影响复杂。目前，如何改变牛奶的致敏机制热处理不是很清楚。
βLG具有热稳定性，热治疗期间的变化是非常复杂的，会加快蛋白质的结构在高温松动，并可能导致内部蛋白质的疏水基团暴露，巯可能发生硫醇基之间的二硫键和成彼此的聚合物内的分子和分子间的非共价键和共价键的相互作用
。这种聚合物在一定程度上可能消除并覆盖βLG蛋白质过敏的表位，因此，它减少了过敏性。同时，在牛奶系统中，加热也可以使收集βLG和αLA和CNS一起发生，也可以收集使蛋白质的表位被掩蔽，从而降低过敏βLG。
乳品加工巴氏杀菌是必要的链接导致改变加热βLG结构，而其生理功能它也可引起损坏：无行为能力的蛋白质结合的疏水性分子，如维生素A；牛奶感官品质也有不好的影响（如“烹调味道”）。因此，如果过度热处理可能会导致奶βLG的变性而蛋白质功能的丧失。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法的技术方案。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于在pH2-10条件下，将βLG和EGCG结合。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于βLG在温度120℃预热后，在pH2-10下将βLG和EGCG结合。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于用pH为2-10的PBS溶剂，将βLG稀释为1%，再与摩尔比为1：50的EGCG在25℃下水浴1h。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于用pH为2-10的PBS溶剂，将βLG稀释为1%，在120℃下油浴10min，再与摩尔比为1：50的EGCG在25℃下水浴1h。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于pH为4.5-6.4。
所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于βLG和EGCG结合后在4℃下用5kDa半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
本发明为降低牛乳蛋白βLG免疫反应提供了一种新的方法，其以更有效，更合理地利用牛奶蛋白，为低过敏性的乳制品发展的新思路路和理论支持。
附图说明
图1为抗牛乳βLG亲和纯化抗体效价测定；
图2为在pH环境为2时竞争法检测βLG与抗βLG多克隆抗体IgG结合的抑制率；
图3为在pH环境为4.5时竞争法检测βLG与抗βLG多克隆抗体IgG结合的抑制率；
图4为在pH环境为6.4时竞争法检测βLG与抗βLG多克隆抗体IgG结合的抑制率；
图5为在pH环境为10时竞争法检测βLG与抗βLG多克隆抗体IgG结合的抑制率；
图6为pH=2，25℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图7为pH=2，120℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图8为pH=4.5，25℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图9为pH=4.5，120℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图10为pH=6.4，25℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图11为pH=6.4，120℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图12为pH=10，25℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图13为pH=10，120℃βLG-EGCG圆二色光谱；
图14为βLG和βLG-EGCG的组合圆二色光谱；
图15为pH=2，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图16为pH=2，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图17为pH=4.5，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图18为pH=4.5，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图19为pH=6.4，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图20为pH=6.4，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图21为pH=10，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱；
图22为pH=10，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析图谱。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
1βLG多克隆抗体的制备与鉴定
1.1实验方法
1.1.1多克隆抗体制备：
将2只3个月、体重1.5公斤的纯种新西兰大白兔进行实验。连续三天确定正常身体状况后进行免疫。在几十微克到十微克每千克体重范围内设置免疫剂量，经皮肤和肌肉注射抗原。首次免疫时将抗原溶于弗氏不完全佐剂和生理盐水乳化后免疫。分别在第3、4、5、6次免疫后十天，通过兔子耳朵边缘静脉取血进行效价检测。血清抗体达到一定程度后由颈动脉取全血，离心取血清，抗血清的纯化参照DEAE-SepharoseEF阴离子交换层析柱说明书，于零下二十摄氏度保存。
1.1.2间接ELISA方法的建立
以天然牛乳βLG作为包被抗原，通过棋盘法（纵向包被抗原，按10，5.0，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078，0.039，0.020μgmL-1的浓度包被，横向抗血清按1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000倍数稀释）建立ELISA方法，以免疫前新西兰大白兔血清为阴性对照。用酶标仪测波长450nm出的吸光值OD，取阳性/阴性（P/N值）最大时的抗原、抗体稀释度作为抗原、抗体的最佳工作浓度。检测时以P/N>2.1（即多克隆抗体上清的吸光值大于阴性血清值大的2倍）判定检测结果为阳性，P/N值<2.1（即多克隆抗体上清的吸光值小于阴性血清的2倍）判定检测结果为阴性。
1.1.3抗体效价的检测
抗体效价用建立的间接ELISA方法测定，同时以NS-1细胞融合细胞腹水为阴性对照，多克隆抗体的效价为以P/N值>2.1最大稀释度。包被天然牛乳βLG100ng/孔，4℃包被过夜，洗板，加封闭液200μL，37℃封闭2小时，洗涤3次。分别以纯化后的抗βLG多抗为一抗，以免疫前新西兰大白兔血清作阴性对照，将多克隆抗体对倍稀释（从1：1000稀释到1：102400）加入100μL/孔，37℃培育1h，洗板，加入稀释的羊抗兔IgG-HRP为二抗100μL/孔，37℃培育45min，洗板；加TMB37℃避光显色10min；显色后加入浓度为12.5%硫酸50μL/孔终止反应，在波长450nm处测定吸光值（OD值）。抗体的稀释度即为抗体的效价。
2不同pH下βLG热处理后与EGCG相互结合对蛋白免疫反应性的影响
2.1实验方法
2.1.1βLG-EGCG常温产物的制备及βLG热处理后与EGCG结合
通常情况下，牛乳中的βLG是以非共价键连接成二聚体，并通过氢键使这种结构达到稳定。不同pH值下其存在形式不同，在pH为6～6.8时，其是以二聚体的形式存在，pH高于7.5，二聚体解离且构象发生变化形成膨胀的单体，当pH低于3.5时，二聚体解离成单体，pH为3.5～5.2时，二聚体四聚化成八聚体。
故为研究不同pH值影响下βLG-EGCG的免疫反应性，将四个不同构象下pH范围的中间值作为本研究的pH值，即pH值为2、4.5、6.4、10。
分别用pH为2、4.5、6.4、10的PBS为溶剂，将βLG稀释为1%，与摩尔比为1：50的EGCG在25℃水浴1h；以不加EGCG的βLG为空白对照；在4℃下用5kDa半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
分别用pH为2、4.5、6.4、10的PBS为溶剂，将βLG稀释为1%，在120℃油浴10min，与摩尔比为1：50的EGCG在25℃水浴1h；以不加EGCG的βLG为空白对照；在4℃下用5kDa半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
2.1.2免疫反应性检测
用竞争法ELISA检测不同pH下的βLG和βLG-EGCG与兔抗多克隆抗体（IgG）结合的免疫反应性。用碳酸盐缓冲抗原(蛋白质)稀释到1μg/mL。加入100μl抗原至ELISA板上的每个孔。在4oC下孵化过夜。通过快速去掉盘中的液体来去除未结合的抗原，将离子水加入孔中，,再次用离子水填充，洗去，重复两次，洗缓冲区。添加200μl阻断缓冲区。在室温下孵化(RT)2小时。去除阻塞缓冲液，用缓冲水洗板三次。分别添加100μl(1:1000,1:4000、1:160001:64000,稀释在阻止缓冲区)样本，控制(pre-immune血清1:1000)50μl至孔中，在RT孵化30-60分钟。洗板三次洗缓冲区。增加100μlHRP-labeled羊抗兔免疫球蛋白g(1:5000,稀释在阻止缓冲区)和孵化为30分钟37oC。用PBST洗缓冲区三次。将100μlTMB添加到每个孔，在黑暗中孵化60分钟。显色后加入浓度为12.5%的硫酸50μL每孔终止反应，在波长450nm处测定吸光值（OD），用ELISA仪器读数，计算抑制率。
抑制率=（OD未抑制—OD抑制）/（OD未抑制—ODbuffer）×100%
2.1.3圆二色光谱
参考文献的方法进行圆二色光谱的测定，分别将PBS调pH为2、4.5、6.4、10，将相应pH的样品稀释为蛋白浓度为1.5×10-6molL-1的溶液，在25℃下远紫外区（190-250nm）处测定其圆二色光谱。每个样品重复扫描三次，获得累计的色谱图。图谱经过仪器溶液空白差减和本底消除，数据通过在线服务器DICHROWEB分析，使用Selcon3算法计算蛋白质的α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲等二级结构的百分比含量。
3结果分析
3.1多克隆抗体的效价测定结果及分析
多克隆抗体的效价测定
通过间接ELISA法检测所获得的多克隆抗体的效价，结果见图1。
阴性血清：1：1000兔1&兔2<0.2，阴性值低于0.2，说明整个数据具有参考性。OD值大于1.0，同时效价值高于阴性值的三倍以上为合格。
抗体稀释兔1&兔2>1：64000，结果表明，二者多克隆抗体的效价在1：64000。
棋盘法结果
表1棋盘法测试结果
取吸光值为1左右的抗原和抗体浓度比例作为最佳反应浓度，即抗原包被浓度为0.313μgmL-1，抗血清稀释倍数为1：32000。
3.2免疫反应性检测结果分析
如图2-5所示，整体而言，当βLG与EGCG结合后，与IgG的结合活力均明显下降，其免疫反应性均降低，且经过120℃高温加热处理后的βLG再与EGCG反应结合后的产物比没有经过预热处理的βLG和EGCG的结合产物大大降低其免疫反应性。βLG和EGCG结合产物与IgG结合活力比纯蛋白低。
EGCG与预热处理的βLG相互结合的结合常数
根据βLG与EGCG的热力学分析，EGCG与βLG的结合主要疏水作用。高温作用下蛋白的结构趋于松散，所以使得内部的疏水集团外露，可能增强了蛋白与EGCG的疏水作用，从而使蛋白与EGCG的结合能力提高。
βLG经120℃高温处理后，蛋白聚集发生的同时发生了蛋白构想被破坏，蛋白与多克隆抗体的结合能力降低，EGCG结合到蛋白上，也一定程度上降低了蛋白与IgG的结合活力。从效果上分析，βLG经120℃高温处理后与EGCG结合，其蛋白免疫反应性大大降低。
βLG热稳定性强，有效降低免疫反应性需要长时间高温处理。但当牛奶经过长时间之间的热处理不仅会破坏牛奶的营养价值，导致牛奶“烹饪风味”，也对能源一种浪费。实验结果表明βLG热处理后与EGCG结合能显著减少βLG免疫反应性，其效果优于单一的热处理。特别是在120℃处理10分钟时，EGCG的结合使其免疫反应性大大降低。
蛋白质热变性过程中构象变化非常复杂，外部热破坏蛋白质三级结构各种力量，使蛋白质折叠、蛋白质的结构松散，但高温使二硫键介导化学反应形成蛋白质聚合物、蛋白质相互将聚集。牛奶是非常复杂的，高温，蛋白质构象变化，蛋白质聚合本身将与其他蛋白质聚集，也可能与碳水化合物如交联作用。到目前为止，加热牛奶蛋白过敏机制的变化仍是一个未解决的复杂问题。
所示，当溶液环境为正常pH时，即生物体内相近pH，即pH=6.4。βLG与EGCG结合后，免疫反应性降低，但是降低程度较小。βLG经120℃预热处理后其结合产物的免疫反应性大大降低。此时蛋白的存在形式是二聚体，常以非共价键结合。
由于过酸或者过碱的条件下，抗原和抗体的结合会受到相应的影响，所以本实验将相应βLG溶液pH调为对应的pH值，以减小对ELISA反应本身的影响。
当溶液环境pH为2时，常温结合产物与βLG与抗体结合能力相差不多，可能是强酸影响了抗原与抗体的结合，从而使得其两者结果相似。但是经120℃高温预处理后的βLG与EGCG结合产物的免疫反应性大大降低，可能是高温使蛋白构象发生了变化。此时蛋白的存在形式为单体，可能使更多结合位点暴露出来。因此其降敏效果较好。
由图3所示，当溶液环境pH为4.5时，蛋白质二聚体四聚化形成八聚体，常温结合产物比βLG与抗体结合能力好，说明EGCG与蛋白结合能有效降低其致敏性。经120℃高温预处理后的βLG与EGCG结合，其产物更能降低免疫反应性。较于生物体能正常近似pH（6.4）的免疫反应结果，其降敏效果不如前者。可能是因为八聚体的结构使得本可和EGCG结合的位点没有暴露出来或者由于非共价键的作用使其不能结合。所以导致其降敏效果要劣于二聚体的蛋白存在形式。
由图5所示，当环境溶液pH为10时，二聚体解离且构象发生变化形成膨胀的单体，相应pH下常温结合产物βLG能略微降低其免疫反应性。经120℃高温预处理后的βLG与EGCG结合，其产物更能降低免疫反应性。对于同样是以单体形式存在的pH为2的溶液中，较于对应pH环境中的βLG，pH为10时，降敏效果更好。可能是因为，单体发生膨胀后，露出的能与EGCG结合的表位更多，从而使更多地EGCG与蛋白结合。
八聚体状态下的βLG-EGCG比单体状态下（膨胀和非膨胀）得到了更高的抑制率，目前本实验无法解答。由于蛋白质构象变化十分复杂，还有待于进一步研究。
3.3圆二色光谱
在蛋白质的二级结构的肽键具有规则以高度有序排列，在不同的蛋白质的二级结构不同的强度和圆二色性产生吸收位置；在一般情况下，在圆二色光谱，α-螺旋结构192有在波长为接近阳性条带，有两个负峰带在222纳米和208纳米的波长的附近，这在附近的绝对值222毫微米θ值的波长更大的蛋白质具有更α-螺旋结构；β-片状结构在185的波长为具有正带200nm附近，在216纳米和邻近负频带的波长；β-转结构波有近206纳米长了积极的波段。因此，通过测量蛋白的圆二色光谱可以推断蛋白的信息的二级结构。
样品的圆二色光谱显示邻近222纳米和208纳米的有明两个显著负峰，这是典型的α-螺旋结构；185～200纳米波长接近正谱带，这是β-折叠结构的典型特征。βLG-EGCG在波长222nm附近的θ值比天然的βLG要大，说明βLG-EGCG，蛋白中的α螺旋结构可能有所增加。总体而言，与天然βLG圆二色光谱我们提交的线谱数据服务器DICHROWEB，由Selcon3算法在样品上的二级结构被计算。如下表所示圆二色性的数据。结果表明：在结合蛋白的蛋白质二级结构会略有增加α-螺旋结构和β-折叠结构稍有不规则卷曲略微减少。如图6-14为βLG-EGCG圆二色光谱图。
表2：pH=2，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表3：pH=2，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表4：pH=4.5，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表5：pH=4.5，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表6：pH=6.4，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表7：pH=6.4，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表8：pH=10，25℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
表9：pH=10，120℃βLG-EGCG圆二色光谱的二级结构分析结果
由图15和图16所示，当pH为2时，预热处理后，复合产物比未预热处理的复合产物的α螺旋大量增加，β折叠大量减少，无规则卷曲略有增加。
由图17和图18所示，当pH为4.5时，预热处理后，复合产物比未预热处理的复合产物的α螺旋减少，β折叠增加，无规则卷曲略有减少。
由图19和图20所示，当pH为6.4时，预热处理后，复合产物比未预热处理的复合产物的α螺旋略有减少，β折叠减少，无规则卷曲略有减少。
由图21和图22所示，当pH为10时，预热处理后，复合产物比未预热处理的复合产物的α螺旋大量增加，β折叠大量减少，无规则卷曲略有增加。
由上述光谱学数据分析结果可知，经过预热处理后蛋白构象发生巨大改变，且当环境pH为2或10时，二级结构的变化程度最大。可能是因为此时蛋白质处于单体状态，二级结构更容易被改变。pH为6.4时，二级结构结构的变化最小。可能是因为此时蛋白质处于二聚体状态，二级结构较不容易被改变。当pH为4.5时，二级结构的变化程度也较大。可能是因为此时的八聚体状态下，二级结构因为某种作用力容易被发生改变。
至此，预热处理的二级结构的变化程度和免疫反应性变化程度成反比，可能由于二级结构变化大了以后，蛋白结构趋于紧凑，使原处于内部疏水基团不外露。由于蛋白在热变性过程中蛋白构象变化十分复杂，还有待于进一步研究。
4结论
获得了亲和纯化的多克隆抗体。
βLG预热处理后与EGCG结合，其结合能力增强，蛋白免疫反应性的降低程度大于单一的热处理蛋白。
在pH为6.4时，βLG-EGCG免疫反应性降低最为明显，βLG预热处理后与EGCG结合产物更能降低免疫反应性，即变化最大，圆二色光谱显示其二级结构变化最小。可能是因为加热后二聚体的存在形式更能让βLG与EGCG结合。
在pH为4.5时，βLG-EGCG免疫反应性降低程度中等，βLG预热处理后与EGCG结合产物更能降低免疫反应性，即变化中等，圆二色光谱显示其二级结构变化中等。可能是因为加热后八聚体的存在形式能让βLG与EGCG结合，但效果中等。
在pH为2和10时，βLG-EGCG免疫反应性降低程度最小，βLG预热处理后与EGCG结合产物更能降低免疫反应性，但变化最小，圆二色光谱显示其二级结构变化最大。可能是因为加热后二聚体的存在形式更能让βLG与EGCG结合，效果相对而言最不理想。
在pH为2～6.4时，随着pH的增加，βLG构象膨胀，有很多表位点暴露出来，因而使得免疫反应性逐渐减低。但当pH过高时，很多表位点暴露出来的同时，也有很多表位点被遮蔽，所以免疫反应性不如pH较低时的产物。
总之，本研究建立了一个主要的奶变应原βLG检测了一系列的方法来填补的牛的检测牛奶过敏原的空白。通过探索的主要活性成分βLG变化同时结合多酚后的免疫反应变化的机理，将提供新的思路和低过敏性的乳制品发展的理论支持。

Claims (6)

1.一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于在pH2-10条件下，将βLG和EGCG结合。
2.如权利要求1所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于βLG在温度120℃预热后，在pH2-10下将βLG和EGCG结合。
3.如权利要求1所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于用pH为2-10的PBS溶剂，将βLG稀释为1%，再与摩尔比为1：50的EGCG在25℃下水浴1h。
4.如权利要求1所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于用pH为2-10的PBS溶剂，将βLG稀释为1%，在120℃下油浴10min，再与摩尔比为1：50的EGCG在25℃下水浴1h。
5.如权利要求1或2或3或4所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于pH为4.5-6.4。
6.如权利要求1或2或3或4所述的一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法，其特征在于βLG和EGCG结合后在4℃下用5kDa半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
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CN111772198A (zh) * 2020-07-14 2020-10-16 东莞石龙津威饮料食品有限公司 一种复合牛乳蛋白组合物及其制备方法和应用

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